JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол для визуализации экзоцитоз инсулина в нетронутыми островами с помощью pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок. Изолированные островки заражены аденовирус кодирования pHluorin, в сочетании с везикул грузов нейропептида Y. Это позволяет для обнаружения инсулина гранул фьюжн событий confocal микроскопии.

Аннотация

Секреции инсулина играет центральную роль в гомеостаз глюкозы при нормальных физиологических условиях, а также болезни. Нынешние подходы для изучения инсулина гранул экзоцитоз, либо использовать электрофизиологии или микроскопия, в сочетании с выражением флуоресцентные репортеры. Однако большинство из этих методов были оптимизированы для клоновых клеточных линий или требовать отделения панкреатических островков. В отличие от этого метод, представленные здесь позволяет для визуализации реального времени экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми панкреатических островков. В этом протоколе мы сначала описать вирусной инфекции изолированы панкреатических островков с аденовирус, который кодирует рН чувствительных Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), pHluorin, в сочетании с нейропептида Y (NPY). Во-вторых мы описываем, конфокальная изображений из островков пять дней после вирусной инфекции и как контролировать гранул секреция инсулина. Кратко зараженных островков размещаются на coverslip на тепловизионные камеры и образы под вертикальное сканирование лазерного конфокального микроскопа при будучи постоянно увлажненную с внеклеточного раствор, содержащий различные стимулы. Конфокальный изображения, охватывающих 50 мкм островок приобретаются как покадровой записи с помощью быстро резонансный сканер. Синтез инсулина гранул с плазматической мембраны может следовать со временем. Эта процедура также позволяет для тестирования аккумулятора раздражителей в одном эксперименте, совместим с мыши и человеческих островках и могут быть объединены с различные красители для функциональных изображений (например, мембранный потенциал или цитозольной кальция красители).

Введение

Инсулин вырабатывается бета-клетки поджелудочной островок и это ключевым регулятором метаболизма глюкозы1. Смерть или дисфункции бета-клеток нарушает гомеостаз глюкозы и приводит к диабета2. Инсулин, Упакованные в плотной ядра гранул, которые выпускаются в Ca2 +-3зависимым образом. Разъяснение, как регулируется экзоцитоз гранул инсулина необходимо полностью понять, что определяет секреции инсулина и открывает новые возможности для определения новых терапевтических целей для лечения диабета.

Инсулин экзоцитоз широко изучен, с помощью электрофизиологических подходы, такие как измерения емкости мембраны и микроскопических подходов в сочетании с флуоресцентных молекул. Измерения емкости мембраны имеют хорошие временное разрешение и позволяют одну ячейку записи. Однако изменения в емкость отражают чистое изменение поверхности клетки и не захватывать события отдельных фьюжн или отличить инсулина гранул фьюжн от других инсулиннезависимым секреторные пузырьки3. Микроскопический подходы, такие как два фотона или полного внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования (TIRF) в сочетании с флуоресцентных зондов и везикул грузов белков, предоставляют дополнительные подробности. Эти методы захвата одного-exocytotic событий, а также этапов до и после exocytotic и может быть использован для изучения exocytotic моделей в популяциях клеток3.

Флуоресцентный Репортеры могут быть трех типов: 1) внеклеточная, 2) цитоплазмы или 3) пузырчатка. 1) внеклеточной журналисты являются полярные Трейсеры (например, декстраны, sulforhodamine B (SRB), Люцифер жёлтый, pyranine), которые могут быть введены через внеклеточных среды4. Использование полярного Трейсеры позволяет для расследования фьюжн поры в популяции клеток и захватывает различные межклеточных структур, таких как кровеносные сосуды. Однако они не сообщают о везикул грузов поведение. 2) цитоплазматической журналисты являются флуоресцентных зондов, в сочетании с связанный мембранами перст-белки, которые сталкиваются с цитоплазмой и участвуют в док и экзоцитоз. Примеры включают членов растворимых N- ethylmaleimide-чувствительных фактор вложений белка рецептора (SNARE) семьи, которые были успешно использованы в неврологии для изучения нейромедиатора релиз5. Такие белки имеют несколько партнеров привязки и не инсулин блок конкретных. 3) пузырчатка журналисты являются флуоресцентных зондов, сливается с везикулярного грузов белки, которые позволяют для расследования конкретных грузов везикул поведения. Белки инсулин блок конкретных грузов включают в себя инсулин и с пептида, полипептид амилоида островка, NPY среди прочих6,7. NPY присутствует только в инсулине, содержащие гранул и совместно выпустили с инсулина, что делает его отличным партнером для флуоресцентных репортер8.

