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Resumo

Descreveremos um protocolo para visualização de exocitose de insulina em ilhotas intactas usando pHluorin, uma proteína verde fluorescente de sensíveis ao pH. Ilhotas isoladas estão infectadas com vírus adenoide codificação pHluorin juntamente com a carga de vesículas neuropeptide Y. Isto permite a detecção de eventos de fusão de grânulo de insulina por microscopia confocal.

Resumo

A secreção de insulina desempenha um papel central na homeostase de glicose sob condições fisiológicas normais, bem como na doença. Abordagens atuais para estudar a exocitose de grânulos de insulina que ou usar eletrofisiologia ou microscopia acoplado à expressão de repórteres fluorescentes. No entanto, a maioria destas técnicas foram otimizada para linha celular clonal ou exige dissociando ilhotas pancreáticas. Em contraste, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real de exocitose de grânulos de insulina em ilhotas pancreáticas intactas. Neste protocolo, descrevemos primeiro a infecção viral de ilhotas pancreáticas isoladas com adenovírus que codifica uma pH sensíveis à proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada ao neuropeptídeo Y (NPY). Em segundo lugar, descrevemos o confocal imagens de Ilhéus cinco dias após a infecção viral e como monitorar a secreção de insulina do grânulo. Brevemente, os ilhéus infectados são colocados em uma lamela em uma câmara de imagens e fotografados sob um microscópio confocal laser de varredura vertical enquanto continuamente sendo perfundidos com solução extracelular que contém vários estímulos. Imagens confocal abrangendo 50 µm de ilhota são adquiridas como gravações de lapso de tempo usando um scanner rápido-ressonante. A fusão dos grânulos de insulina com a membrana plasmática pode ser seguida ao longo do tempo. Este procedimento também permite testar uma bateria de estímulos em uma única experiência, é compatível com mouse e ilhotas humanas e pode ser combinado com vários corantes para a imagem latente funcional (e.g., corantes de cálcio citosólico ou potencial de membrana).

Introdução

Insulina é produzida pelas células beta das ilhotas pancreáticas e é um regulador chave da glicose metabolismo1. Morte ou disfunção das células beta perturba a homeostase de glicose e leva a diabetes2. Insulina é embalada em grânulos densos núcleos que são liberados em uma Ca2 +-dependente forma3. Elucidar como exocitose de grânulos de insulina é regulada é essencial para compreender plenamente o que determina a secreção de insulina e abre novos caminhos para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes.

Exocitose de insulina tem sido estudado extensivamente usando abordagens eletrofisiológicas, tais como medidas de capacitância de membrana e abordagens microscópicas em combinação com moléculas fluorescentes. Medidas de capacitância de membrana têm boa resolução temporal e permitam gravações de célula única. No entanto, alterações na capacitância refletem a variação líquida de superfície da célula e não capturar eventos de fusão individuais ou distinguir a fusão de grânulo de insulina de outras vesículas secretoras não insulino-3. Abordagens microscópicas, tais como a microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total ou dois fotões em combinação com sondas fluorescentes e proteínas de carga de vesículas, fornecem detalhes adicionais. Estas técnicas capturar eventos os únicos e também as fases pré e pós-os e podem ser usadas para estudar os padrões em populações de células3.

Os repórteres fluorescentes podem ser de três tipos: 1) extracelular, 2) citoplasmática ou 3) vesicular. 1) extracelulares repórteres são marcadores polares (por exemplo, dextranos, sulforhodamina B (SRB), Lúcifer amarelo, pyranine) que podem ser introduzidos através do meio extracelular4. O uso de traçadores polares permite para a investigação dos poros em uma população de células de fusão e captura várias estruturas intercelulares, tais como os vasos sanguíneos. No entanto, eles não informam sobre o comportamento de carga de vesículas. 2) citoplasmáticos repórteres são sondas fluorescentes acopladas a proteínas de membrana-associado que enfrentam o citoplasma e são envolvidos no encaixe e exocitose. Exemplos incluem membros da solúvel N- proteà sensível fator acessório proteína receptor (SNARE) família que têm sido utilizados com sucesso em neurociência para o estudo de liberação de neurotransmissor5. Essas proteínas têm múltiplos parceiros de ligação e não são insulino-grânulo específico. 3) vesiculares repórteres são sondas fluorescentes fundidas às proteínas vesiculares de carga que permitem a investigação do comportamento de carga específicos vesículas. Proteínas de carga específica de insulina-grânulo incluem insulina, peptídeo-c, polipeptídeo amiloide ilhéu e NPY entre outros6,7. NPY somente está presente em insulina contendo grânulos e co é lançado com insulina, tornando-se um excelente parceiro para um repórter fluorescente8.

