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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per la visualizzazione di esocitosi di insulina in isolotti intatti usando pHluorin, una proteina fluorescente verde sensibili al pH. Gli isolotti isolati sono infettati con l'adenovirus codifica pHluorin accoppiato per il vescicola carico neuropeptide Y. Questo consente il rilevamento degli eventi di fusione granello dell'insulina mediante microscopia confocale.

Abstract

La secrezione dell'insulina svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del glucosio in condizioni fisiologiche normali così come nella malattia. Attuali approcci per lo studio di esocitosi di granuli di insulina che utilizzare elettrofisiologia o microscopia accoppiato all'espressione di reporter fluorescenti. Tuttavia la maggior parte di queste tecniche sono stata ottimizzata per linee cellulari clonale o richiedono dissociando isolotti pancreatici. Al contrario, il metodo presentato qui consente per la visualizzazione in tempo reale di esocitosi di granuli dell'insulina in isolotti pancreatici intatti. In questo protocollo, descriviamo in primo luogo l'infezione virale di isolotti pancreatici isolati con l'adenovirus che codifica una pH sensibili proteina fluorescente verde (GFP), pHluorin, accoppiata al neuropeptide Y (NPY). In secondo luogo, descriviamo la rappresentazione confocale di isolotti di cinque giorni dopo l'infezione virale e come monitorare la secrezione di granuli di insulina. Brevemente, gli isolotti infetti sono collocati su un vetrino coprioggetto su una camera di imaging e imaged sotto un microscopio confocale laser-scanner verticale pur essendo continuamente irrorati con soluzione extracellulare contenente vari stimoli. Immagini confocal spanning 50 µm dell'isolotto sono acquisiti come Time-lapse registrazioni usando uno scanner veloce-risonante. La fusione dei granuli di insulina con la membrana plasmatica può essere seguita nel tempo. Questa procedura permette di testare una batteria di stimoli in un singolo esperimento è compatibile con sia il mouse che isolotti umani e possa essere combinata con vari coloranti per l'imaging funzionale (ad es., coloranti di calcio citosolico o potenziale di membrana).

Introduzione

L'insulina è prodotta dalle cellule beta delle isole pancreatiche ed è un regolatore chiave di glucosio metabolismo1. Morte o disfunzione delle cellule beta disturba l'omeostasi del glucosio e porta a diabete2. L'insulina è confezionato in granelli del denso-centro che vengono rilasciati in Ca2 +-modo dipendente3. Delucidamento com'è regolata la esocitosi di granuli di insulina è essenziale per comprendere appieno ciò che determina la secrezione di insulina e apre nuove strade per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento del diabete.

Esocitosi di insulina è stato studiato estesamente utilizzando approcci elettrofisiologici, come le misure di capacità di membrana e approcci al microscopio in combinazione con molecole fluorescenti. Misure di capacità di membrana hanno una buona risoluzione temporale e consentono registrazioni singola cella. Tuttavia, variazioni della capacità riflettono il netto cambiamento di superficie della cella e non acquisire gli eventi di fusione individuale o distinguere fusione di granello di insulina da altre vescicole secretorie non insulino-3. Approcci al microscopio, come microscopia di fluorescenza (TIRF) di riflessione interna totale o due fotoni in combinazione con sonde fluorescenti e proteine cargo della vescicola, forniscono ulteriori dettagli. Queste tecniche catturano singoli eventi esocitotico e anche le fasi pre- e post-esocitotico e possono essere utilizzate per studiare i modelli esocitotico in popolazioni di cellule3.

