Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

요약

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

초록

인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.

서문

인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사¹의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병²리드. 인슐린은 캘리포니아^{2 +}에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식³. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.

인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포³에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등 미세한 방법을 추가 정보를 제공합니다. 이러한 기술은 단일 exocytotic 이벤트 및 사전 및 사후 exocytotic 단계를 캡처하고 셀³의 인구에 있는 exocytotic 패턴을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.

형광 기자 세 가지 유형의 수: 1) extracellular, 2) 세포질, 또는 3) 나노미터. 1) extracellular 기자는 extracellular 환경⁴를 통해 소개 될 수 있는 폴라 추적기 (예를 들어, dextrans, sulforhodamine B (연료 부스터), 루시퍼 노란색, pyranine). 폴라 추적기를 사용 하 여 셀의 인구에는 퓨전의 조사 가능 하며 혈관 등 다양 한 세포 구조를 캡처합니다. 그러나, 그들은 소포 화물 동작에 보고 하지 않습니다. 2) 세포질 기자는 세포질 얼굴과 도킹 및 exocytosis에 참여 막 관련 단백질에 결합 하는 형광 프로브. 예는 신경 전달 물질 방출⁵공부에 대 한 신경 과학에서 성공적으로 사용 된 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (무) 가족 구성원을 포함 합니다. 이러한 여러 바인딩 파트너는 단백질과 인슐린과 립 하지 않습니다 특정. 3) 기공을 기자는 화물 전용 기 행동의 조사에 대 한 허용 하는 기공을 화물 단백질을 융합 하는 형광 프로브. 인슐린과 립 특정 화물 단백질 등이 인슐린, c-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티 NPY 등^6,7. NPY는 인슐린과 립, 포함에 이며 공동 출시, 인슐린과 형광 기자⁸에 대 한 우수한 파트너 만들기.

Exocytosis 신경 내 분 비 세포, 특정 synaptotagmin isoforms^9,10 의 요구 등의 다양 한 측면을 연구 NPY 다른 형광 단백질의 융합 이전 고용 방법 방출의 시간-과정에 따라 다릅니다 말라 골격 myosin II^11,12. 이 연구에서 우리는 비 형광은 수정 된 GFP가 형광 기자로 pHluorin를 선택 고밀도 코어 내부 산 성 pH에서과 립 하지만 된다 중립 extracellular pH¹³에 노출 되 면 밝은 형광. 성숙한 인슐린과 립 산 성 pH를 5.5 아래 있다. 일단은 립 원형질 막 및 열립니다 퓨즈, 그것의 화물 수 기자로 서 pH에 민감한 단백질 pHluorin 사용 하 여^7,147.4의 extracellular 중립 pH에 노출 됩니다.

PH 민감한 성격의 pHluorin 그리고 인슐린과 립에 있는 NPY의 선택적 식에 비추어 NPY pHluorin 퓨전 구문 인슐린과 립 exocytosis의 다양 한 속성을 공부를 사용할 수 있습니다. 융해 구성의 바이러스 배달 높은 transfection 효율을 보장 하 고 고립 된 섬에 뿐만 아니라 기본 베타 셀 또는 셀 라인에 작동 합니다. 이 방법은 exocytosis NPY 포함 된 소포와 다른 세포 유형에서 공부에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 exocytosis에 어떤 유전자 변형 마우스 모델 연구 특정 조건 (knockdowns, overexpression, 등)의 효과를 결합할 수 있습니다. 이 기술은 이전 인간의 독도¹⁵베타 세포 인구에서 인슐린과 립 분 비의 공간 및 시간 패턴을 특성화 하기 위해 사용 되었습니다.

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프로토콜

마이애미 대학의 동물 윤리 위원회는 모든 실험을 승인 했습니다.

