레이저 도플러 이미징 및 모니터링을 사용 하 여 쥐에서 척수 미세 분석 하

요약

여기 우리 레이저 도플러 관류 (LDPI) 이미징의 조합을 제시 하 고 소개 하는 척수에 대 한 표준화 된 절차 뿐만 아니라 국부 적으로 혈액 흐름과 산소 포화 (₂등), 코드 레이저 도플러 관류 모니터링 (LDPM) 척추를 측정 하 쥐에 외상입니다.

초록

레이저 도플러 flowmetry (LDF)를 측정 하는 척수의 microcirculatory 변경 시키는 혈액 흐름 (BF) 측정에 대 한 비 침 투 적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리의 목표 척수 부상 후 BF의 변화를 분석 하 레이저 도플러 영상 및 모니터링을 사용 했다. 레이저 도플러 이미지 스캐너와 프로브/모니터 각 판독을 고용 되 고. LDPI 데이터 부상 사이트 관류에 대 한 개요를 준 하 고 다른 위치 사이에서 BF의 비교 분석에 대 한 접근 했다 BF의 로컬 배포를 제공 합니다. 강렬 하지 시간 동안 검색 영역 측정, 결합 된 프로브 전체 척수 관류와 산소 공급을 보여주는 척수의 BF 및 산소 포화를 동시에 측정 하 사용 되었다. 자체 LDF 신호 감도 운동, 및 생물 학적 0 상대 플럭스, 같은 몇 가지 제한이 있다. 그러나, 기술은 그것의 간단한 설치와 BF의 빠른 측정 실험과 임상 연구에 적용 되었습니다.

서문

척수의 조직 매우 vascularized 이며 매우 민감한 척수 상해 (SCI)에 의해 유도 된 저 산소 증. 우리의 이전 연구 보여주었다 척수의 혈 뇌 진 탕 부상^1,2모터 기능의 적자에 관련이 있을 수 있습니다 후 크게 감소 했다. 최근 연구 결과 SCI에 따라 혈관의 무결성은 잘 상관 감각 모터 기능³의 개선 나타났습니다. 그것은 향상 된 vascularity 백색 질, 향상 된 기능⁴직접 이끌어 구출 수 있습니다 보고 되었습니다. 따라서, 포스트 상해 척수 관류의 유지 보수는 생존 능력 및 기능 유지에 대 한 기본 중요성의 것 처럼 보였다.

SCI 후 관류에 다양 한 치료의 효과 과학^5,,67의 실험 모델에서 다양 한 기법을 사용 하 여 수많은 수사에 의해 검사 되어 있다. 레이저 도플러, 잘 설립 된 기술로, 의심할 여 지 없이 여러 인간과 동물 연구^8,9,,1011에 관류 측정 하는 유용한 방법. 기술은 조명 빛에 붉은 혈액 세포를 이동 하 여 유도 된 도플러 이동¹² 측정 기반으로 합니다. 1980 년대 초반에 기술 상용화 이후 큰 진전이 했다 레이저 기술, 광섬유 및 관류 측정을 위한 신호 처리에서 레이저 도플러 기기¹³을 신뢰할 수 있는 기술에 LDF를 만든.

현재 연구에서 두 방법 모두 레이저 도플러 측정의 진 탕 쥐의 척수에 혈액의 흐름 (BF) 평가에 적용 했다. 기술과 그것의 간단한 설치의 비 침 투 적인 특성상 우리의 프로토콜은 척수의 BF 측정에 대 한 민감한, 신속 하 고 안정적인 방법을 제공 한다. 더 중요 한 것은,이 방법은 각 시간 지점에서 동물 희생 없이 BF 게시물 진 탕 SCI의 종 적 연구를 수 있습니다.

때문에 조직의 BF와 자극 동안 관류의 빠른 변화를 평가 하는 능력, 그것은 대뇌 BF^14,15 를 평가 하 고 측정 하는 다른 조직 간^16, 등이 프로토콜을 적용 하 ¹⁷, 피부^18,19, 그리고 창 자²⁰. 중간 대뇌 동맥의 일시적인 폐색의 쥐 모델에서 레이저 도플러 신호는 ischemic penumbra¹⁴에서 예상 되는 수준으로 BF 속도의 적절 한 감소를 위해 사용 되었다. 중요 한 사지 허 혈 (CLI) 유도 받은 쥐에서 레이저 도플러 검사 및 CLI 절차 후 전과 치료²¹후 다른 기간 동안 뒷 다리 BF 관찰에 적용 되었습니다. 또한, 생체 이용률 및 일부 약물의 대사 정리 LDF¹⁶에 의해 발견 되었다 간 BF에 달려 있었다. 따라서, LDF 실험 모델 pharmacodynamic, 및 pharmacokinetic 평가에서 널리 이용 될 수 있었다.