Слияние различных флуоресцентных белков NPY ранее использовалась для изучения различных аспектов экзоцитоз в нейроэндокринные клетки, например требование о конкретных Синаптотагмин изоформы9,10 и как время курс релиза зависит на Цитоскелет актина и миозина II11,12. В этом исследовании, мы выбрали pHluorin как флуоресцентные репортер, который является изменение GFP, это не флуоресцентные в кислой рН внутри плотные ядра гранул но становится ярко люминесцентные под воздействием нейтральный внеклеточного pH13. Зрелые инсулина гранулы имеют кислый рН ниже 5.5. Как только Блок предохранителей с плазматической мембраны и открывается, его груз подвергается нейтральных внеклеточного pH 7,4, позволяя использовать pHluorin рН чувствительных белки как репортер7,14.

Учитывая деликатный характер pHluorin рН и селективного выражение NPY в гранулы инсулина конструкция фьюжн NPY-pHluorin может использоваться для изучить различные свойства инсулина гранул экзоцитоз. Вирусных доставки фьюжн конструкция обеспечивает высокий трансфекции эффективность и работает на основной бета-клеток и клеточных линий, а также на изолированных островков. Этот метод также может использоваться в качестве ориентира для изучения экзоцитоз в любой другой тип клеток с NPY-содержащих везикулы. Он может также сочетаться с любой трансгенные мыши модель для изучения последствий определенных условий (нокдаунов, гиперэкспрессия и т.д.) на экзоцитоз. Эта техника ранее не использовался для описания пространственных и временных моделей гранул секреции инсулина в бета клеточных популяций в человеческих островках15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Комитет по этике животных из университета Майами одобрил все эксперименты.

1. вирусные инфекции нетронутыми изолированных человека или мыши панкреатических островков

  1. островок культуры: подготовить островок культуры СМИ: Connaught медицинских исследовательских лабораторий (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS и 2 мм L-глютамина.
    1. Человека панкреатических островков получаются из комплексной программы распределения островок (NIDDK, низ). По прибытии, Трансфер островков (~ 500 островок эквиваленты) для 35-мм не культуры ткани лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o 2 за 24 ч до вирусной инфекции.
      2. Панкреатических островков
    2. мыши могут быть изолированы после ранее установленными протоколами 16. После изоляции, культура ~ 200 островок эквиваленты в культуре ткани 35-мм лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o 2 за 24 ч до вирусной инфекции.
      Примечание: Избегайте использования трансгенных мышей с GFP или рекламы ЯФП журналистами выразил на островках во избежание дублирования флуоресценции с NPY-pHluorin.
  2. Вирус подготовки
    Примечание: NPY pHluorin fusion был клонирован в pcDNA3 вектор 10 и subcloned в аденовирусных вектор для аденовирусных производства [аденовирус серотип 5 (ДЭ1/E3)] по рекомбинантным аденовирус производственная компания. Вирус был aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C. Вирусные акции предоставляется компанией на титры 10 12-10 13 вирусных частиц (~ 3 x 10 10 - 3 х 10 11 ОРП).
    1. В vitro островок инфекции, использование 10 6 ОРП/мл, возникающих в приблизительные количества инфекции (МВД) около 2 (см. обсуждение за подробности)
  3. Вирусная инфекция панкреатических островков
    Предупреждение: Работа с аденовирусов требует процедуры 2-го уровня биобезопасности (BSL2) и сертификации. Проверьте с институциональных биобезопасности сотрудника для руководства и обучения на BSL2 процедур.
    1. Подготовить человека и мыши островков, как описано выше.
    2. Добавить 5-10 мкл запасов вируса к каждому блюду Петри 35-мм, содержащих островки человека и мыши в 2 мл CMRL культуры средств массовой информации (с 10% FBS и 2 мм L-глютамин).
      Примечание: Громкость этого вируса, используется согласно вирусной титр, как это предусмотрено в описании компании.
    3. Культура островков в вирус содержащих СМИ на 37 °C/5% CO 2 за 24 ч.
    4. После 24 ч, аспирационная вирус содержащих СМИ и заменить с 2 мл CMRL Культура СМИ (с 10% FBS и 2 мм L-глютамин).
    5. Культура островки для 4-6 дней на 37 °C/5% CO 2, заменив СМИ каждые 3 дня.
    6. После 4 - 6 дней культивирования, ожидать около 30% островковых клеток, чтобы быть заражены. Островки может затем использоваться для живых изображений экспериментов.

2. Конфокальный изображений из инфицированных островки

Примечание: обратитесь к Таблице материалов для материалов и оборудования, необходимых для конфокальная томография.

Подготовка
  1. реагента и экспериментальной установки
    1. подготовить внеклеточного решение: добавить 125 мм NaCl, 5,9 мм KCl, 2.56 мм CaCl 2, 1 мм MgCl 2, 25 мм HEPES, 0.1% BSA, рН 7,4, стерильной фильтрации.
      Примечание: Этот буфер обычно готовится без глюкозы и может храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца. Глюкоза добавляется в день эксперимента, чтобы достичь желаемой конечной концентрации.
      1. Подготовить базальной глюкозы (3 мм) средний: 75 мкл запасов глюкозы 2 М до 50 мл раствора внеклеточные.
      2. Среднего Hyperglycemic (16 мм): 400 мкл запасов глюкозы 2 М до 50 мл раствора внеклеточные
    2. Ослабить любые дополнительные стимулы (например, хлористого калия или аденозинтрифосфатом (АТФ)) в внеклеточной раствор, содержащий 3 мм глюкозы.
    3. Перед началом эксперимента, предварительной обработки coverslips с поли D-лизин, добавив 30 мкл раствора (1 мг/мл) поли D-лизин coverslip за 1 час и тщательно полоскать с H 2 O.
      Примечание: Поли лизин с покрытием coverslips может храниться при комнатной температуре до 6 месяцев.
    4. По крайней мере за 1 ч до эксперимент, используя 1 мл пипетки, передачи островки для 35-мм Петри, содержащие внеклеточного решение с 3 мм глюкозы. Держите островков при 37 ° C и 5% CO 2.
      Примечание: При необходимости плазматической мембраны могут быть помечены в этом шаге. Чтобы пометить плазматической мембраны, добавьте 2 мкм ди-8-ANEPP краситель внеклеточного решение с 3 мм глюкозы. Инкубируйте островков в раствор красителя для 1 ч при 37 °C/5% CO 2. Краситель плазматической мембраны могут быть возбуждены в 488 нм и обнаружен в 620 Нм.
    5. мин перед началом эксперимента, придают coverslip тепловизионные камеры путем герметизации с вакуумной силиконовой смазкой. Исправьте тепловизионные камеры для изображений платформы. С помощью пипетки, место 20-30 островков на поли D-лизин лечение области coverslip и пусть островки присоединиться к поверхности на 20 мин
      Примечание: Важно, чтобы не позволить высохнуть, чтобы избежать повреждения островок coverslip.
    6. В то время как островки придерживаясь coverslip, подготовить перфузии системы тщательно ополоснуть водой. Добавьте каждое решение на другой канал: 3 мм глюкозы (канал 1), глюкозы (канал 2), 16 мм 16 мм глюкозы с 100 мкм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 25 мм KCl в 3 мм глюкозы (channel 4), 10 мкм АТФ в 3 мм глюкозы (10 мкм форсколин (канал 3), 5 канал). Удалить все пузырьки из системы, открыв для каждого канала отдельно и давая решение поток на несколько минут и убедитесь, что поток является последовательным (0,5 мл/мин) и трубку не протекает.
    7. Подключите один встроенный нагреватель решение к отводной трубки перфузии и отрегулировать температуру выходящего буфера до 37 ° C.
    8. Подготовить всасывающий насос. Удалить все пузырьки из системы и убедитесь, что поток является последовательной и трубки не протекает.
    9. После того, как островки придерживаться coverslip поверхности, аккуратно заполнить тепловизионные камеры с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Избегать мытья островков от поверхности coverslip.
    10. Место изображений платформы с островками на сцену микроскоп и подключить его к системе перфузии и всасывания насоса.
    11. Поворот на поток и постоянно perfuse островков с внеклеточного решения 3G. Теперь система готова для конфокальная томография.
  2. Конфокальная томография
    1. обнаружения островков в поле микроскоп с увеличением ниже. После сосредоточены на островки, переключитесь в цели более высокого масштаба (например, цель погружения воды 63 X (63 X / 0.9 NA)).
    2. Открыть приобретение с помощью программного обеспечения (Таблица материалов) и активировать режим резонансный сканер.
    3. Выберите режим визуализации XYZT и настройте параметры приобретения следующим:
      1. повернуть на аргон лазера и 488 нм лазер линии и отрегулировать мощность лазера до 50% для возбуждения pHluorin.
      2. Собирать выбросов 505-555 Нм.
      3. Выбрать разрешение 512 x 512 пикселей. Пресс " Live " кнопку, чтобы начать изображений и отрегулировать уровни усиления (типичный прирост составляет около 600 V).
      4. Установить начало и конец z стека: фокус на вершине островка и выбрать " начать " и перейти к последнему плоскость, которая может быть направлена и выбрать " конец ". Используйте размер z шаг 5 мкм. Программное обеспечение автоматически рассчитает количество конфокальный плоскостей.
      5. Задать временной интервал для приобретения каждого z-стека недалеко от 1,5-2 сек и выбрать опцию " приобрести до остановки " для непрерывной обработки изображений.
      6. Пресс " начало " кнопку чтобы initialize.
