JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz pHluorin, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein kullanarak bozulmamış adacıkları insülin ekzositozu görselleştirme için bir iletişim kuralı tanımlamak. İzole adacıkları adenovirus pHluorin vezikül kargo peptit Y birleştiğinde kodlama ile bulaşmış. Bu confocal mikroskobu tarafından insülin granül füzyon olayları algılama için sağlar.

Özet

İnsülin salgılanması glikoz homeostazı normal şartlarda fizyolojik de olduğu gibi hastalığı merkezi bir rol oynar. İnsülin granül ekzositozu Elektrofizyoloji veya floresan gazetecilere ifade için birleştiğinde mikroskobu kullanın eğitim için geçerli yaklaşımlar. Ancak bu tekniklerin çoğu klonal hücre hatları için optimize edilmiş veya pankreas adacıkları dissociating gerektirir. Buna ek olarak, burada sunulan yöntemi insülin granül ekzositozu sağlam pankreas adacıkları içinde gerçek zamanlı görselleştirme olanak sağlar. Bu protokol için ilk viral enfeksiyon peptit Y (NPY) birleştiğinde bir pH duyarlı yeşil flüoresan protein (GFP), pHluorin, kodlar adenovirus ile izole pankreas adacıkları tarif. İkinci olarak, confocal adacıkları beş gün sonra viral enfeksiyon ve insülin granül sekresyonunu izlemek nasıl görüntüleme açıklar. Kısaca, virüslü adacıkları bir coverslip bir görüntüleme odası üzerinde yerleştirilir ve bir dik lazer tarama confocal mikroskop altında sürekli olarak çeşitli uyaranlara içeren hücre dışı çözüm ile periosteum süre görüntüsü. Confocal görüntüleri adacık 50 µm kapsayan bir hızlı rezonans tarayıcı kullanarak hızlandırılmış kayıtları elde edilir. İnsülin granülleri plazma zarı ile füzyon zaman içinde izlenebilir. Bu yordamı Ayrıca tek bir deneyde bir pil uyaranların test etmek için izin verir, fare ve insan adacıkları ile uyumludur ve fonksiyonel görüntüleme (örneğin, membran potansiyeli veya sitozolik kalsiyum boyalar) için çeşitli boyalari ile kombine edilebilir.

Giriş

İnsülin pankreas adacık beta hücreleri tarafından üretilen ve glukoz metabolizma1anahtar bir düzenleyicisidir. Ölüm ya da beta hücre fonksiyon bozukluğu glikoz homeostazı rahatsız ediyor ve diyabet2' ye götürür. İnsülin bir Ca2 +içinde yayımlanan çekirdek yoğun granüller içinde paketlenmiştir-bağımlı bir şekilde3. İnsülin granül ekzositozu nasıl düzenlenir elucidating tam olarak ne insülin salgılanması belirler ve diyabet tedavisi için yeni tedavi hedefleri tanımlaması için yeni yollar açar anlamak önemlidir.

İnsülin ekzositozu kapsamlı floresan molekülleri ile birlikte membran kapasitans ölçümleri ve mikroskobik yaklaşımlar gibi Elektrofizyolojik yaklaşımları kullanarak çalışılmıştır. Membran kapasitans ölçümleri iyi temporal çözünürlüğe sahip ve tek hücre kayıtları sağlar. Ancak, kapasite değişimler hücrenin net yüzey değişikliği yansıtmak ve bireysel füzyon olayları yakalamak veya insülin granül füzyon diğer sigara insülin salgı veziküller3ayırt. İki fotonlu veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, floresan problar ve vezikül kargo proteinler, birlikte gibi mikroskobik yaklaşımlar ek ayrıntı sağlar. Bu teknikler tek exocytotic olayları ve ayrıca öncesi ve sonrası exocytotic aşamaları yakalamak ve nüfus hücreleri3exocytotic desen eğitimi için kullanılabilir.