프로토콜

실험 동물 관련 된 동물 프로토콜 여는 국립 보건원 (NIH)을 설립 하는 지침을 따 랐 고 동물 관리 및 사용 위원회의 주요한 의학 대학에 의해 승인 했다.

문화를 도입 하 고 측정 하는 레이저 도플러 장비 아래에 설명 된 사용 하 여 척수의 BF의 절차는 게시 된 연구¹에서 사용 되었다.

1입니다. 수술을 위한 준비

1. 염 분에 pentobarbital 나트륨 솔루션 3% (w/v)을 준비 하 고 35 mg/kg의 복용량에서 관리.
   주의: pentobarbital 나트륨은 제어 물질 이다. 자세한 레코드를 보관 해야 하 고 안전 하 고 잠긴 위치에 저장 된 솔루션.
2. 장비를 소독 하 고 수술 영역을 준비 합니다.
   1. 다음 단계와 수술 장비를 청소: 75% 에탄올 청소, 다음 30 분 동안 121 ° C에 고압 다음 건조는 60 ° C 오븐에 하룻밤. 수술 지역 75% 알코올로 소독.

2입니다. 수술에 대 한 쥐의 준비

1. Pentobarbital 나트륨 (35 mg/kg)의 복 주사와 쥐 anesthetize 전체 절차는 수술, 봉합, BF 측정 등 30-40 분 소요 됩니다.
2. 목에 허리에서 쥐의 등 영역을 면도. 머리는 가능한 한 짧게 잘라 되어야 합니다. 일정 한 체온을 유지 하기 위해 패드를가 열 하는 40 ° C에 쥐를 놓습니다.

3. laminectomy 및 척수에 뇌 진 탕

참고: 가짜 그룹에 대해서만 laminectomy를 수행 하려면 다음과 같이 3.1에서 3.6.

1. 최대 동물 등 쪽 위치. 면도 부분 75% 알코올 멸 균 면봉을 사용 하 여 다음 요오드 소독. 흉부 척추 T7 T11 포함 laminectomy 사이트를 통해 메스로 피부 절 개 (4 cm)를 확인 합니다.
2. 잘라 연결 된 근육 양쪽에 T8에서 노출 하기, spinous 프로세스, 패싯 관절 T10.
3. 메스를 사용 하 여 T10, T11 사이 접합 분리 절 개를 만들기 위해. 더 신중 하 게 해 부 근육 층 떨어져 뼈를 노출 하 여 접합 하 여 노출 합니다.
4. 가 위를 사용 하 여 더 작은 자르는와 작은 꽃 자루는 lamina에서 안팎 근육을 취소. T10에서 척추와 T11 사이의 작은 공간 열립니다 (그림 1A). 천천히 그리고 민감하게이 간격으로 한 hemostatic 집게를 삽입 하 고 작은 꽃 자루 (그림 1B) 휴식. 집게의 곡률 코드에서 옆으로, 위치는 항상 다는 것을 확인 하십시오. 다른 측면에서 반복 합니다.
5. 척수 (그림 1C) 고 신중 하 게 해제 하 고는 lamina를 끊다. 반드시 하지 어떤 무료 또는 가변 뼈 파편을 남겨두고.
6. T9와 T8 하기를 더 제거 하는 과정을 반복 합니다.
7. 충돌 장비 테이블에 동물을 이동 하 고 테이블에 연결 된 Adson 집게의 쌍을 사용 하 여 t 7과 T11, spinous 프로세스에 클램핑 함으로써 동물의 척추를 안정 다음 척추 (그림 1D)을 집게를 조정.
8. 충돌에서 동물, 파업 막대 노출된 척수의 중심을 목표로 넣고 낮은 척수의 표면의 3-5 mm 이내에 막대.
9. 충격 힘 같은 충격 매개 변수 설정 (160 KD) 및 유지 시간 (1 s)
   1. 소프트웨어 인터페이스에서 "실험 시작" 버튼을 클릭 하 여 SCI는 유도 다음 영향을 자동으로 시작 하는 다음 인터페이스에 "예"를 클릭 합니다. 충격, 후 소프트웨어 설정된 매개 변수 옆에 있는 영향의 실제 데이터를 표시, 그것은 설정 포인트 (그림 1E) 가까운 되도록 데이터 확인.
      참고: 실험의 성공에 대 한 일반적인 표시는 충격 후 무의식적인 꼬리 스윙과 사지 운동의 짧은 기간 이었다. 사지 반사를 확인 하는 꼬리에 자극 또한 할 수 있었다. 그러나, 바소, 비 티, 그리고 Bresnahan (BBB) 운동 규모^22,23 등 운동 평가 유도 상해의 효과 결정할 필요가 있다.

4. 레이저 도플러 검사

1. 이 연구에 사용 되는 레이저 도플러 스캐너의 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 노출 된 척수를 검색 하려면 검정, 비 반사 배경에 쥐 등 쪽을 놓습니다.
2. 매개 변수를 검색 설정: 스캐닝 소프트웨어를 열고, "측정"를 측정 그래픽 사용자 인터페이스를 입력 하 여 스캐너 설정 인터페이스를 열 "스캐너 설정" 버튼을 클릭 클릭. 작은 지역 등이 실험을 검색 하려면 "고해상도"는 "스캔 크기 및 표시 옵션에서" 고급 검색 모드에 대 한 더 높은 해상도 (256 × 256 포인트 4 × 10 c m²를 덮고)를 선택 합니다 (그림 2A). 스캐닝 경계 (그림 2B)를 확인 하려면 "이미지 검색" 옵션을 클릭 하십시오.
3. "비디오 및 거리" 옵션 라이브 비디오 이미지를 확인을 클릭 합니다. 스캐너 위치 수술 창 고 이동 센터 검색 창 (그림 2C)에 노출 된 척수 동물 배경 위에 10-13 cm.
4. "먼 자동" 기능을 사용 하 여 잘 스캔 높이 조정, 스캔의 높이 모든 측정 실험 그림 2C에 걸쳐 일관성이 유지 되어야 한다.
5. 한 창 nonreflective 커버를 사용 하 여 추가 백그라운드를 최소화 하 고 동물의 방향 표시에 외과 영역을 노출.
6. "반복 스캔"을 클릭, 검사 (우리가 사용 8 반복 검사 경우에) 수를 설정 다음 반복 스캔 인터페이스를 열고 "확인"을 클릭 합니다. 검색을 시작 하려면 시작 버튼을 클릭 하 고 전체 과정 (그림 2D) 약 3-4 분 소요 됩니다.

5. 레이저 도플러 모니터링

1. 우리는 시간이 지남에 BF 등 등등₂ VP3 무딘 바늘 끝 배달 프로브 스캐너 모니터를 사용합니다. 모니터링 장비를 설정 하려면 stereotaxic 악기에 수직 레이저 도플러 프로브를 연결 합니다.
2. 올려 쥐 stereotaxic 기구 등 쪽 측에, 스티로폼 노출된 척수를 필요한 경우의 작은 조각으로 동물 아래에 배치 합니다.
3. 모니터 BF 척수에 프로브를 낮춥니다.
   참고: 단계 5.3는 데이터 수치는 조사에 적용 하는 압력에 민감한 측정의 재현성에 대 한 중요 한, 따라서 여분의 주의 필요를 하지 오버-또는 아래-위치 조사 합니다.
   1. 절 개를 검토 하 고 과도 한 액체 또는 혈액 메 마른 목화 패드를 사용 하 여 제거.
   2. 2 mm rostral 노출된 척수의 중심점에 프로브를 사용 하는 기구의 X 및 Y 축 또는 병 변 고 중앙 정 맥을 방지.
   3. Z 축을 사용 하 여 천천히 낮은 수준 그냥 감동 척수의 표면에 조사. 프로브는 너무 느슨한 하지에 접점의 측면에서 밝은 빛을 허용 하지만 척수의 표면을 터치 그냥 한다.
4. 데이터 기록
   1. 데이터 수집 소프트웨어를 열고, 설치 인터페이스를 열고 "새로운 실험" 버튼을 클릭 합니다. "일반" 옵션에서 시스템 구성에 대 한 확인을 클릭 합니다 "" (그림 3A), 디스플레이 설정에서 BF에 대 한 채널을 선택 등₂ 와 클릭 "다음" (그림 3B).
   2. 파일 정보를 입력 하 고 클릭 합니다 "" (그림 3C) 입력 데이터 기록 인터페이스를 조사 (그림 3D)에서 녹화를 시작 하려면 녹색 삼각형 버튼을 클릭 합니다.
   3. 일단 신호 8 연속 분 안정, 레코드 데이터입니다. 다음 프로브를 들어올리고 절 개를 봉합 하 고 수술 치료로 동물을 넣어 stereotaxic 기구에서 동물을 제거 합니다.

6. 봉합 및 사후 운영 관리

1. 절 개를 봉합: 절 개의 양쪽에 근육 봉합 바늘을 삽입. 조직을 함께 당기고, 그로 인하여 제거 하기의 사이트에 노출 된 척수를 덮고, 스레드를 당겨. 바늘 홀더를 사용 하 여 당겨 양식을 통해 전체 스레드 3 스퀘어 매듭 하 고 가능한 노트 주변으로 스레드를 트림.
2. 절 개, 봉합으로 같은 방법으로 3-4 광장 매듭을 가진 피부를 봉합 한 다음 노트에서 스레드 약 1 cm 트림.
3. 수술 사이트와 케이지 바닥 사이의 접촉을 피하고 그것의 감 금에 그것의 사이드에 쥐를 놓습니다. 감 금 소는 난방 패드에 배치 되어야 합니다.
4. 때까지 아무 수술 후 출혈을 보장 하기 위해 마 취에서 깨어나서는 봉합 폐쇄 남아 있는 동물을 모니터링 합니다.
5. 수술, 120 mg/kg 1 한 일 동안 벤 질 페니실린 나트륨 쥐에 피하 주사. Intraperitoneally에 1 일에 대 한 수술과 모든 6 시간 후 수술 후 즉시 Buprenorphine (0.05 mg/kg) 주사.
6. 동물 충분 한 음식과 물에 대 한 액세스 권한이 있는지 확인 하려면, 확장된 spouts와 물 병에 맞게 하 고 감 금 소에는 동물에 가까운 음식을 넣어.
   참고: 우리 실시 BBB 등급 규모 0, 위의 bbb 등급 점수와 함께 동물을 제외 하 동물 24 h 후 부상의 hindlimb 운동 기능 평가에 따라서 보장 동물 유도 부상으로 마비 되었다.
7. 수술 후 필요한 경우 부드럽게 복 부에 압력을 적용 매일 두 번, 오 줌 방광의 수동 빈 제공.

결과

LDPI 척수, 척수의 rostral 꼬리 축 선형 프로필 (그림 4)를 추출 하 여 계량 했다 BF 측정 하 사용 되었다. 그림 5A 와 그림 5B 가짜 그룹 문화 그룹의 척수의 유출 이미지를 각각 나타냅니다. 그림 5C 및 그림 5D 가짜 그룹 문화 그룹의 척수의 rostral 꼬리 축 변경 BF를 각...

토론

이 프로토콜을 수행할 때 몇 가지 세부 정보를 발견 한다. 첫째, 신속 하 고 우아하게 동물 소개 스트레스를 최소화 하기 위해 가능한 마 취와 수술의 과정 수행 되어야 합니다. 결과에 방해를 줄이기 위해, 동물 상대적으로 평화적이 고 안정적인 상태로 유지. 둘째, 혈액 잠재적으로 읽기를 방해할 수 있기 때문에, 레이저 도플러 장비를 사용 하 여 측정 하는 동안 출혈을 더 많은 주의 지불 합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser Doppler Line Scanner	Moor Instruments	moorLDLS2
Laser Doppler Monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF
Probe for Monitor	Moor Instruments	VP3	Blunt needle end delivery probe
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	IH-0400
Phenobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B-908
Syringe	Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd	300841
Surgical suture needles with thread	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		18T0329 (batch number) /4-0
Scalpel	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J11030 4#
Scalpel blade	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J12130 20#
Ophthalmic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	JD1040
Hemostatic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J31050
Benzyl penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd		F6072116 (batch number)
75% alcohol	Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd		150421R (batch number)
Iodine	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd		20170102 (batch number)
Rat	Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences		Sprague-Dawly (rat strain)