A fusão de diferentes proteínas fluorescentes para NPY foi anteriormente empregada para estudar vários aspectos da exocitose em células neuroendócrinas, tais como a exigência de synaptotagmin específico isoformas9,10 e como o tempo-curso de libertação depende o citoesqueleto de actina e miosina II11,12. Neste estudo, optamos por pHluorin como o repórter fluorescente, que é um GFP modificado que é não-fluorescente em pH ácido dentro do núcleo denso grânulo mas torna-se brilhantemente fluorescente após a exposição para o neutro pH extracelular13. Grânulos de insulina madura tem um pH ácido abaixo de 5,5. Uma vez que o grânulo funde-se com a membrana plasmática e abre, sua carga é exposta ao neutro pH extracelular de 7.4, permitindo o uso da pHluorin de proteínas sensíveis ao pH como repórter7,14.

Tendo em conta a natureza sensível do pH de pHluorin e a expressão seletiva de NPY nos grânulos de insulina, a construção de fusão NPY-pHluorin pode ser usada para estudar várias propriedades de exocitose de grânulos de insulina. A entrega viral da construção de fusão garante transfeccao de alta eficiência e trabalha na primária as células beta ou linhas de células, bem como sobre ilhotas isoladas. Esse método também pode ser usado como uma diretriz para o estudo de exocitose em qualquer outro tipo de célula com vesículas contendo NPY. Ele também pode ser combinado com qualquer modelo de rato geneticamente modificado para estudar os efeitos de certas condições (knockdowns, superexpressão, etc) na exocitose. Esta técnica tem sido usada anteriormente para caracterizar os padrões espaciais e temporais da secreção de insulina grânulo em populações de células beta nas ilhotas humana15.

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Protocolo

Comitê de ética animal da Universidade de Miami tem aprovado todos os experimentos.

1. viral infecção de intactos isolados humana ou ilhotas pancreáticas Mouse

  1. cultura ilhéu: preparar os meios de cultura de ilhota: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS e 2 mM L-glutamina.
    1. Humanos ilhotas pancreáticas são obtidas a partir do programa de distribuição integrada ilhéu (NIDDK, NIH). À chegada, transfer Ilhéus (~ 500 equivalentes ilhéu) de 35mm não-cultura de tecidos tratados pratos de Petri com meios de cultura CMRL mL 2 a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 para 24 h antes da infecção viral.
    2. Mouse ilhotas pancreáticas podem ser isoladas de protocolos previamente estabelecidos 16 a seguir. Após o isolamento, cultura ~ 200 equivalentes Ilhéu em 35mm não-cultura de tecidos trataram pratos de Petri com meios de cultura CMRL mL 2 a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 para 24 h antes da infecção viral.
      Nota: Evite usar ratos transgénicos com repórteres GFP ou YFP expressados em Ilhéus para evitar a sobreposição de fluorescência com NPY-pHluorin.
  2. Preparação de vírus
    Nota: A fusão de NPY-pHluorin foi clonada no vetor pcDNA3 10 e subcloned em um vetor adenovírus para adenovírus produção [adenovírus serótipo 5 (DE1/E3)] por um adenovírus recombinantes empresa de fabricação. O vírus foi aliquotadas e armazenado a-80 ° C. O estoque viral é fornecido pela empresa em uma concentração de 10 a 12 para 10 partículas virais de 13 (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. Em vitro de infecção ilhéu, uso 10 6 PFU/mL, resultando em uma multiplicidade de aproximada de infecção (MOI) de cerca de 2 (veja a discussão para mais detalhes)
  3. Infecção viral de ilhotas pancreáticas
    Atenção: Trabalhar com adenovírus requer certificação e procedimentos de biossegurança nível 2 (BSL2). Verificar com o oficial de biossegurança institucional para orientação e treinamento sobre procedimentos BSL2.
    1. Preparar humanos/rato ilhotas, como descrito acima.
    2. Adicionar 5-10 µ l de vírus de estoque para cada prato de Petri 35mm contendo ilhotas humanos/rato em 2 mL de meio de cultura CMRL (com 10% FBS e 2 mM L-glutamina).
      Nota: Ajuste o volume do vírus usado de acordo com o título viral, conforme fornecido pela folha de dados empresa.
    3. Cultura dos ilhéus em vírus contendo mídia em 37 °C/5% CO 2 por 24 h.
    4. Após 24 h, aspirar a mídia contendo vírus e substituir com 2ml CMRL, meios de cultura (com 10% FBS e 2 mM L-glutamina).
    5. Cultura de Ilhéus durante 4-6 dias a 37 °C/5% CO 2, substituindo os meios de comunicação a cada 3 dias.
    6. Após 4 - 6 dias de cultivo, espera cerca de 30% das células das ilhotas de estarem infectados. Ilhéus podem ser usados para experiências de imagens ao vivo.