Floresan gazetecilere üç tür olabilir: 1) hücre dışı, 2) sitoplazmik veya 3) veziküler. 1) hücre dışı gazetecilere ekstraselüler ortamın4ten kutup tarayıcıları (örneğin, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer sarı, pyranine) vardır. Polar verici kullanımı bir nüfus hücre füzyon gözenek incelenmesi için izin verir ve kan damarları gibi çeşitli hücreler arası yapıları yakalar. Ancak, vezikül kargo davranış bildirmez. 2) sitoplazmik gazetecilere floresan problar sitoplazma yüz ve rıhtım ve ekzositozu dahil membran ilişkili proteinler için birleştiğinde vardır. Örnekler nörotransmitter sürüm5çalışmak için nörolojik başarıyla kullanılan çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı faktör ek protein reseptörü (tuzak) aile üyeleri. Bu proteinler birden çok bağlayıcı ortak ve insülin-granül değildir belirli. 3) veziküler gazetecilere floresan problar kargo özel vezikül davranış soruşturma için izin veziküler kargo proteinlere erimiş vardır. İnsülin-granül özel kargo proteinler insülin, c-peptid, adacık amiloid polipeptid ve NPY diğerleri arasında içerir6,7. NPY sadece insülin granülleri içeren mevcuttur ve insülin ile ortak yapım o bir floresan muhabir8için mükemmel bir partner yayımlanır.

Füzyon NPY için farklı floresan proteinlerin daha önce ekzositozu nöroendokrin hücrelerinde, belirli synaptotagmin izoformlarının9,10 şartı gibi çeşitli yönlerini incelemek için istihdam edilmiştir ve nasıl zaman-yayın tabii aktin sitoiskeleti üzerindeki ve myosin II11,12bağlıdır. Bu çalışmada, floresan olmayan değiştirilmiş bir GFP olan flüoresan muhabir pHluorin seçtik yoğun çekirdek içinde asidik pH granül ama olur maruz nötr ekstrasellüler pH13üzerine parlak floresan. Olgun insülin granülleri bir asidik pH 5.5 aşağıda var. Bir kez plazma zarı ve açar ile granül sigortalar, taşıdığı 7.4,7,14muhabir olarak pH duyarlı proteinler pHluorin kullanımına izin nötr ekstrasellüler pH için yararlanılır.

PHluorin pH hassas doğası ve insülin granülleri NPY seçici ifade içinde görüş-in NPY-pHluorin füzyon yapı insülin granül ekzositozu çeşitli özelliklerini incelemek için kullanılabilir. Füzyon yapı viral teslim yüksek transfection verimlilik sağlar ve birincil beta hücreleri veya hücre hatları yanı sıra izole adacıkları üzerinde çalışır. Bu yöntem, bir kılavuz olarak ekzositozu hücreye herhangi bir diğer NPY içeren veziküller ile çalışmak için de kullanılabilir. Ayrıca ekzositozu üzerinde belirli koşullar (nakavtlar, overexpression, vb) etkilerini incelemek için herhangi bir transgenik fare modeli ile birleştirilebilir. Bu teknik daha önce insülin granül sekresyonunu beta hücre popülasyonlarının insan adacıkları15içinde kayma ve temporal desenlerini tanımlamak için kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

University of Miami hayvan Etik Komitesi tüm deneylerin onayladı.

