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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se describe un protocolo para la visualización de exocitosis de la insulina en los islotes intactos usando pHluorin, una proteína verde fluorescente sensible al pH. Islotes aislados están infectados con adenovirus codificación pHluorin acoplado al carga vesícula del neuropéptido Y. Esto permite la detección de eventos de fusión de gránulos de insulina mediante microscopía confocal.

Resumen

La secreción de insulina juega un papel central en la homeostasis de la glucosa bajo condiciones fisiológicas normales, así como en la enfermedad. Enfoques actuales para el estudio de exocitosis de gránulos de insulina utilice electrofisiología o microscopía juntada a la expresión de reporteros fluorescentes. Sin embargo la mayoría de estas técnicas se han optimizado para líneas celulares clonales o requiere disociar islotes pancreáticos. En contraste, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real de la exocitosis de gránulos de insulina en los islotes pancreáticos intactos. En este protocolo se describe primero la infección viral de los islotes pancreáticos aislados con adenovirus que codifica una pH-sensible a la proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada al neuropéptido Y (NPY). En segundo lugar, describimos el confocal de imágenes de islotes cinco días después de la infección viral y cómo controlar la secreción de gránulos de insulina. Brevemente, los islotes infectados se colocan sobre un cubreobjetos sobre una cámara de proyección de imagen y reflejados en un microscopio confocal vertical escaneo láser mientras que continuamente siendo perfundidos con solución extracelular que contiene varios estímulos. Se adquieren imágenes confocales, que abarca 50 μm del islote como grabaciones time-lapse utilizando un escáner rápido resonante. La fusión de gránulos de insulina con la membrana plasmática puede ser seguida en el tiempo. Este procedimiento también permite probar una batería de estímulos en un solo experimento es compatible con ratón e islotes humanos y puede ser combinado con diversos colorantes para proyección de imagen funcional (por ejemplo, tintes de calcio citosólico o potencial de membrana).

Introducción

Insulina es producida por las células beta del islote pancreático y es un regulador clave del metabolismo de glucosa1. Muerte o disfunción de las células beta perturba la homeostasis de la glucosa y conduce a la diabetes2. Insulina está lleno de gránulos de núcleo denso que se liberan en un Ca2 +-dependiente de la forma3. Dilucidar cómo se regulación la exocitosis de gránulos de insulina es esencial para comprender plenamente lo que determina la secreción de insulina y abre nuevas vías para la identificación de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes.

Exocitosis de insulina ha sido extensamente estudiada con métodos electrofisiológicos, como mediciones de capacitancia de la membrana y los enfoques microscópicos en combinación con moléculas fluorescentes. Mediciones de capacitancia de membrana tienen buena resolución temporal y permitan grabaciones unicelular. Sin embargo, cambios en la capacidad de reflejar el cambio neto de la superficie de la célula y capturar eventos de fusión individuales ni distinguir fusión de gránulos de insulina de otras vesículas secretoras de insulina no3. Enfoques microscópicos, tales como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total o de dos fotones en combinación con sondas fluorescentes y vesícula carga proteínas, proporcionan detalles adicionales. Estas técnicas de capturan eventos exocitóticas simples y también las etapas pre- y post-exocitóticas y pueden ser utilizadas para estudiar los patrones exocitóticas en poblaciones de células3.

Reporteros fluorescentes pueden ser de tres tipos: 1) extracelular, 2) citoplasmática o 3) vesicular. 1) periodistas extracelulares son trazadores polar (por ejemplo, dextranos, sulforodamina B (SRB), lucifer amarillo, pyranine) que pueden ser introducidos a través del medio extracelular4. El uso de trazadores polar permite la investigación de la fusión del poro en una población de células y captura varias estructuras intercelulares como los vasos sanguíneos. Sin embargo, no informan sobre el comportamiento de carga de vesícula. 2) citoplasmáticas reporteros son sondas fluorescentes acopladas a las proteínas asociadas a membrana que cara el citoplasma y están involucradas en la exocitosis y acoplamiento. Ejemplos incluyen a los miembros de la soluble N- etilmaleimida sensible factor accesorio receptor (trampa) familia de proteínas que se han utilizado con éxito en Neurociencia para el estudio de la liberación de neurotransmisor5. Estas proteínas tienen múltiples socios de enlace y no son insulina-gránulo específico. 3) vesiculares reporteros son sondas fluorescentes fusionadas a proteínas de carga vesicular que permiten la investigación del comportamiento de la carga específica de vesícula. Las proteínas de carga específica de gránulos de insulina incluyen insulina, péptido c, polipéptido amiloideo del islote y NPY entre otros6,7. NPY sólo está presente en que contiene gránulos de insulina y se lanza conjuntamente con la insulina, lo que es un excelente socio para un reportero fluorescente8.