2. Imagem latente confocal de ilhotas infectado

Nota: consulte a Tabela de materiais para os materiais e equipamentos necessários para a imagem latente confocal.

  1. Reagente de preparação e instalação experimental
    1. preparam a solução extracelular: Adicionar 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, estéril filtrada.
      Nota: Esta reserva é normalmente preparada sem glicose e pode ser armazenada a 4 ° C por até 1 mês. Glicose é adicionado no dia do experimento para atingir a concentração final desejada.
      1. Médio de glicose basal (3mm) de preparar: adicionar 75 µ l de 2 M estoque de glicose a 50 mL de solução extracelular.
      2. Médio Hyperglycemic (16 mM): adicionar 400 µ l de 2 M estoque de glicose a 50 mL de solução extracelular
    2. Diluir qualquer estímulo adicional (por exemplo, KCl ou trifosfato de adenosina (ATP)) na solução extracelular que contém glicose de 3 mM.
    3. Antes de iniciar um experimento, pré-tratamento de lamelas com poli-lisina-D adicionando 30 µ l de solução de poli-D-lisina (1 mg/mL) para a lamela por 1h e enxaguá-lo completamente com H 2 O.
      Nota: As lamelas de poli-lisina revestido podem ser armazenadas em temperatura ambiente por até 6 meses.
    4. Pelo menos 1 h antes do experimento, utilizando uma pipeta de 1 mL, transfere os ilhéus para um prato de Petri 35mm contendo solução extracelular com glicose de 3 mM. Manter os ilhéus a 37 ° C e 5% de CO 2.
      Nota: Se necessário, a membrana de plasma podem ser etiquetada nesta etapa. Para rotular a membrana plasmática, adicione corante de di-8-ANEPP 2 µM para a solução extracelular com glicose de 3 mM. Incube as ilhotas em solução de tintura para 1 h 37 °C/5% CO 2. A tintura de membrana plasmática pode ser animada em 488 nm e detectado a 620 nm.
    5. min antes de iniciar um experimento, anexar a lamela à câmara de imagens, selando-a com graxa de silicone de vácuo. Fixe a câmara de imagem para a plataforma de imagem. Utilizando uma pipeta, coloque 20-30 ilhotas na área poli-D-lisina-Tratado da lamela e deixe os ilhéus aderem à superfície de 20 min.
      Nota: É importante não deixar a lamela secar completamente para evitar danos ilhéu.
    6. , Enquanto que os ilhéus estão aderindo à lamela, preparar o sistema de perfusão, lavando-a cuidadosamente com água. Adicionar a cada solução para um canal diferente: glicose 3mm (canal 1), glicose de 16 mM (canal 2), glicose de 16 mM com 100 µM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 10 µM forskolin (canal 3), 25 mM KCl em glicose de 3mm (canal 4), 10 µM ATP em 3mm glicose ( Canal 5). Remova todas as bolhas do sistema abrindo cada canal separadamente e deixar o fluxo de solução por alguns minutos e certifique-se que o fluxo é consistente (0,5 mL/min) e o tubo não está vazando.
    7. Ligar o aquecedor de solução única embutido para o tubo de saída de perfusão e ajustar a temperatura do efluente buffer a 37 ° C.
    8. Preparar a bomba de sucção. Remova todas as bolhas do sistema e certifique-se que o fluxo é consistente e o tubo não está vazando.
    9. , Uma vez que os ilhéus aderem à superfície da lamela, delicadamente encher a câmara de imagem com a solução extracelular que contém glicose de 3 mM. Evite lavar os ilhéus longe da superfície da lamela.
    10. Coloque a plataforma de imagem com os ilhéus para o palco do microscópio e conectá-lo ao sistema de perfusão e bomba de sucção.
    11. Vez do fluxo e constantemente perfundir os ilhéus com a solução extracelular de 3G. O sistema está pronto para a imagem latente confocal.
  2. Imagem latente confocal
    1. localizar as ilhotas no campo microscópio com baixa ampliação. Uma vez focada em Ilhéus, alterne para objetivos de ampliação mais elevados (por exemplo, 63 objectivo de imersão de água X (63 X / 0.9 nd)).
    2. Abra a aquisição usando software (Tabela de materiais) e ative o modo de scanner ressonante.
    3. Selecione o modo de imagem XYZT e configurar as configurações de aquisição como segue:
      1. virar sobre o argônio laser e a 488 nm laser de linha e ajustar a potência do laser para 50% para a excitação de pHluorin.
      2. Recolher emissão 505-555 nm.
      3. Escolher uma resolução de 512 x 512 pixels. Imprensa o " Live " botão para iniciar a imagem e ajustar os níveis de ganho (ganho típico é de cerca de 600 V).
      4. Definir o início e término da z-pilha: concentre-se no topo do Ilhéu e escolha " começar " e mover para o último avião que pode ser focado e escolha " final ". Use um tamanho de passo-z de 5 µm. O software automaticamente irá calcular o número de aviões confocal.
      5. Definir o intervalo de tempo para aquisição de cada pilha-z perto de 1,5 a 2 s e escolha a opção " adquirir até parou de " para a imagem latente contínua.
      6. Imprensa o " iniciar " botão para initialize.
    4. Usar vários protocolos de estimulação para induzir a exocitose de grânulos por perfusing dos ilhéus com o estímulo desejado. Protocolos de estimulação podem ser personalizados para atender o propósito científico desejado (veja abaixo).
  3. Protocolos de estimulação
    Nota: em todos os protocolos de estimulação, começar pelo menos 2 min. de atividade de segundo plano do Ilhéu de gravação durante perfusão constante com solução extracelular de glicose de 3 mM. Perfundir com um estimulante para o período desejado. A ordem dos estimulantes, duração da estimulação, bem como a duração das gravações pode ser personalizado para atender os fins científicos desejados. Certifique-se de Ilhéus lave com solução extracelular que contém glicose 3 mM antes de iniciar um novo estímulo. Abaixo encontra os protocolos de estimulação de amostra que foram usados para demonstrar as capacidades do método.
    1. Estimulam com cloreto de amónio (NH 4 Cl) como um controle positivo para pHluorin pH sensibilidade e eficiência de infecção viral ( Figura 3): glicose 3mm (2 min) → 50mm NH 4 Cl (2 min) em glicose de 3 mM → glicose de 3mm (2 min)
      Nota: em the NH 4 Cl solução, substitua o NaCl numa base equimolar.
    2. Estimulam exocitose de grânulos de insulina, aumentando a concentração de glicose ( Figura 5 e Figura 6): glicose 3mm (2 min) → glicose de 16 mM (15-30 min) → glicose de 3 mM (2 min
      Nota: Para ver vários picos de atividade, perfundir os ilhéus continuamente com a solução de 16G de pelo menos 15 min.
      Nota: A fim de aumentar a coerência das respostas secretoras 17, usuários podem adicionar agentes de campo de sensibilização (IBMX de 100 µM e 10 µM forskolina) para soluções tanto o 3G e 16 G. Isso não altera os padrões temporais de secreção do grânulo. Para obter detalhes consulte 15 e discussão.

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Resultados

O fluxo de trabalho inteiro da técnica é mostrado na Figura 1. Brevemente, o mouse ou ilhotas humanas podem ser infectadas com o vírus adenoide codificação NPY-pHluorin e fotografadas, após alguns dias na cultura, sob um microscópio confocal. Como grânulos se fundem com a membrana plasmática e aberto, um aumento na fluorescência é observado e pode ser quantificado (Figura 1). Para determinar se o NPY-pHluorin é realme...

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Discussão

Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para visualizar a exocitose de grânulos de insulina em células beta dentro de ilhotas pancreáticas intactas por microscopia confocal. Ele usa NPY-pHluorin como o repórter fluorescente clonado em adenovírus para garantir uma eficiência elevada do transfection.

Embora o método fosse altamente eficiente em nossas mãos, ele pode requerer algumas modificações que dependem principalmente de dois parâmetros: 1) a qualidade da prepara...

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Divulgações

Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores graças a Marcia Boulina partir da DRI facilidade do núcleo para ajuda com os microscópios de imagem. Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 e DK084321 R56 (AC).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Upright laser-scanning confocal microscopeLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS-SP5includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamberWarner instrumentsRC-26
Imaging chamber platformWarner instrumentsPH-1
22 x 40 glass coverslipsDaiggerbrandG15972H
Vacuum silicone greaseSigmaZ273554-1EA
Multichannel perfusion systemWarner instrumentsVC-8
Single inline solution heaterWarner instrumentsSH-27B
Temperature controllerWarner instrumentsTC-324C
Peristaltic Suction pumpPharmaciaP-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treatedVWR10861-586
CMRL Medium, no glutamineThermoFisher11530037
FBS, heat inactivatedThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl solutionSigmaS5150
3 M KCl solutionSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
1 M HEPES solutionSigmaH0887
Vacuum filterVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917

Referências

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