1. viral enfeksiyon, bozulmamış izole insan veya fare pankreas adacıkları

  1. adacık kültür: adacık kültür ortamı hazırlamak: Connaught tıbbi araştırma laboratuvarları (CMRL) 1066, % 10 (v/v) FBS ve 2 mM L-glutamin.
    1. İnsan pankreas adacıkları entegre adacık dağıtım programından (NIDDK, NIH) elde edilir. Elimize adacıkları transfer (~ 500 adacık eşdeğerleri) için 35-mm sigara doku kültürü Petri yemekler ile 2 mL CMRL kültür medya 37 ° c, % %5/95 CO 2 /O 2 24 saat önce viral enfeksiyon için tedavi.
    2. Fare pankreas adacıkları daha önce kurulan protokolleri 16 aşağıdaki ayrılmış olabilir. Yalıtım, kültür ~ 200 adacık eşdeğerleri olarak 35-mm sigara doku kültürü Petri yemekler ile 2 mL CMRL kültür medya 37 ° c, % %5/95 CO 2 /O 2 24 saat önce viral enfeksiyon için tedavi.
      Not: transgenik fareler adacıkları üzerinde ifade GFP veya YFP muhabirlerle NPY-pHluorin floresan çakışma önlemek için kullanmaktan kaçının.
  2. Virüs hazırlık
    Not: NPY-pHluorin fusion pcDNA3 vektör 10 kopyalanmış ve adenoviral üretimi için adenoviral bir vektör içine subcloned [adenovirus serotip 5 (DE1/E3)] rekombinant adenovirus tarafından üretim şirketi. Virüs bölünmemeli ve-80 ° C'de saklı Viral stok titreleri 10 şirketi tarafından sağlanan 12-10 13 viral parçacıkların (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. In vitro adacık enfeksiyon, kullanın 10 6 PFU/mL, kaynaklanan enfeksiyon (MOI) yaklaşık bir çeşitlilik içinde yaklaşık 2 (bkz: tartışma Ayrıntılar için) için
  3. Pankreas adacıkları viral enfeksiyon
    Dikkat: Seviye 2 (BSL2) yordamlar ve sertifika adenovirüse bakın ile çalışma gerektirir. Kurumsal Biyogüvenlik memur rehberlik ve eğitim BSL2 prosedürler ile kontrol edin.
    1. İnsan/fare adacıkları yukarıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
    2. 2 ml (%10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile) CMRL kültür ortamının insan/fare adacıkları içeren her 35-mm Petri kabına için 5-10 µL hisse senedi şunun ekleyin.
      Not: şirket veri sayfası tarafından sağlanan viral titresi göre kullanılan virüs seviyesini ayarlamak.
    3. Kültür adacıkları, virüs içeren medya 37 °C/5% CO 2 24 h için
    4. 24 saat sonra virüs içeren medya Aspire edin ve 2 mL CMRL kültür medya (%10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile) yerine.
    5. Medya 3 günde yerine 37 °C/5% CO 2, 4-6 gün için adacıkları kültür.
    6. Sonra 4 - kültür, 6 gün civarında adacık hücreleri bulaşması için % 30'u bekliyoruz. Adacıkları-ebilmek o zaman var olmak kullanılmış canlı görüntüleme deneyler için.

2. Confocal görüntüleme, enfekte adacıkları

Not: Malzemeler tablo confocal görüntüleme için gerekli ekipman ve malzemeler için başvurmak.