La fusión de diferentes proteínas fluorescentes a NPY ha sido empleada anteriormente para estudiar diversos aspectos de la exocitosis en las células neuroendocrinas, como el requisito del específico synaptotagmin isoformas9,10 y cómo curso del tiempo de lanzamiento depende en el citoesqueleto de actina y miosina II11,12. En este estudio, hemos elegido pHluorin como el reportero fluorescente, que es un GFP modificado que no fluorescente en el pH ácido dentro de núcleo denso gránulos pero se convierte en brillante fluorescente a la exposición al pH extracelular neutro13. Gránulos de insulina madura tienen un pH ácido por debajo de 5.5. Una vez que el gránulo se fusiona con la membrana plasmática y se abre, su carga está expuesta al neutral pH extracelular de 7.4, permitiendo el uso de la pHluorin de proteínas sensibles al pH como un reportero de7,14.

Debido a la naturaleza sensible de pH de pHluorin y la expresión selectiva de NPY en gránulos de insulina, puede utilizarse el concepto de fusión de NPY-pHluorin para el estudio de diversas propiedades de la exocitosis de gránulos de insulina. Viral la fusión construcción garantiza la eficacia de transfección alta y trabaja en primaria de las células beta o líneas celulares, así como en islotes aislados. Este método también puede utilizarse como una guía para el estudio de exocitosis en cualquier otro tipo de célula con las vesículas que contienen NPY. También se puede combinar con cualquier modelo de ratón transgénico para estudiar efectos de determinadas condiciones (caídas, sobreexpresión, etc.) en la exocitosis. Esta técnica se ha utilizado anteriormente para caracterizar patrones espaciales y temporales de la secreción de gránulos de insulina en poblaciones de células beta en islotes humanos15.

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Protocolo

el Comité de ética animal de la Universidad de Miami ha aprobado todos los experimentos.

1. viral infección intacto aislados humanos o islotes pancreáticos de ratón

  1. cultura del islote: preparar los medios de cultivo de islotes pancreáticos: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% FBS (v/v) y 2 mM L-glutamina. Islotes pancreáticos
    1. humanos se obtienen del programa integrado de distribución de islote (NIDDK, NIH). A su llegada, transferencia de los islotes (~ 500 equivalentes del islote) para 35 mm no-cultivo de tejidos tratados Petri con medios de cultivo CMRL de 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 durante 24 h antes de la infección viral.
    2. Ratón islotes pancreáticos pueden ser aislados siguiendo protocolos previamente establecidos 16. Tras aislamiento, de la cultura ~ 200 equivalentes de islote en 35 mm no-cultivo de tejidos trataron Petri con medios de cultivo CMRL de 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 durante 24 h antes de la infección viral.
      Nota: Evite el uso de ratones transgénicos con GFP o YFP periodistas expresadas en islotes para evitar superposición de fluorescencia con NPY-pHluorin.
  2. Preparación de virus
    Nota: la fusión de NPY-pHluorin fue clonada en el vector pcDNA3 del 10 y subcloned en un vector adenoviral para la producción de adenoviral [adenovirus serotipo 5 (DE1/E3)] por un adenovirus recombinante empresa de fabricación. El virus fue alícuotas y almacenados a-80 ° C. La acción viral es proporcionada por la compañía a concentraciones de 10 12 10 13 partículas virales (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. Para la infección en vitro islote, uso 10 6 PFU/mL, dando como resultado una aproximado multiplicidad de infección (MOI) de alrededor de 2 (véase la discusión para más detalles)
  3. Infección viral de los islotes pancreáticos
    Atención: Trabajar con adenovirus requiere certificación y procedimientos de bioseguridad nivel 2 (BSL2). Consulte con el oficial de seguridad de la biotecnología institucional de orientación y formación sobre procedimientos BSL2.
    1. Preparar humanos/ratón islotes como se describe arriba.
    2. Añadir 5-10 μl de virus comunes a cada plato de Petri de 35 mm que contiene islotes de humano/ratón en 2 mL CMRL de medios de cultivo (con 10% FBS y 2 mM L-glutamina).
      Nota: Ajuste el volumen del virus utilizado según el título viral proporcionado por la hoja de datos de la empresa.
    3. Los islotes en que contiene el virus de la cultura media de 37 °C/5% CO 2 para 24 h.
    4. Después de 24 h, aspirar los medios de comunicación que contiene el virus y reemplazar con medios de cultivo 2 mL CMRL (con 10% FBS y 2 mM L-glutamina).
    5. De la cultura los islotes para 4-6 días a 37 °C/5% CO 2, reemplazando a los medios de comunicación cada 3 días.
    6. Después de 4 - 6 días de cultivo, espera alrededor 30% de células del islote infectado. Islotes de entonces pueden ser utilizados para experimentos de imagen vivo.

