Usando a láser Doppler Imaging y seguimiento para analizar la microcirculación de la médula espinal en ratas

Resumen

Aquí presentamos una combinación de perfusión Doppler laser imaging (LDPI) y Láser Doppler perfusión monitorización (LDPM) para medir espinal cordón flujos de sangre local y saturación de oxígeno (SO₂), así como un procedimiento estandarizado para la introducción de la médula espinal trauma en rata.

Resumen

Flujometría Doppler láser (LDF) es un método no invasivo para la medición de flujo (BF) de sangre, que hace que sea preferible para medir micro circulatorio alteraciones de la médula espinal. En este artículo, nuestro objetivo era utilizar imágenes de láser Doppler y monitoreo para analizar el cambio de BF después de lesión de la médula espinal. El escáner de imagen Doppler laser y el punta de prueba/monitor se emplearon para obtener en cada lectura. Los datos de LDPI proporcionan una distribución local de BF, que dio un panorama de perfusión alrededor del sitio de lesión y había hecho accesible para el análisis comparativo de BF entre diferentes ubicaciones. Midiendo intensamente la zona de sondeo sobre un período de tiempo, una sonda combinada fue utilizada para medir simultáneamente la saturación BF y el oxígeno de la médula espinal, mostrando el total de la médula espinal de la perfusión y suministro de oxígeno. LDF tiene algunas limitaciones, tales como flujo relativa, sensibilidad al movimiento y el cero biológico de la señal. Sin embargo, la tecnología ha sido aplicada en el estudio clínico y experimental debido a su configuración simple y rápida medición de BF.

Introducción

El tejido de la médula espinal es altamente vascularizado y extremadamente sensible a la hipoxia inducida por la lesión de la médula espinal (SCI). Nuestros estudios anteriores demostraron que el flujo de sangre de la médula espinal fue disminuyó significativamente después de conmoción cerebral lesión^1,2, que podría estar relacionado con el déficit de la función motora. Estudios recientes han demostrado que la integridad de los vasos sanguíneos después de SCI es bien correlacionada con la mejoría de la función motora sensorial³. Se ha divulgado que vascularidad mejorada podría rescatar de la materia blanca, indirectamente conduce a mejor función⁴. Por lo tanto, el mantenimiento de la perfusión de la lesión de la médula espinal parece ser de primordial importancia para preservar la viabilidad y funcionalidad.

Los efectos de varios tratamientos en perfusión después de SCI han sido examinados por numerosos investigadores usando una variedad de técnicas en modelos experimentales de SCI^5,6,7. Láser Doppler, como una técnica bien establecida, fue sin duda un método útil para la cuantificación de la perfusión en varios estudios animales y humanos^8,9,10,11. La técnica se basa en medir el desplazamiento Doppler¹² inducido mediante el movimiento de células de sangre rojas a la luz iluminar. Desde la comercialización de la técnica en la década de 1980, grandes progresos en la tecnología láser, fibra óptica y procesamiento de señales para medición de la perfusión por láser Doppler instrumentos¹³, que hizo LDF en una tecnología fiable.

En el presente estudio, se aplicaron ambos métodos de láser Doppler medición para evaluar el flujo de sangre (BF) en las médulas espinales de ratas conmoción. Debido a la naturaleza no invasiva de la tecnología y su configuración simple, el protocolo proporciona un método sensible, rápido y confiable para la medición de la BF de la médula espinal. Más importante aún, este método permite el estudio longitudinal de SCI post conmoción BF sin sacrificio de animales en cada momento.

Debido a la capacidad de evaluar la BF de los tejidos y los cambios rápidos de perfusión durante la estimulación, es posible aplicar este protocolo para evaluar cerebral BF^14,15 , así como medir otros tejidos como hígado^{16, 17},^18,de piel¹⁹e intestino²⁰. En un modelo de rata de oclusión transitoria de la arteria cerebral media, las lecturas de Doppler láser se utilizaron para asegurar la correcta reducción de la tasa BF a niveles que se espera en la penumbra isquémica¹⁴. En las ratas que han sido sometidos a inducción de isquemia (CLI) de crítica, de escaneo Doppler láser se aplicó para observar extremidades BF antes y después del procedimiento CLI y durante diferentes períodos después de tratamiento²¹. Además, la biodisponibilidad y la separación metabólica de algunos fármacos dependieron de BF hepática, que fue detectado por LDF¹⁶. Por lo tanto, LDF podía ser ampliamente utilizado en la evaluación de un modelo experimental, farmacodinámicas y farmacocinéticas.

Protocolo

Protocolos animales que involucran animales de experimentación siguieron las pautas establecidas por los institutos nacionales de salud (NIH) y fueron aprobados por el cuidado Animal y uso Comité Capital médica de la Universidad de.

Los procedimientos de introducción de SCI y medición BF de la médula espinal mediante láser Doppler equipo se describen a continuación fueron utilizados en un estudio publicado¹.

1. preparación para la cirugía

1. Preparar solución 3% (p/v) de pentobarbital sódico en solución salina y administrar a la dosis de 35 mg/kg.
   PRECAUCIÓN: pentobarbital sódico es una sustancia controlada. Deben mantenerse registros detallados y soluciones almacenan en un lugar seguro y bajo llave.
2. Esterilizar equipo y preparar el área de cirugía.
   1. Limpie el equipo de cirugía con los siguientes pasos: limpieza, autoclave a 121 ° C durante 30 minutos, luego secar en un horno de 60 ° C durante la noche del etanol del 75%. Esterilizar el área de cirugía con alcohol al 75%.

2. preparación de rata para la cirugía

1. Anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (35 mg/kg). Todo el procedimiento debe tomar 30-40 min, incluyendo cirugía, mediciones de BF y suturas.
2. Afeite la zona dorsal de la rata de la zona lumbar hasta el cuello. Se cortan el pelo tan corto como sea posible. Colocar la rata en a 40 ° C calefacción almohadilla para mantener una temperatura corporal constante.

3. laminectomía y la conmoción cerebral a la médula espinal

Nota: Para realizar laminectomía sólo para el grupo sham, siga los pasos 3.1 a 3.6.

1. Coloque el animal dorsal hacia arriba. Esterilizar la parte depilada con yodo seguido de alcohol del 75% con bolas de algodón estériles. Hacer una incisión en la piel (4 cm) con el bisturí sobre el sitio de laminectomía cubierta torácicas vértebras T7 a T11.
2. Cortar los músculos conectados a ambos lados de T8 a T10 para exponer las apófisis espinosas, las láminas y las articulaciones facetarias.
3. Utilizar el bisturí para hacer incisiones que desconexión al cruce entre T10 y T11. Además exponer a la ensambladura por cuidadosamente por disección de la capa muscular para exponer el hueso.
4. Utilice las tijeras para borrar más músculo de la lámina y en el pedículo con unas tijeras pequeñas. Se abrirá un pequeño espacio entre las vértebras en T10 y T11 (figura 1A). Lenta y delicadamente Inserte una pinza hemostática de esta brecha y romper el pedículo (figura 1B). Asegúrese de que la curvatura de las pinzas siempre se coloca lateralmente, lejos de la cuerda. Repita en el otro lado.
5. Exponer la médula espinal (figura 1) y levante y romper la lámina. Asegúrese de no dejar cualquier fragmento de hueso libre o irregulares.
6. Repita el proceso para quitar más láminas T9 y T8.
7. Mover el animal a la tabla de equipo del impactador y utilizar el par de pinzas de Adson agarradas a la mesa para estabilizar la columna vertebral del animal por fijación de la Apófisis espinosa de T7 y T11, luego ajustar la pinza para enderezar la columna vertebral (figura 1).
8. Poner al animal bajo el impactador, apunte la barra de ataque al centro de la médula espinal expuesta y baje la varilla para dentro de 3-5 mm de la superficie de la médula espinal.
9. Configurar los parámetros de impacto como la fuerza de impacto (160 KD) y tiempo (1 s)
   1. Induce el Lic haciendo clic en el botón "Iniciar el experimento" en la interfaz del software, después, haga clic en "sí" en la siguiente interfaz para iniciar automáticamente el impacto. Después del impacto, el software muestra los datos reales del impacto junto a los parámetros establecidos, verificar los datos para asegurarse de que estaba cerca del punto de ajuste (Figura 1E).
      Nota: Un signo típico para el éxito del experimento fue un período corto del movimiento de swing y extremidades cola involuntario después del impacto. Podrían hacerse también estímulos a la cola para comprobar para la reflexión de la extremidad. Sin embargo, es necesario para determinar la efectividad de la lesión inducida evaluación aparato locomotor como Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) escala locomotor^22,23 .

4. Láser Doppler análisis

1. Vea la Tabla de materiales para el información del escáner Doppler láser utilizado en este estudio. Para analizar la médula espinal expuesta, coloque el lado dorsal de la rata hacia arriba sobre un fondo negro, no-reflexiva.
2. Configurar los parámetros de exploración: Abra el software de escaneado, haga clic en "Medida" para entrar a la interfaz gráfica de usuario de medida y haga clic en el botón "Configuración del explorador" para abrir la interfaz de configuración del escáner. Para analizar las áreas pequeñas, como en este experimento, seleccionar "Alta resolución" bajo el "Scan tamaño y opciones de visualización" para un modo de digitalización fino con mayor resolución (256 × 256 puntos de cubierta 4 × 10 cm²) (figura 2A). Haga clic en la opción "Explorar imagen" para determinar los perímetros de exploración (figura 2B).
3. Haga clic en la opción "Distancia y vídeo" para ver la imagen en video directo. Coloque el escáner 10-13 cm por encima de la ventana quirúrgica y mover el fondo con el animal al centro de la médula espinal expuesta en la ventana de análisis (figura 2).
4. Utilice la función "auto distante" bien ajustar la altura del análisis, tenga en cuenta que la altura de exploración debe mantenerse constante a través de todas las medidas en el experimento 2 de la figura.
5. Utilizar una cubierta perdió la capacidad reflectora con una ventana para exponer solamente el área quirúrgico para minimizar el fondo y marcar la dirección del animal.
6. En la "repetición de Scan", establece el número de análisis (en este caso usamos análisis de repetición 8) haga clic en "Aceptar" para abrir la interfaz de exploración de la repetición. Haga clic en el botón start para iniciar la exploración y todo el proceso tomará aproximadamente 3-4 min (Figura 2D).

5. Láser Doppler control

1. Utilizamos a un monitor escáner con VP3 embotado sonda de aguja final entrega a monitor BF y SO₂ en el tiempo. Conecte la sonda Doppler de láser perpendicular a un instrumento estereotáctica para configurar el equipo de monitoreo.
2. Poner la rata en el lado dorsal del aparato estereotáxicas, arpillera al animal con un pequeño trozo de espuma de poliestireno cuando sea necesario a nivel de la médula espinal expuesta.
3. Baje la sonda a la médula espinal al monitor BF.
   Nota: Paso 5.3 es crucial para la reproducibilidad de la medición como las lecturas de datos son sensibles a la presión aplicada a la sonda, por lo tanto PRECAUCIÓN se requiere para no sobre - o debajo - position la sonda.
   1. Examinar la incisión y retire cualquier exceso líquido o sangre usando un disco de algodón estéril.
   2. Use ejes X e Y de los aparatos para localizar la sonda a rostral al punto central de la médula espinal expuesta de 2 mm o punto de lesión y evitar la vena central.
   3. Use el eje Z para bajar lentamente la sonda hasta el nivel apenas tocando la superficie de la médula espinal. La sonda sólo debe tocar la superficie de la médula espinal pero no tan floja para permitir cualquier luz brillante escapar del lado del punto de contacto.
4. Registro de datos
   1. Abra el software de adquisición de datos, haga clic en el botón "nuevo experimento" para abrir la interfaz de configuración. Bajo la opción "General" Compruebe la configuración del sistema y haga clic en "Siguiente" (Figura 3A), en la configuración de la pantalla Seleccione el canal de BF y SO₂ y haga clic en "Siguiente" (figura 3B).
   2. Información de archivo de entrada y haga clic en "Next" (figura 3) para entrar en la interfaz de grabación de datos, haga clic en el botón de triángulo verde para iniciar la grabación de datos de la sonda (figura 3D).
   3. Una vez que la señal es estables, de registros de datos durante 8 min consecutivos. Luego levante la punta de prueba y saque el animal aparato estereotáctica a suturar la incisión y poner el animal en cuidados postoperatorios.

6. suturas y cuidado después de la operación

1. Sutura de la incisión: Inserte una aguja de sutura en el músculo a ambos lados de la incisión. Tire del hilo a través de, reunir a los tejidos, lo que cubre la médula espinal expuesta en el sitio de láminas quitados. Usando el sostenedor de la aguja, tire del hilo todo a través de, forma tres nudos cuadrados y recorte el hilo como cerca de los nudos posibles.
2. Suturar la piel con 3-4 nudos cuadrados en la misma forma que la sutura de la incisión, luego recorte lo hilos aproximadamente 1 cm de los nudos.
3. Colocar la rata en su lado en su jaula, evitando el contacto entre el sitio de la cirugía y el fondo de la jaula. Jaulas deben colocarse sobre las almohadillas de calefacción.
4. Vigilar el animal hasta que despierta de la anestesia para asegurar que no hay sangrado después de la cirugía y que las suturas quedan cerradas.
5. Inyectar por vía subcutánea bencil penicilina sodio en rata durante 3 días después de la cirugía, 120 mg/kg / día. Inyectar por vía intraperitoneal buprenorfina (0,05 mg/kg) inmediatamente después de la cirugía y después de la cirugía de cada 6 horas durante 1 día.
6. Para asegurarse de que los animales tienen acceso a suficiente comida y agua, caben botellas de agua con caños extendidos y poner los alimentos cerca de los animales en la jaula.
   Nota: Realizamos escala de calificación de BBB para evaluar la función de aparato locomotor miembro posterior de lo animales 24 h posterior a la lesión para excluir a los animales con una calificación de BBB sobre 0, por lo tanto, garantizar que el animal estaba paralizado por la lesión inducida.
7. Después de la cirugía, proporcionar vacío manual de vejiga urinaria aplicando suavemente la presión en el abdomen dos veces al día, si es necesario.

Resultados

LDPI fue utilizado para medir el BF en la médula espinal, que a lo largo del eje rostral caudal de la médula espinal se cuantificó mediante la extracción de perfiles lineales (figura 4). Figura 5A y figura 5B representan la proyección de imagen del flujo de la médula espinal del grupo sham y grupo SCI, respectivamente. Figura 5 y figura 5

Discusión

Algunos detalles deben ser notados al realizar este protocolo. En primer lugar, el proceso de anestesia y la cirugía debe llevarse a cabo más rápida y elegante como sea posible para reducir al mínimo la tensión introducida al animal. Para reducir el disturbio a los resultados, mantener el animal en un estado relativamente Pacífico y estable. En segundo lugar, debe prestarse más atención al sangrado durante la medición con equipos de láser Doppler, ya que sangre potencialmente puede interferir con la lectura. Po...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser Doppler Line Scanner	Moor Instruments	moorLDLS2
Laser Doppler Monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF
Probe for Monitor	Moor Instruments	VP3	Blunt needle end delivery probe
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	IH-0400
Phenobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B-908
Syringe	Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd	300841
Surgical suture needles with thread	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		18T0329 (batch number) /4-0
Scalpel	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J11030 4#
Scalpel blade	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J12130 20#
Ophthalmic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	JD1040
Hemostatic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J31050
Benzyl penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd		F6072116 (batch number)
75% alcohol	Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd		150421R (batch number)
Iodine	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd		20170102 (batch number)
Rat	Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences		Sprague-Dawly (rat strain)