  1. Reaktif hazırlık ve deneysel kurulum
    1. hazırlamak ekstraselüler çözüm: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, % 0,1 BSA, eklemek filtre pH 7.4, steril.
      Not: Bu tampon normal glikoz hazırlanır ve 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanabilir. Glikoz istenen son toplama ulaşmak için deneme günü eklenir.
      1. Hazırla Bazal glikoz (3 mM) orta: hücre dışı çözüm için 50 mL 2 M glikoz stokunun 75 µL ekleyin.
      2. Hyperglycemic (16 mM) orta: hücre dışı çözüm için 50 mL 2 M glikoz stokunun 400 µL ekleyin
    2. Herhangi bir ek uyarıcı (örneğin, KCl veya adenozin trifosfat (ATP)) 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözümde sulandırmak.
    3. Bir deney başlamadan önce Poli-D-lizin çözüm (1 mg/mL) 30 µL için 1 h için coverslip ekleyip iyice H 2 ile O. durulama Poli-D-lisin ile coverslips pretreat
      Not: Poli-lizin kaplı coverslips 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir.
    4. En az 1 saat önce 1 mL pipet kullanarak deney, adacıkları ile 3 mM glikoz hücre dışı solüsyon içeren 35-mm Petri kabına aktarın. Adacıkları 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de devam.
      Not: gerekirse, bu adımda plazma zarı etiketli. Plazma zarı etiketlemek için 2 µM di-8-ANEPP boya ile 3 mM glikoz hücre dışı çözüm ekleyin. 37 °C/5% CO 2 1 h için boya çözümde adacıkları kuluçkaya. Plazma zarı boya 488 heyecanlı nm ve 620 nm.
      5. bir deney başlamadan önce
    5. min vakum silikon gres ile sızdırmazlık tarafından coverslip görüntüleme odasına iliştirin. Görüntüleme platformu görüntüleme odasına düzeltmek. Bir pipet kullanarak adacıkları uygun 20 dakika süreyle yüzeye coverslip ve poli-D-lizin-tedavi alan üzerinde 20-30 adacıklar yer
      Not: Kurumasını adacık zarar görmemesi için coverslip izin önemlidir.
      6. Adacıkları coverslip için uygun iken
    6. iyice su ile durulama tarafından perfüzyon sistemi hazırlamak. Her çözüm için başka bir kanal eklemek: 3 mM glikoz (Kanal 1), 16 mM glikoz (2 kanal), 100 µM 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ve 10 µM forskolin (Kanal 3), 25 mM KCl 3 mM glikoz (Kanal 4), 3 mM glikoz (10 µM ATP ile 16 mM glukoz Kanal 5). Tüm kabarcıklar her kanalı ayrı ayrı açarak ve çözüm akışı için bir kaç dakika izin sistemden kaldırmak ve akışını tutarlı (0.5 mL/dak) ve tüp değil sızdırıyor emin olun.
    7. Tek satır içi çözüm ısıtıcı perfüzyon çıkış tüp bağlamak ve 37 outflowing arabellek sıcaklığını ayarlamak ° C.
    8. Emme pompası hazırlayın. Tüm kabarcıklar sistemden kaldırmak ve akışını tutarlı ve tüp değil sızdırıyor emin olun.
      9. Coverslip yüzeye adacıkları uygun bir kez
    9. yavaşça görüntüleme odasını 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm ile doldurun. Coverslip yüzey uzak adacıkları yıkama kaçının.
    10. Görüntüleme platformu mikroskop Sahne Alanı'na adacıkları ile yere takıp perfüzyon sistemi ve emme pompası bağlayın.
    11. Dönüş akışını ve sürekli adacıkları ile 3 G ekstraselüler eriyik sıvı. Sistem confocal görüntüleme için hazırdır.
  2. Confocal görüntüleme
    1. alt büyütme ile mikroskop alanındaki adacıkları bulun. Sonra adacıkları üzerinde duruldu, daha yüksek büyütme hedefleri için geçiş (örneğin, 63 X su daldırma amaç (63 X / 0.9 NA)).
    2. Yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak edinme açın ve rezonans tarayıcı kipi etkin kılın.
    3. XYZT görüntüleme modu seçin ve aşağıdaki gibi satın alma ayarlarını yapılandırın:
      1. çevirmek Argon lazer ve 488 nm lazer çizgi ve lazer güç pHluorin uyarma için % 50'ye ayarlayın.
      2. Toplamak emisyon, 505-555 nm.
      3. , 512 x 512 piksel çözünürlüğü seçin. Basın " Live " görüntüleme başlatın ve (tipik kazanç ise yaklaşık 600 V) kazanç düzeylerini ayarlamak için düğmesini.
      4. Ayarla BEGIN ve end z yığının: odak üstünde adacık ve seçin " başlangıç " ve son odaklı olabilir ve Seç uçak gitme " son ". 5 mikron z-adım boyutunu kullanın. Yazılım otomatik olarak confocal uçak sayısını hesaplar.
      5. Her z-yığın 1.5-2 s yakın edinimi için zaman aralığı ayarlarken ve seçeneği " durdurulana kadar elde " için sürekli düşsel.
      6. Basın " başlangıç " ini düğmetialize.
    4. Granül ekzositozu adacıkları ile istenen uyaranlara Ventriküler tarafından ikna etmek için çeşitli stimülasyon iletişim kurallarını kullanır. Stimulasyon protokolleri istenen bilimsel amaç (aşağıya bakın) uyacak şekilde özelleştirilebilir.
  3. Stimulasyon protokolleri
    Not: adacık arka plan etkinliği en az 2 dakika sürekli perfüzyon 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm ile kaydederek her stimülasyon Protokolü başlatın. Bir uyarıcı ile istenen süre için sıvı. Uyarıcılar sırasını, stimülasyon süresi yanı sıra kayıtları süresi istenen bilimsel amaçlar uyacak şekilde özelleştirilebilir. Yeni bir stimülasyon başlamadan önce 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm adacıkları iyice yıkayın emin olun. Aşağıda yöntemi yetenekleri göstermek için kullanılan örnek stimulasyon protokolleri bulabilirsiniz.
    1. Teşvik pHluorin pH duyarlılık ve viral enfeksiyon verimliliği ( şekil 3) pozitif kontrol olarak amonyum klorür (NH 4 Cl) ile: 3 mM glikoz (2 dk) → 50 mM NH 4 Cl (2 dk) 3 mM glikoz → 3 mM glikoz (2 dk)
      Not: ın NH 4 Cl çözüm, eski yerine koymak NaCl ekimolar bazda.
    2. Stimulate insülin granül ekzositozu glikoz konsantrasyonu ( şekil 5 ve şekil 6) artırarak: 3 mM glikoz (2 dk) → 16 mM glikoz (15-30 dakika) → 3 mM glikoz (2 dk
      Not: etkinlik birkaç patlamaları görmek için en az 15 dakika süreyle 16 G Çözümle sürekli adacıkları sıvı
      Not: salgı yanıt-e doğru 17 tutarlılığını artırmak için kullanıcıları kampı yükselterek ajanlar (100 µM IBMX ve 10 µM forskolin) 16 G ve 3 G çözüm ekleyebilirsiniz. Bu granül sekresyonunu zamansal şekillerinin değiştirmez. Ayrıntılar 15 ve tartışma için bkz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tüm iş akışı tekniği Resim 1' de gösterilen. Kısaca, fare veya insan adacıkları olabilir NPY-pHluorin kodlama adenovirus ile enfekte ve yansıma, kültür, confocal mikroskop altında birkaç gün sonra. Granül sigorta plazma zarı ve açık olarak, floresan bir artış görülmektedir ve sayısal (şekil 1). NPY-pHluorin gerçekten de insülin granül dynamics izlemek için uygun bir araç olup olmadığını belirlem...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu el yazması tarafından confocal mikroskobu sağlam pankreas adacıkları içinde beta hücrelerindeki insülin granülleri ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir bir teknik anlatılmaktadır. Bu NPY-pHluorin adenovirus klonlanmış floresan muhabir olarak yüksek transfection verimliliği sağlamak için kullanılır.