1. 바이러스 성 감염의 그대로 고립 된 인간 또는 마우스 췌 장 독도

1. 섬 문화: 섬 문화 미디어 준비: Connaught 의료 연구 실험실 (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS 및 2 m L-글루타민.
   1. 인간 췌 장 독도 통합 섬 배포 프로그램 (NIDDK, NIH)에서 얻을 수 있습니다. 도착 시 전송는 독도 (~ 500 섬 등가물) 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO ₂ /O ₂ 접시.
   2. 마우스 췌 장 독도 이전 설립된 프로토콜 ¹⁶ 다음 격리 될 수 있습니다. 절연, 다음 문화 ~ 200 섬 등가물에 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO ₂ /O ₂ 접시.
      참고: NPY pHluorin와 형광 중복을 피하기 위해 독도 GFP 또는 YFP 기자 들과 유전자 변형 마우스를 사용 하지 마십시오.
2. 바이러스 준비
   참고: NPY pHluorin 퓨전 pcDNA3 벡터 ¹⁰으로 복제 되었고 adenoviral 생산 adenoviral vector에 subcloned [아 데 노비 루스 serotype 5 (DE1/E3)] 재조합 아 데 노 바이러스에 의해 제조 회사입니다. 바이러스는 aliquoted 및-80 ° c.에 저장 바이러스 성 재고 10 titers에서 회사에 의해 제공 됩니다 ¹² 10 ¹³ 바이러스 성 입자 (~ 3 × 10 ¹⁰-3 x 10 ¹¹ PFU).
   1. 에 대 한 생체 외에서 섬, 사용 10 ⁶ PFU/mL, 감염 (MOI)의 대략적인 다양성의 약 2 (자세한 토론 참조) 결과
3. 췌 장 독도의 바이러스 성 감염
   주의: 작업 adenoviruses Biosafety 수준 2 (BSL2) 절차와 인증을 요구 한다. 지도와 BSL2 절차에 대 한 교육 기관 Biosafety 장교와 확인 하십시오.
   1. 위에서 설명한 대로 인간/마우스 독도 준비.
   2. 추가 5-10 µ L 재고 바이러스의 인간/마우스 독도 CMRL 문화 미디어의 (10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL에 포함 된 각 35 mm 페 트리 접시.
      참고: 바이러스 titer에 따라 사용 하는 회사 데이터 시트에서 제공 하는 바이러스의 볼륨 조절.
   3. 포함 하는 바이러스에서 독도 문화 24 h. 위해 37 °C/5% CO ₂ 미디어
   4. 후 24 h 발음 바이러스 포함 된 미디어 및 (와 함께 10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL CMRL 문화 미디어 바꿉니다.
   5. 4-6 일 37 °C/5% CO ₂, 대체 미디어 매 3 일에는 독도 문화.
   6. 후 4-6 일 경작의 기대 주위 감염 되는 작은 섬 세포의 30%. 독도 라이브 이미징 실험에 사용할 수 있습니다.

2. Confocal 이미징의 감염 독도

참고: confocal 영상에 필요한 장비와 재료에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.

1. 시 약 준비 및 실험적인 체제
   1. 준비 extracellular 솔루션: pH 7.4, 살 균 필터링 추가 125 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 2.56 m m CaCl ₂, 1 mM MgCl ₂, 25mm HEPES, 0.1 %BSA.
      참고:이 버퍼는 일반적으로 포도 당 없이 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 포도 당 원하는 최종 농도 도달 하는 실험의 날에 추가 됩니다.
      1. 준비 기저 포도 (3mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 75 µ L을 추가.
      2. Hyperglycemic (16mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 400 µ L를 추가
   2. 3mm 포도 당을 포함 하는 extracellular 해결책에 어떤 추가 자극 (예를 들어, KCl 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)) 희석.
   3. 실험을 시작 하기 전에 1 h coverslip를 폴 리-D-리 솔루션 (1 mg/mL)의 30 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 H ₂ o.와 그것을 rinsing 하 여 폴 리-D-리와 coverslips을 pretreat
      참고: 폴 리 코팅 coverslips 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지.
   4. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 실험 하기 전에 적어도 1 시간 35 mm 페 트리 접시 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션을 포함 하는 독도 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO ₂에 독도 유지.
      참고: 필요한 경우, 원형질 막이이 단계에서 표시 수 있습니다. 원형질 막에 레이블을, 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션 2 µ M 디-8-ANEPP 염료를 추가 합니다. 37 °C/5% CO ₂에서 1 시간을 위한 염료 해결책에서 독도 품 어. 488에서 원형질 막 염료를 흥분 수 nm와 620에서 nm.
   5. 분 실험을 시작 하기 전에 부착는 coverslip 이미징 챔버를 진공 실리콘 그리스와 씰링 합니다. 이미징 플랫폼 이미징 챔버를 수정 합니다. 20 분에 대 한 표면에는 독도 준수 coverslip의 폴 리 D Lysine 치료 영역에 20-30 독도 배치를 피 펫을 사용 하 여
      참고: 그것은 중요 coverslip 섬 손상을 피하기 위하여 완전히 건조 하 게 하지 않습니다.
   6. 는 독도 coverslip 준수는 하는 동안 철저 하 게 물으로 헹 궈 서 관류 시스템을 준비 합니다. 다른 채널에 추가 하는 각 솔루션: 3 mM 포도 당 (1 채널), 16 mM 포도 당 (2 채널), 16 mM 포도 당 100 µ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 10 µ M 산림 (채널 3), 3 mM 포도 당 (채널 4), 3 mM 포도 당 (에서 10 µ M ATP에에서 25 m m KCl 채널 5)입니다. 각 채널을 개별적으로 열고 몇 분 동안 솔루션 흐름을 보내는 여 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름 일관 (0.5 mL/min) 이며 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.
   7. 관류 콘센트 튜브에 단일 인라인 솔루션 히터를 연결 하 고 37 outflowing 버퍼의 온도 조정 ° c.
   8. 흡입 펌프를 준비합니다. 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름은 일관 되 고 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.
   9. 는 독도 coverslip 표면에 고착 되 면 부드럽게 채워 이미징 챔버를 3 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션. 독도 coverslip의 표면에서 세척 하지 마십시오.
   10. 현미경 단계에 독도와 이미징 플랫폼을 배치 하 고 관류 시스템 및 흡입 펌프에 연결.
   11. 차례 흐름에 그리고 끊임없이 perfuse 3 세대 extracellular 솔루션 독도. 시스템은 이제 confocal 영상에 대 한 준비.
2. Confocal 영상
   1. 낮은 확대와 함께 현미경 분야에는 독도 찾습니다. 일단는 독도에 초점, 더 높은 확대 목표 전환 (예를 들어, 63 X 물 침수 목표 (63 X / 0.9 없음)).
   2. 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인수를 열고 공명 스캐너 모드 활성화.
   3. XYZT 영상 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성:
      1. 설정에 아르곤 레이저와 488 nm 레이저 라인과 레이저 파워 pHluorin 여기에 대 한 50%를 조정.
      2. 505-555 nm에 방출 수집.
      3. 는 512 x 512 픽셀의 해상도 선택합니다. 보도 " 라이브 " 이미징 시작 (일반적인 이득은 약 600 V) 이득 레벨을 조정할을.
      4. 설정 시작 및 z 스택의 끝:는 섬 위에 집중 하 고 선택 " 시작 " 마지막 집중 될 수 있는 선택 평면 이동 " 끝 ". 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.
      5. 1.5-2 s에 가까운 각 z 스택의 인수에 대 한 시간 간격을 설정 하 고 옵션 선택 " 멈출 때까지 취득 " 연속 이미징.
      6. 보도 " 시작 " ini 버튼tialize.
   4. 다양 한 자극 프로토콜을 사용 하 여 원하는 자극으로 독도 perfusing 하 여과 립 exocytosis를 유도. 자극 프로토콜 원하는 과학적 목적 (아래 참조)에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.
3. 자극 프로토콜
   참고: 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 지속적인 관류 동안 섬 배경 활동의 적어도 2 분을 기록 하 여 시작 하는 모든 자극 프로토콜에서. 원하는 기간에 대 한 자극 제와 perfuse. 각성제의 순서, 자극의 지속 시간 녹음 기간 원하는 과학적 목적에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 새로운 자극을 시작 하기 전에 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 독도 씻어 있는지 확인 하십시오. 아래 샘플 자극 프로토콜 메서드 기능을 보여 주기 위해 사용 되었습니다을 찾아.
   PHluorin pH 감도 및 바이러스 감염 효율 ( 그림 3)에 대 한 긍정적인 제어로 염화 암모늄 (NH ₄ Cl)와
   1. Stimulate: 3 mM 포도 당 (2 분) → 50mm NH ₄ Cl (2 분)에 3 mM 포도 당 → 포도 당 3 m m (2 분)
      참고: NH에서 ₄ Cl 솔루션, 아데닌 기초에 NaCl을 대체.
   2. Stimulate ( 그림 5 및 그림 6) 포도 당 농도 증가 시켜 인슐린과 립 exocytosis: 3 mM 포도 당 (2 분) → 16 m m 포도 당 (15-30 분) → 3 m m 포도 당 (2 분
      참고: 적어도 15 분에 대 한 16 G 솔루션으로 지속적으로 독도 perfuse 활동의 몇몇 파열을 보려면
      참고: 분 비 응답 ¹⁷의 일관성을 증가 하기 위하여 사용자가 3g와 16 G 솔루션 캠프 모금 에이전트 (100 µ M IBMX 및 10 µ M 산림)를 추가할 수 있습니다. 이 립 분 비의 시간적 패턴을 변경 하지 않습니다. 내용은 ¹⁵와 토론을 참조 하십시오.

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결과

기술의 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 간단히, 마우스 또는 인간의 독도 수 NPY pHluorin 인코딩 하는 아 데 노 바이러스에 감염 되며 문화, confocal 현미경 아래에서 몇 일 후 몇 군데. 과 립 원형질 막 및 오픈 퓨즈, 형광 증가 관찰 고 측정할 수 있습니다 (그림 1). NPY pHluorin 실제로 인슐린과 립 역학을 모니터링 하는 데 적합 ?...

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토론

이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.

방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Upright laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS-SP5	includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamber	Warner instruments	RC-26
Imaging chamber platform	Warner instruments	PH-1
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA
Multichannel perfusion system	Warner instruments	VC-8
Single inline solution heater	Warner instruments	SH-27B
Temperature controller	Warner instruments	TC-324C
Peristaltic Suction pump	Pharmacia	P-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treated	VWR	10861-586
CMRL Medium, no glutamine	ThermoFisher	11530037
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
3 M KCl solution	Sigma	60135
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
Vacuum filter	VWR	431098
D-Glucose	Sigma	G8270
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-aldrich	P6407
Di-8-ANNEP	ThermoFisher	D3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I5879
Forskolin	Sigma	F3917