2. Confocal de imágenes de infectados islotes

Nota: Consulte la Tabla de materiales para los materiales y equipos necesarios para la proyección de imagen confocal.

  1. Reactivo de preparación y disposición experimental
    1. preparan la solución extracelular: Añadir 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, BSA 0,1%, pH 7,4, estéril filtrada.
      Nota: Esta memoria intermedia se prepara normalmente sin glucosa y puede conservarse a 4 ° C hasta 1 mes. Se añade glucosa el día del experimento para alcanzar la concentración final deseada.
      1. Medio de glucosa basal (3 mM) preparación: Añadir 75 μl del stock de glucosa de 2 M a 50 mL de la solución extracelular.
      2. Hyperglycemic (16 mM) medio: Añadir 400 μL de caldo de glucosa de 2 M a 50 mL de la solución extracelular
    2. Diluir cualquier estímulo adicional (p. ej., KCl o trifosfato de adenosina (ATP)) en la solución extracelular que contiene glucosa 3 mM.
    3. Antes de comenzar un experimento, use el cubreobjetos con poly-D-lisina por añadir 30 μl de solución de poly-D-lisina (1 mg/mL) al cubreobjetos para 1 h y aclarándolo bien con H 2 O.
      Nota: El cubreobjetos recubierto de poli-lisina pueden almacenarse a temperatura ambiente hasta 6 meses.
    4. Al menos 1 h antes del experimento, usando una pipeta de 1 mL, transferir los islotes a un plato de Petri de 35 mm que contiene la solución extracelular con 3 mM de glucosa. Mantener los islotes a 37 ° C y 5% CO 2.
      Nota: Si es necesario, la membrana plasmática pueden ser etiquetada en este paso. Para la etiqueta de la membrana plasmática, añadir colorante de di-8-ANEPP de 2 μm a la solución extracelular con 3 mM de glucosa. Incubar los islotes en la solución colorante por 1 h a 37 °C/5% CO 2. El tinte de la membrana plasmática puede ser excitado a 488 nm y detectado a 620 nm.
    5. minutos antes de comenzar un experimento, colocar el cubreobjetos a la cámara de proyección de imagen sellando con grasa de silicona vacío. Fijar la cámara a la plataforma de proyección de imagen de imagen. Mediante una pipeta, coloque 20-30 islotes en la zona de poly-D-lisina-tratado del cubreobjetos y dejar que los islotes se adhieren a la superficie durante 20 min
      Nota: Es importante para que el cubreobjetos secar completamente para evitar el daño del islote no.
    6. Mientras que los islotes están adhiriendo a lo cubreobjetos, preparar el sistema de perfusión, aclarándolo bien con agua. Añadir a cada solución a un canal diferente: 3 mM de glucosa (canal 1), 16 mM de glucosa (canal 2), 16 mM de glucosa con 100 μm 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y la forskoline 10 μm (canal 3), 25 mM KCl en 3 mM de glucosa (canal 4), 10 μm ATP en 3 mM glucosa ( canal 5). Eliminar todas las burbujas del sistema, abrir cada canal por separado y permitiendo que el flujo de la solución durante unos minutos y asegúrese de que el flujo es constante (0.5 mL/min) y la tubería tiene fugas no.
    7. Conectar el calentador de línea única solución al tubo de salida de perfusión y ajustar la temperatura del búfer desbordado a 37 ° C.
    8. Preparar la bomba de succión. Eliminar todas las burbujas del sistema y asegúrese de que el flujo es constante y la tubería no tiene fugas.
    9. Una vez que los islotes se adhieren a la superficie del cubreobjetos, suavemente llenan la sala de proyección de imagen la solución extracelular que contiene 3 mM de glucosa. Evite lavar los islotes de la superficie del cubreobjetos.
    10. Colocar la plataforma de proyección de imagen con los islotes en la platina del microscopio y conectar al sistema de perfusión y la succión de la bomba.
    11. Vuelta en el flujo y constantemente inundar los islotes con la solución extracelular 3G. El sistema está ahora listo para la proyección de imagen confocal.
  2. Proyección de imagen confocal
    1. Localice los islotes en el campo del microscopio con la ampliación baja. Una vez centrado en los islotes, cambiar objetivos aumento mayor (por ejemplo, el objetivo de inmersión de agua X 63 (63 X / 0.9 NA)).
    2. Abrir la adquisición utilizando el software (Tabla de materiales) y activar el modo de escáner resonante.
    3. Seleccionar el modo imagen XYZT y configurar los parámetros de adquisición de la siguiente manera:
      1. gire sobre el argón láser y el láser de 488 nm línea y ajustar la potencia del láser al 50% para la excitación de la pHluorin.
      2. Recoger la emisión en el 505-555 nm.
      3. Elegir una resolución de 512 x 512 píxeles. Prensa el " Live " botón para iniciar la proyección de imagen y ajustar los niveles de ganancia (ganancia típica es alrededor de 600 V).
      4. Establecer el begin y end de la z-pila: centrarse en la parte superior de la isla y elija " empezar " y mover hasta el último plano que puede ser enfocado y elegir " final ". Utilice un tamaño de paso z de 5 μm. El software automáticamente calcula el número de aviones confocales.
      5. Establecer el intervalo de tiempo para la adquisición de cada pila de z cerca de 1.5-2 s y elegir la opción " adquirir hasta " para la proyección de imagen continua.
      6. Prensa del " Inicio " botón para initialize.
    4. Utilizar varios protocolos de estimulación para inducir la exocitosis de gránulos por perfundiendo los islotes con los estímulos deseados. Protocolos de estimulación pueden personalizarse para adaptarse a la finalidad científica deseada (véase abajo).
  3. Protocolos de estimulación
    Nota: en cada protocolo de estimulación, empezar por grabar al menos 2 minutos de la actividad de fondo del islote durante perfusión constante con solución extracelular que contiene 3 mM de glucosa. Perfusión con un estimulante para el período de tiempo. La orden de estimulantes, duración del estímulo, así como duración de las grabaciones se pueden personalizar para adaptarse a los fines científicos deseados. Asegúrese de lavar a fondo con solución extracelular que contiene glucosa 3 mM antes de comenzar un nuevo estímulo islotes. A continuación ofrecemos los protocolos de estimulación de muestra que se han utilizado para demostrar las capacidades del método.
    1. Estimular con cloruro de amonio (NH 4 Cl) como control positivo para la pHluorin pH sensibilidad y eficiencia de la infección viral ( figura 3): 3 mM de glucosa (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) de 3 mM de glucosa → 3 mM de glucosa (2 min)
      Nota: en el NH 4 Cl solución, sustituir NaCl en forma equimolar.
    2. Estimular exocitosis de gránulos de insulina por aumento de la concentración de glucosa ( figura 5 y figura 6): glucosa (2 min) de 3 mM → 16 mM de glucosa (15-30 min) → 3 mM de glucosa (2 min
      Nota: Para poder ver varias ráfagas de actividad, inundar los islotes continuamente con la solución de 16 G por lo menos 15 minutos
      Nota: Para aumentar la consistencia de las respuestas secretoras 17, los usuarios pueden agregar a agentes de campo de sensibilización (IBMX de 100 μm y 10 μm forskoline) soluciones el 3 G y 16 G. Esto no cambia los patrones temporales de la secreción de gránulos. Para más detalles consulte el 15 y el debate.

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Resultados

El flujo de trabajo de la técnica se muestra en la figura 1. Brevemente, ratón o islotes humanos pueden ser infectados con adenovirus codificación NPY-pHluorin y reflejadas, después de pocos días en la cultura, bajo el microscopio confocal. Como gránulos se fusionan con la membrana plasmática y abierto, un aumento en fluorescencia se observa y se puede cuantificar (figura 1). Para determinar si NPY-pHluorin es una herramie...

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Discusión

Este manuscrito describe una técnica que puede utilizarse para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en las células beta en islotes pancreáticos intactos por microscopia confocal. Utiliza el NPY-pHluorin como el reportero fluorescente clonado en adenovirus para asegurar una eficacia de transfección alta.

Aunque el método era muy eficiente en nuestras manos, pueden requerir algunas modificaciones que dependen fundamentalmente de dos parámetros: 1) la calidad de la preparación...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Marcia Boulina de DRI de instalaciones centrales para obtener ayuda con los microscopios. Este trabajo fue financiado por los NIH becas 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, ES025673 R33 y R56 DK084321 (CA).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Upright laser-scanning confocal microscopeLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS-SP5includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamberWarner instrumentsRC-26
Imaging chamber platformWarner instrumentsPH-1
22 x 40 glass coverslipsDaiggerbrandG15972H
Vacuum silicone greaseSigmaZ273554-1EA
Multichannel perfusion systemWarner instrumentsVC-8
Single inline solution heaterWarner instrumentsSH-27B
Temperature controllerWarner instrumentsTC-324C
Peristaltic Suction pumpPharmaciaP-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treatedVWR10861-586
CMRL Medium, no glutamineThermoFisher11530037
FBS, heat inactivatedThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl solutionSigmaS5150
3 M KCl solutionSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
1 M HEPES solutionSigmaH0887
Vacuum filterVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917

Referencias

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