Reporter fluorescenti possono essere di tre tipi: 1) extracellulare, 2) citoplasmatici o 3) vescicolare. 1) extracellulare reporter sono elementi traccianti polari (ad es., destrani, solforodamina B (SRB), Lucifero giallo, pyranine) che possono essere introdotto attraverso l' ambiente extracellulare4. L'impiego di traccianti polari consente per l'indagine del poro di fusione in una popolazione delle cellule e cattura varie strutture intercellulari quali i vasi sanguigni. Tuttavia, non segnalano il comportamento del carico della vescicola. 2) citoplasmiche reporter sono sonde fluorescenti accoppiati a proteine di membrana-collegato che affrontano il citoplasma e sono coinvolte nella docking station ed esocitosi. Esempi includono i membri della famiglia di solubile N- ethylmaleimide-sensibile fattore allegato proteina recettore (rullante) che sono stati utilizzati con successo in Neuroscienze per lo studio del neurotrasmettitore release5. Tali proteine hanno più partner di legame e non insulina-granuli specifici. 3) vescicolare reporter sono sonde fluorescenti fuse a proteine cargo vescicolare che permettono per l'indagine del comportamento di carico specifico della vescicola. Insulina-granello carico specifiche proteine includono insulina, c-peptide, polipeptide amiloide dell'isolotto e NPY tra gli altri6,7. NPY è presente solo in insulina contenente granuli ed è co-pubblicato con l'insulina, che lo rende un ottimo partner per un reporter fluorescente8.

La fusione di diverse proteine fluorescenti di NPY è stato precedentemente impiegata per studiare vari aspetti dell'esocitosi in cellule neuroendocrine, quali il requisito di synaptotagmin specifiche isoforme9,10 e come la corso di tempo di rilascio dipende dal citoscheletro di actina e miosina II11,12. In questo studio, abbiamo scelto pHluorin come il reporter fluorescente, che è un GFP modificate che è non fluorescente a pH acido all'interno del nucleo denso granuli ma diventa brillantemente fluorescente sopra l'esposizione al pH neutro extracellulare13. Granuli di insulina matura hanno un pH acido inferiore a 5.5. Una volta che il granello si fonde con la membrana plasmatica e si apre, il carico è esposto al pH neutro extracellulare di 7,4, che consente di utilizzare il pHluorin di proteine pH sensibili come reporter7,14.

In considerazione della natura sensibile del pH di pHluorin e l'espressione selettiva di NPY nei granuli di insulina, il costrutto di fusione di NPY-pHluorin consente di studiare le varie proprietà di esocitosi di granuli di insulina. La consegna virale del costrutto fusione assicura efficienza di trasfezione alta e lavora sul primarie beta cellule o linee cellulari e isolotti isolati. Questo metodo utilizzabile anche come linea guida per lo studio di esocitosi in qualsiasi altro tipo di cellula con vescicole contenenti NPY. Può anche essere combinato con qualsiasi modello di topo transgenico per studiare gli effetti di determinate condizioni (atterramenti, sovraespressione, ecc.) su esocitosi. Questa tecnica è stato precedentemente utilizzata per caratterizzare i modelli spaziali e temporali del granello della secrezione dell'insulina in popolazioni di cellule beta in isolotti umani15.

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Protocollo

il Comitato di etica animale dell'Università di Miami ha approvato tutti gli esperimenti.

1. virale infezione di intatto isolato umano o isolotti pancreatici del topo

  1. cultura dell'isolotto: preparare il terreno di coltura dell'isolotto: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS e 2 mM L-glutammina.
    1. Umani di isole pancreatiche sono ottenuti dal programma di distribuzione integrata per isolotto (NIDDK, NIH). All'arrivo, trasferimento gli isolotti (~ 500 equivalenti di isolotto) a 35 mm non-tessuto cultura trattati Petri con terreni di coltura CMRL 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 per 24 h prima dell'infezione virale.
    2. Mouse isolotti pancreatici possono essere isolati seguendo protocolli precedentemente stabiliti 16. A seguito di isolamento, cultura ~ 200 equivalenti di isolotto in 35 mm non-tessuto cultura trattati Petri con terreni di coltura CMRL 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 per 24 h prima dell'infezione virale.
      Nota: Evitare l'uso di topi transgenici con reporter GFP o YFP espresso sugli isolotti per evitare la sovrapposizione di fluorescenza con NPY-pHluorin.
  2. Preparazione di virus
    Nota: la fusione di NPY-pHluorin è stata clonata nel vettore pcDNA3 10 e subclonata in un vettore adenovirale per produzione adenoviral [dell'adenovirus sierotipo 5 (DE1/E3)] da un adenovirus ricombinante società di produzione. Il virus è stato aliquotati e conservati a-80 ° C. Lo stock virale è fornito dalla società a titoli di 10 12 10 13 particelle virali (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. Per in vitro l'infezione dell'isolotto, uso 10 6 PFU/mL, risultante in una molteplicità di entità approssimativa dell'infezione (MOI) di circa 2 (Vedi discussione per dettagli)
  3. Infezione virale degli isolotti pancreatici
    Attenzione: Lavorare con gli adenovirus richiede procedure di certificazione e livello 2 di biosicurezza (BSL2). Verifica con l'ufficiale di biosicurezza istituzionale per orientamento e formazione sulle procedure di BSL2.
    1. Preparare umani/mouse isolotti come descritto sopra.
    2. Aggiungere 5-10 µ l di virus stock per ogni scatola di Petri 35 mm contenente isolotti umani/topo in 2 mL di terreno di coltura CMRL (con 10% FBS e 2 mM L-Glutammina).
      Nota: Regolare il volume del virus impiegato secondo il titolo virale come previsto dal foglio dati società.
    3. Cultura gli isolotti in contenenti virus media presso 37 °C/5% CO 2 per 24 h.
    4. Dopo 24 h, aspirare i supporti contenenti virus e sostituire con 2 mL di coltura CMRL (con 10% FBS e 2 mM L-Glutammina).
    5. Cultura gli isolotti per 4-6 giorni a 37 °C/5% CO 2, sostituendo i media ogni 3 giorni.
    6. Dopo 4 - 6 giorni di coltura, si aspettano circa 30% delle cellule dell'isolotto di essere infetti. Isolotti possono quindi essere utilizzati per esperimenti dal vivo imaging.

2. Confocale Imaging di infettati isolotti

Nota: fare riferimento alla Tabella materiali per i materiali e le attrezzature necessarie per l'imaging confocale.