    4. Используют различные протоколы стимуляции побудить гранул экзоцитоз, perfusing островков с желаемой раздражителей. Протоколы стимуляции могут быть настроены с учетом желаемой научной целью (см. ниже).
  3. Протоколы стимуляции
    Примечание: В протоколе каждый стимуляции, начните с записи по крайней мере 2 мин островок фоновой активности во время постоянной перфузии с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Perfuse с стимулятором за желаемый период времени. Порядок стимуляторов, длительность стимуляции, а также продолжительность записи могут настраиваться с учетом желаемого научных целей. Убедитесь в том вымыть островков с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы перед началом нового стимуляции. Ниже найдете протоколы стимуляции выборки, которые использовались для демонстрации возможностей метода.
    1. Стимулировать с аммония хлорид (NH 4 Cl) как позитивный элемент управления для pHluorin рН чувствительность и вирусной инфекции эффективность ( рис. 3): 3 мм глюкозы (2 мин) → 50 мм NH 4 Cl (2 мин) в 3 мм глюкозы → глюкозы (2 мин) 3 мм
      Примечание: В NH 4 Cl решение, заменить NaCl на основе эквимолярных.
    2. Экзоцитоз гранул инсулина стимулировать путем увеличения концентрации глюкозы ( Рисунок 5 и Рисунок 6): 3 мм глюкозы (2 мин) → 16 мм глюкозы (15-30 мин) → 3 мм глюкозы (2 мин
      Примечание: Чтобы увидеть несколько всплесков активности, perfuse островков непрерывно с 16 G решение для по крайней мере 15 мин
      Примечание: В целях повышения согласованности секреторной ответы 17, пользователи могут добавлять лагерь просветительских агентов (100 мкм IBMX и 10 мкм форсколин) для 3 G и 16 G решений. Это не изменяет временной структуры гранул секреция. Подробную информацию см. 15 и обсуждения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Весь процесс техника показано на рисунке 1. Кратко мыши или человека островков можно инфицированных аденовирус кодирования NPY-pHluorin и образы, после нескольких дней в культуре, под конфокального микроскопа. Как гранулы сливаются с плазматической мембран...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта рукопись описывает технику, которая может использоваться для визуализации экзоцитоз инсулина гранул в бета-клеток в пределах нетронутыми панкреатических островков confocal микроскопии. Он использует NPY-pHluorin как флуоресцентные репортер, клонированные в аденовирус обеспечить эффекти?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Марсия Boulina от DRI изображений ядра фонда за помощь с микроскопов. Эта работа была поддержана NIH грантов 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (мм), R01 DK111538, R33 ES025673 и R56 DK084321 (AC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Upright laser-scanning confocal microscopeLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS-SP5includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamberWarner instrumentsRC-26
Imaging chamber platformWarner instrumentsPH-1
22 x 40 glass coverslipsDaiggerbrandG15972H
Vacuum silicone greaseSigmaZ273554-1EA
Multichannel perfusion systemWarner instrumentsVC-8
Single inline solution heaterWarner instrumentsSH-27B
Temperature controllerWarner instrumentsTC-324C
Peristaltic Suction pumpPharmaciaP-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treatedVWR10861-586
CMRL Medium, no glutamineThermoFisher11530037
FBS, heat inactivatedThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl solutionSigmaS5150
3 M KCl solutionSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
1 M HEPES solutionSigmaH0887
Vacuum filterVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917

Ссылки

  1. Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
  2. Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
  3. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  4. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
  5. Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
  6. Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
  7. Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
  8. Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478(2011).
  9. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  10. Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
  11. Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
  12. Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
  13. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  14. Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).
  15. Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
  16. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632(2015).
  17. Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
  20. Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
  21. Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
  22. Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  25. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127YpHluorin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены