Usando Laser Doppler Imaging e acompanhamento para analisar a microcirculação na medula espinhal em ratos

Resumo

Aqui apresentamos uma combinação de perfusão de Doppler laser de imagem (LDPI) e do laser Doppler perfusão monitoramento (LDPM) para medir spinal cord fluxos de sangue local e saturação de oxigênio (SO₂), bem como um procedimento padronizado para a introdução da medula espinhal trauma no rato.

Resumo

Laser Doppler flowmetry (LDF) é um método não invasivo para a medição de vazão (BF) de sangue, que o torna preferível para medir microcirculatory alterações da medula espinhal. Neste artigo, nosso objetivo era usar imagem Laser Doppler e monitoramento para analisar a mudança de BF após lesão medular. Tanto o scanner de imagem Doppler laser e o sonda/monitor foram sendo empregadas para obter cada leitura. Os dados de LDPI fornecido uma distribuição local de BF, que deu uma visão geral de perfusão em torno do local da lesão e acessível para a análise comparativa de BF entre diferentes locais. Medindo-se intensamente a área de sondagem durante um período de tempo, uma sonda combinada foi usada para medir simultaneamente a saturação BF e oxigênio da medula espinhal, mostrando a perfusão global da medula espinhal e o suprimento de oxigênio. LDF em si tem algumas limitações, tais como fluxo relativo, sensibilidade ao movimento e zero biológico do sinal. No entanto, a tecnologia foi aplicada no estudo clínico e experimental, devido à sua configuração simples e rápida medição de BF.

Introdução

O tecido da medula espinhal é altamente vascularizado e extremamente sensível à hipóxia induzida pela lesão da medula espinhal (SCI). Nossos estudos anteriores mostraram que o fluxo de sangue da medula espinhal foi diminuiu significativamente após a concussão lesão^1,2, que pode estar relacionado com o défice de função motora. Estudos recentes têm mostrado que a integridade dos vasos sanguíneos, seguindo SCI é bem correlacionada com a melhoria da função motora sensorial³. Tem sido relatado que a vascularização melhorada pode resgatar matéria branca, indiretamente, levando à melhoria da função⁴. Portanto, a manutenção da perfusão pós-lesão medular parecia ser de primordial importância para a preservação da viabilidade e funcionalidade.

Os efeitos de diferentes tratamentos na perfusão após SCI foram examinados por numerosos investigadores usando uma variedade de técnicas em modelos experimentais de SCI^5,6,7. Laser Doppler, como uma técnica bem estabelecida, foi sem dúvida um método útil para quantificar a perfusão em vários estudos animais e humanos^8,9,10,11. A técnica baseia-se em medir o efeito Doppler¹² induzida movendo glóbulos vermelhos para a luz esclarecedora. Desde a comercialização da técnica no início de 1980, grandes progressos em tecnologia laser, fibra ótica e processamento de sinais para perfusão de medição por laser Doppler instrumentos¹³, que tornou LDF uma tecnologia confiável.

No estudo atual, os dois métodos de medição Doppler a laser foram aplicados para avaliar o fluxo sanguíneo (BF) nos espinais de ratos concussiva. Devido à natureza não invasiva da tecnologia e sua configuração simples, o nosso protocolo fornece um método sensível, rápido e confiável para medições de BF da medula espinhal. Mais importante, esse método permite o estudo longitudinal de BF post concussiva SCI sem sacrifício de animais em cada ponto de tempo.

Devido a capacidade de avaliar o BF do tecido e rápidas mudanças de perfusão durante a estimulação, é possível aplicar este protocolo para avaliar cerebral BF^14,15 , bem como medir outros tecidos como fígado^{16, 17},^18,de pele¹⁹e intestino²⁰. Em um modelo do rato de transitória oclusão da artéria cerebral média, as leituras de laser Doppler foram utilizadas para garantir a adequada redução da taxa para níveis que são esperados na penumbra isquêmica¹⁴BF. Em ratos que foram submetidos a indução de isquemia (CLI) membro crítico, varredura a laser Doppler foi aplicada para observar membros traseiros BF antes e após o procedimento CLI e durante diferentes períodos após tratamento²¹. Além disso, a biodisponibilidade e metabólico apuramento de algumas drogas dependiam BF hepática, que foi detectada por LDF¹⁶. Portanto, LDF pode ser amplamente utilizado na avaliação de modelo experimental, farmacodinâmicos e farmacocinéticos.

Protocolo

Animais protocolos envolvendo animais experimentais seguiram as diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health (NIH) e foram aprovados pelo Comitê de uso de Capital médica Universidade e cuidado Animal.

Os procedimentos de introdução de SCI e medição BF da medula espinhal, usando laser Doppler equipamentos descritos abaixo foram usados em um estudo publicado¹.

1. preparação para a cirurgia

1. Preparar o pentobarbital de sódio solução 3% (p/v) em solução salina e administrar a dose de 35 mg/kg.
   Cuidado: pentobarbital de sódio é uma substância controlada. Devem ser mantidos registros detalhados e soluções armazenados em um local seguro, trancado.
2. Esterilizar equipamentos e preparar a área de cirurgia.
   1. Para limpar o aparelho de cirurgia com as etapas a seguir: 75% etanol de limpeza, em seguida, autoclave a 121 ° C por 30 min, depois seque em um forno de 60 ° C durante a noite. Esterilize a área de cirurgia com 75% de álcool.

2. preparação do rato para cirurgia

1. Anestesia o rato com uma injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital (35 mg/kg). Todo o procedimento deve levar de 30 a 40 min, incluindo cirurgia, medições de BF e suturas.
2. Raspe a região dorsal do rato da parte inferior das costas para o pescoço. Os cabelos devem ser cortados mais curto possível. Coloque o rato sobre a 40 ° C Aquecimento pad para manter a temperatura corporal constante.

3. a laminectomia e o traumatismo da medula espinhal

Nota: Para executar laminectomia somente para o grupo farsa, siga os passos 3.1 a 3.6.

1. Posicione o lado dorsal animal acima. Esterilize a parte raspada com iodo, seguido de álcool 75% usando bolas de algodão estéril. Fazer uma incisão na pele (4 cm) com o bisturi no local de laminectomia cobrindo torácicas vértebras T7 a T11.
2. Corte os músculos anexados em ambos os lados de T8 T10 para expor os processos espinhosos, as lâminas e as articulações.
3. Use o bisturi para fazer incisões que desconectar a junção entre T10 e T11. Ainda mais expor a junção por cuidadosamente, dissecando a camada muscular fora para expor o osso.
4. Use a tesoura para limpar mais músculo longe da lâmina e próximo do pedículo com pequenos recortes. Isto irá abrir um pequeno espaço entre as vértebras em T10 e T11 (figura 1A). Lentamente e delicadamente inserir esta lacuna com uma pinça hemostática e quebrar o pedículo (figura 1B). Certifique-se que a curvatura da pinça está sempre posicionada lateralmente, longe da medula. Repita do outro lado.
5. Expor a medula espinhal (Figura 1) e levante com cuidado e quebrar a lâmina. Não se esqueça de deixar quaisquer fragmentos de osso livre ou irregulares.
6. Repita o processo para remover mais lâminas T9 e T8.
7. Mover o animal para a tabela de equipamento do pêndulo e usar o par de pinça Adson anexada à tabela para estabilizar a coluna vertebral do animal, fixando-se sobre o processo espinhoso de T7 e T11 e, em seguida, ajustar a pinça para endireitar a coluna vertebral (Figura 1).
8. Colocar o animal sob o pêndulo, Mire a vara de greve para o centro da medula espinhal exposta e abaixar a haste para dentro de 3 a 5 mm da superfície da medula espinhal.
9. Definir os parâmetros de impacto, tais como a força de impacto (160 KD) e tempo de interrupção (1 s)
   1. Induzir o SCI clicando no botão "Iniciar o experimento" sobre a interface do software e, em seguida, clique em "Sim" na interface do seguinte para iniciar o impacto automaticamente. Após o impacto, o software irá exibir os dados reais do impacto junto os parâmetros definidos, verifique os dados para certificar-se que era perto do ponto de ajuste (Figura 1E).
      Nota: Um sinal típico para o sucesso do experimento foi um curto período de movimento de balanço e membro de cauda involuntária após o impacto. Estímulos para a cauda para verificar se há reflexão membro também poderiam ser feitos. No entanto, avaliação motora como o Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) escala locomotora^22,23 é necessária para determinar a eficácia da lesão induzida.

4. laser Doppler digitalização

1. Consulte a Tabela de materiais para os detalhes do scanner a laser Doppler utilizado neste estudo. Para digitalizar a medula exposta, coloque o lado dorsal do rato sobre um fundo preto, não-reflexiva.
2. Configurar os parâmetros de digitalização: Abra o software de digitalização, clique em "Medida" para entrar na interface de usuário gráfica de medição e clique no botão "Configurar Scanner" para abrir a interface de instalação do scanner. Para digitalizar áreas pequenas como esta experiência, selecione "Alta resolução" sob o "Scan tamanho e opções de exibição" para um bom modo de digitalização com maior resolução (256 × 256 pontos cobrindo 4 × 10 cm²) (Figura 2A). Clique na opção "Varredura de imagem" para verificar os perímetros de varredura (Figura 2B).
3. Clique na opção "Vídeo e distância" para verificar a imagem de vídeo ao vivo. Posicione o scanner 10-13 cm acima da janela cirúrgica e mover o fundo com o animal para o centro da medula espinhal exposta na janela de digitalização (Figura 2).
4. Use a função "auto distante" bem ajustar a altura de digitalização, observe que a altura da digitalização deve ser mantida consistente em todas as medições no experimento Figura 2.
5. Use uma tampa nonreflective com uma janela para expor apenas a área cirúrgica para mais minimizar o plano de fundo e marcar a direção do animal.
6. Clique sobre o "Repita Scan", defina o número de exames (usamos 8 exames repetir neste caso) e clique em "Okey" para abrir a interface de verificação de repetição. Clique no botão Iniciar para iniciar a digitalização, e todo o processo levará aproximadamente 3-4 min (Figura 2D).

5. laser Doppler monitoramento

1. Nós usamos um monitor de scanner com Blunt VP3 sonda de entrega final de agulha para monitor BF e SO₂ ao longo do tempo. Anexe a sonda Laser Doppler perpendicular a um instrumento estereotáxica para configurar o equipamento de monitoração.
2. Colocar o rato no lado dorsal aparelhos estereotáxica, underlay o animal com um pequeno pedaço de isopor quando necessário nivelar a medula exposta.
3. Abaixe a sonda da medula espinhal para monitor BF.
   Nota: Passo 5.3 é crucial para a reprodutibilidade da medição como as leituras de dados são sensíveis à pressão aplicada à sonda, portanto, cuidado extra é necessário para não over - ou under - position a sonda.
   1. Examinar a incisão e remover qualquer líquido excessivo ou sangue usando uma almofada de algodão estéril.
   2. Use o eixo de X e Y do aparelho para localizar a sonda a 2 mm rostral ao ponto central da medula espinhal exposta ou lesão aponte e evitar a veia central.
   3. Use o eixo Z para abaixar lentamente a sonda ao nível apenas tocando a superfície da medula espinhal. A sonda deve apenas tocar a superfície da medula espinhal, mas não tão solto para permitir que qualquer luz brilhante escapar do lado do ponto de contacto.
4. Gravação de dados
   1. Abra o software de aquisição de dados, clique no botão "nova experiência" para abrir a interface de configuração. Sob a opção "General", verifique a configuração do sistema e clique em "Next" (Figura 3A), na configuração do Display, selecione o canal BF e SO₂ e clique em "Next" (Figura 3B).
   2. Informações do arquivo de entrada e clique em "Next" (Figura 3) para entrar na interface de gravação de dados, clique no botão triângulo verde para iniciar a gravação de dados da sonda (Figura 3D).
   3. Uma vez que o sinal está estáveis, registros de dados durante 8 min consecutivos. Então levante a sonda e retire o animal do aparelho estereotáxica para suturar a incisão e colocar o animal em cuidados pós-operatórios.

6. suturas e cuidados pós-operação

1. Suturar a incisão: inserir uma agulha de sutura do músculo em ambos os lados da incisão. Puxe o fio através de, puxando os tecidos juntos, cobrindo assim a medula espinhal exposta no local de lâminas removidos. Usando o suporte da agulha, puxe a linha inteira, através do formulário três nós de quadrado e corte a linha como perto de nós quanto possível.
2. Sutura da pele com 3-4 Praça nós da mesma forma como suturar a incisão e, em seguida, aparar a segmentos de aproximadamente 1 cm dos maçaricos.
3. Coloque o rato em seu lado em sua jaula, evitando o contato entre a cirurgia e o fundo da gaiola. As gaiolas devem ser colocadas em almofadas de aquecimento.
4. Monitore o animal até ele acorda da anestesia para não garantir que nenhum sangramento pós-operatório e que as suturas permanecem fechadas.
5. Injecte por via subcutânea benzil penicilina de sódio em ratos durante 3 dias após a cirurgia, 120 mg/kg por dia. Intraperitonealmente injete buprenorfina (0,05 mg/kg) imediatamente após a cirurgia e todos os pós-cirurgia de 6 horas por 1 dia.
6. Para certificar-se de que os animais têm acesso à comida e água suficientes, caber garrafas de água com bicos estendidas e coloque a comida perto do animal na gaiola.
   Nota: Realizamos escala de classificação BBB para avaliar a função locomotora de membro posterior da pós-lesão animal 24h para excluir os animais com uma pontuação de BBB acima de 0, portanto, assegurar que o animal estava paralisado pela lesão induzida.
7. Pós-operatório, fornecer manual vazio da bexiga urinária, suavemente, aplicando pressão sobre o abdômen duas vezes por dia, se necessário.

Resultados

LDPI foi usado para medir o BF na medula espinhal, que foi quantificada no eixo rostral-caudal da medula espinhal, extraindo perfis lineares (Figura 4). Figura 5A e Figura 5B representam a imagem de fluxo da medula espinhal do grupo farsa e grupo SCI, respectivamente. Figura 5 e Figura 5 representam o BF alterando ao longo do eixo rostral-ca...

Discussão

Alguns detalhes devem ser notados ao realizar este protocolo. Em primeiro lugar, o processo de anestesia e cirurgia deve ser realizado tão rapidamente e elegantemente quanto possível para minimizar o stress introduzido ao animal. Para reduzir os resultados de perturbações, manter o animal em um Estado relativamente Pacífico e estável. Em segundo lugar, deveria prestar mais atenção ao sangramento durante a medição usando laser Doppler equipamentos, desde que o sangue poderia potencialmente interferir com a leitu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser Doppler Line Scanner	Moor Instruments	moorLDLS2
Laser Doppler Monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF
Probe for Monitor	Moor Instruments	VP3	Blunt needle end delivery probe
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	IH-0400
Phenobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B-908
Syringe	Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd	300841
Surgical suture needles with thread	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		18T0329 (batch number) /4-0
Scalpel	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J11030 4#
Scalpel blade	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J12130 20#
Ophthalmic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	JD1040
Hemostatic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J31050
Benzyl penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd		F6072116 (batch number)
75% alcohol	Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd		150421R (batch number)
Iodine	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd		20170102 (batch number)
Rat	Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences		Sprague-Dawly (rat strain)