  1. Reagente preparazione e messa a punto sperimentale
    1. preparare soluzione extracellulare: aggiungere 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1mm MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4, sterile filtrata.
      Nota: Questo buffer è normalmente preparato senza glucosio e possa essere conservato a 4 ° C per fino a 1 mese. Il glucosio è aggiunto il giorno dell'esperimento per raggiungere la concentrazione finale desiderata.
      1. Medio basale del glucosio (3 mM) preparazione: aggiungere 75 µ l di brodo glucosio 2m a 50 mL di soluzione extracellulare.
      2. Hyperglycemic (16 mM) medio: aggiungere 400 µ l di brodo glucosio 2m a 50 mL di soluzione extracellulare
    2. Diluire qualsiasi ulteriore stimolo (per esempio, KCl o l'adenosina trifosfato (ATP)) in soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM.
    3. Prima di iniziare un esperimento, pretrattare i coprioggetti con poli-D-lisina aggiungendo 30 µ l di soluzione di poli-D-lisina (1 mg/mL) per il coprioggetto per 1 h e risciacquare accuratamente con H 2 O.
      Nota: Le lamelle di poli-lisina rivestito possono essere conservate a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
    4. Almeno 1 h prima dell'esperimento, utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire gli isolotti in una capsula Petri 35 mm contenente soluzione extracellulare con 3 millimetri di glucosio. Mantenere gli isolotti a 37 ° C e 5% CO 2.
      Nota: Se necessario, la membrana plasmatica può essere etichettata in questo passaggio. Per etichettare la membrana plasmatica, è possibile aggiungere 2 µM di-8-ANEPP colorante alla soluzione extracellulare con glucosio a 3 mM. Incubare le isolette nella soluzione colorante per 1 h a 37 °C/5% CO 2. La tintura di membrana plasmatica può essere eccitata a 488 nm e rilevato a 620 nm.
    5. min prima di iniziare un esperimento, fissare il vetrino coprioggetto alla camera di imaging sigillando con grasso al silicone vuoto. Difficoltà la camera di imaging per la piattaforma di imaging. Utilizzando una pipetta, inserire 20-30 isolotti sulla zona poli-D-lisina-trattati del vetrino coprioggetto e lasciare che gli isolotti aderiscono alla superficie per 20 min.
      Nota: È importante non far asciugare completamente per evitare danni dell'isolotto coprivetrino.
    6. Mentre gli isolotti sono aderenti per il vetrino coprioggetto, preparare il sistema di perfusione risciacquando abbondantemente con acqua. Aggiungere ogni soluzione a un canale diverso: 3 millimetri di glucosio (canale 1), 16 millimetri di glucosio (canale 2), 16 millimetri di glucosio con 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e 10 µM forskolin (canale 3), 25 mM KCl in 3 millimetri di glucosio (canale 4), 10 µM ATP in 3 mM glucosio ( Canale 5). Rimuovere tutte le bolle dal sistema aprendo ogni canale separatamente e lasciare che il flusso di soluzione per pochi minuti e assicurarsi che il flusso è coerente (0,5 mL/min) e il tubo non perde.
    7. Collegare il riscaldatore di soluzione single inline per il tubo di uscita di aspersione e regolare la temperatura del buffer outflowing a 37 ° C.
    8. Preparare la pompa di aspirazione. Rimuovere tutte le bolle dal sistema e assicurarsi che il flusso è coerenza e il tubo non perde.
    9. Una volta che gli isolotti aderiscano alla superficie del vetrino coprioggetto, riempire delicatamente la camera di imaging con la soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM. Evitare di lavare gli isolotti lontano dalla superficie del coprivetrino.
    10. Mettere la piattaforma di imaging con gli isolotti sul palco microscopio e collegarlo alla pompa di aspirazione e sistema di perfusione.
    11. Disabilita sul flusso e costantemente irrorare le isolette con la soluzione extracellulare di 3G. Il sistema è ora pronto per l'imaging confocale.
  2. Imaging confocale
    1. individuare gli isolotti nel campo microscopio con ingrandimento minore. Una volta messo a fuoco sugli isolotti, passare a più alti obiettivi di ingrandimento (per es., 63 obiettivo a immersione in acqua X (63 X / 0,9 NA)).
    2. Aprire l'acquisizione utilizzando software (Tabella materiali) e attivare la modalità scanner risonante.
    3. Selezionare la modalità di imaging XYZT e configurare le impostazioni di acquisizione come segue:
      1. girare su Argon laser e il laser a 488 nm linea e regolare la potenza del laser al 50% per l'eccitazione di pHluorin.
      2. Raccogliere emissione a 505-555 nm.
      3. Scegliere una risoluzione di 512 x 512 pixel. Premere il " Live " per avviare imaging e regolare i livelli di guadagno (guadagno tipico è intorno a 600 V).
      4. Impostare l'inizio e fine dello z-stack: concentrarsi sulla parte superiore l'isolotto e scegliere " begin " e spostarsi all'ultimo piano che può essere focalizzata e sceglie " fine ". Utilizzare una dimensione di z-passaggio di 5 µm. Il software calcolerà automaticamente il numero di aerei confocale.
      5. Impostare l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni stack di z nei pressi di 1.5-2 s e scegliere l'opzione " acquisire deve essere interrotta " per l'imaging continuo.
      6. Premere il " inizio " pulsante per inizializzare.
    4. Utilizzare diversi protocolli di stimolazione per indurre esocitosi di granuli irrorando gli isolotti con gli stimoli desiderati. Protocolli di stimolazione possono essere personalizzati per soddisfare lo scopo scientifico desiderato (Vedi sotto).
  3. Protocolli di stimolazione
    Nota: In ogni protocollo di stimolazione, iniziare registrando almeno 2 min delle attività in background dell'isolotto durante l'aspersione costante con soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM. Irrorare con uno stimolante per il periodo di tempo desiderato. L'ordine di stimolanti, durata della stimolazione così come durata delle registrazioni possono essere personalizzati per soddisfare le finalità scientifiche desiderate. Assicurarsi di lavare accuratamente gli isolotti con soluzione extracellulare contenente glucosio 3 mM prima di iniziare un nuovo stimolo. Qui di seguito trovare i protocolli di stimolazione di campione che sono stati utilizzati per illustrare le funzionalità di metodo.
    1. Stimolare con cloruro di ammonio (NH 4 Cl) come controllo positivo per pHluorin pH sensibilità ed efficacia di infezione virale ( Figura 3): 3 millimetri di glucosio (2 min) → 50mm NH 4 Cl (2 min) in glucosio di 3 mM → 3 millimetri di glucosio (2 min)
      Nota: In the NH 4 Cl soluzione, sostituire NaCl su una base equimolare.
    2. Esocitosi di granuli di insulina stimolano aumentando la concentrazione di glucosio ( Figura 5 e Figura 6): 3 millimetri di glucosio (2 min) → 16 millimetri di glucosio (15-30 min) → 3 millimetri di glucosio (2 min
      Nota: Al fine di vedere parecchi scoppi di attività, irrorare gli isolotti continuamente con la soluzione di 16 G per almeno 15 min.
      Nota: Al fine di aumentare la coerenza delle risposte secretiva 17, utenti possono aggiungere agenti di sensibilizzazione cAMP (100 µM IBMX e 10 µM forskolin) alle soluzioni 3G e 16 G. Questo non cambia i pattern temporali della secrezione del granello. Per informazioni dettagliate vedere 15 e discussione.

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Risultati

L'intero flusso di lavoro della tecnica è illustrata nella Figura 1. Brevemente, mouse o isolotti umani possono essere infettati con l'adenovirus codifica NPY-pHluorin e ripreso, dopo pochi giorni a cultura, sotto un microscopio confocale. Come granuli si fondono con la membrana plasmatica e Apri, un aumento di fluorescenza è osservato e possono essere quantificato (Figura 1). Per determinare se NPY-pHluorin è infatti uno stru...

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Discussione

Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per visualizzare esocitosi dei granuli di insulina in cellule beta all'interno intatti isolotti pancreatici mediante microscopia confocale. Utilizza NPY-pHluorin come il reporter fluorescente clonato in adenovirus per garantire un'efficienza di trasfezione alta.

Anche se il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, anche se potrebbe richiedere alcune modifiche che dipendono principalmente da due parametri: 1) la qualit?...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Marcia Boulina dalla funzione di memoria per un aiuto con i microscopi di imaging e DRI. Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), DK111538 R01, R33 ES025673 e R56 DK084321 (AC).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Upright laser-scanning confocal microscopeLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS-SP5includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamberWarner instrumentsRC-26
Imaging chamber platformWarner instrumentsPH-1
22 x 40 glass coverslipsDaiggerbrandG15972H
Vacuum silicone greaseSigmaZ273554-1EA
Multichannel perfusion systemWarner instrumentsVC-8
Single inline solution heaterWarner instrumentsSH-27B
Temperature controllerWarner instrumentsTC-324C
Peristaltic Suction pumpPharmaciaP-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treatedVWR10861-586
CMRL Medium, no glutamineThermoFisher11530037
FBS, heat inactivatedThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl solutionSigmaS5150
3 M KCl solutionSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
1 M HEPES solutionSigmaH0887
Vacuum filterVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917

Riferimenti

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