Yöntem bizim ellerimizde yüksek verimli olmasına rağmen öncelikle iki parametre bağlı bazı değişiklikler gerektirebilir: 1) adacık hazırlık ve viral ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Marcia Boulina yardım için çekirdek özelliği mikroskoplar sayesinde görüntüleme DRI dan teşekkür ederiz. Bu eser NIH hibe 1K01DK111757-01 tarafından (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 ve R56 DK084321 (AC) destek verdi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Upright laser-scanning confocal microscopeLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS-SP5includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamberWarner instrumentsRC-26
Imaging chamber platformWarner instrumentsPH-1
22 x 40 glass coverslipsDaiggerbrandG15972H
Vacuum silicone greaseSigmaZ273554-1EA
Multichannel perfusion systemWarner instrumentsVC-8
Single inline solution heaterWarner instrumentsSH-27B
Temperature controllerWarner instrumentsTC-324C
Peristaltic Suction pumpPharmaciaP-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treatedVWR10861-586
CMRL Medium, no glutamineThermoFisher11530037
FBS, heat inactivatedThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl solutionSigmaS5150
3 M KCl solutionSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
1 M HEPES solutionSigmaH0887
Vacuum filterVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917

Referanslar

  1. Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
  2. Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
  3. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  4. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
  5. Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
  6. Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
  7. Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
  8. Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478(2011).
  9. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  10. Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
  11. Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
  12. Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
  13. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  14. Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).
  15. Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
  16. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632(2015).
  17. Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
  20. Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
  21. Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
  22. Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  25. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel biyolojisay 127ins lin gran lekzositozupeptit YpHluorinpulsatil salg lanmaspankreas adac klaradenovirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır