JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем сочетание лазера Doppler перфузии изображений (LDPI) и лазера Doppler перфузии мониторинг (ЛДПМ) для измерения спинного шнур местные кровь льется и насыщение кислородом (SO2), а также стандартизированные процедуры для введения спинного мозга травмы на крысу.

Аннотация

Лазерная доплеровская флоуметрия (LDF) является неинвазивным методом для измерения расхода (BF) крови, что делает его предпочтительным для измерения микроциркуляторных изменений спинного мозга. В этой статье нашей целью было использовать лазерные доплеровские визуализации и мониторинга для анализа изменения BF после травмы спинного мозга. Лазерный сканер Doppler изображения и зонд/монитор использовались для получения каждой индикации. LDPI данные местного распределения BF, который дал обзор перфузии вокруг места повреждения и сделали его доступным для сравнительного анализа BF между разных местах. Интенсивно измеряя зондирующего области в течение времени, комбинированный зонд был использован для одновременно измерения BF и кислорода насыщение спинного мозга, показывая общую спинного перфузии и снабжение кислородом. LDF, сам имеет несколько ограничений, например относительно потока, чувствительности к движению и биологических нулевой сигнал. Однако технология применялась в клинические и экспериментальные исследования из-за своей простой установки и быстрого измерения BF.

Введение

Ткани спинного мозга является весьма васкуляризированной и чрезвычайно чувствительны к гипоксии, Индуцированные Травма спинного мозга (SCI). Наши предыдущие исследования показали, что поток крови спинного значительно сократилось после сотрясения мозга травмы1,2, что может быть связано с дефицитом двигательной функции. Недавние исследования показали, что целостность кровеносных сосудов после SCI является хорошо связанный с улучшением сенсорной моторики3. Сообщается, что улучшение кровоснабжения может спасти белого вещества, косвенно приводит к улучшению функции4. Таким образом поддержание перфузии после травмы спинного мозга, как представляется, имеют первостепенное значение для сохранения жизнеспособности и функциональность.

Влияние различных методов лечения на перфузии после SCI были рассмотрены многочисленные следователей, с использованием различных методов в экспериментальных моделях SCI5,6,7. Лазерная допплер, как устоявшихся техника, был, несомненно, полезным методом для количественной оценки перфузии в нескольких исследований животных и человека8,9,10,11. Метод основан на измерении доплеровского сдвига12 индуцированных движущихся красных кровяных клеток в освещающей свет. После коммерциализации техники в начале 1980-х большой прогресс был достигнут в лазерной технологии, волоконной оптики и обработки сигналов для измерения перфузии лазера Doppler инструментов13, который сделал МСО в надежной технологии.

В текущем исследовании оба метода Лазерные доплеровские измерения были применены для оценки потока крови (BF) в спинальной шнуры шокирующий крыс. Благодаря неинвазивный характер технологии, и простой установки наш протокол обеспечивает чувствительных, быстрый и надежный метод для измерения BF спинного мозга. Что еще более важно этот метод позволяет лонгитюдное исследование BF пост шокирующий SCI без жертвоприношения животных в каждый момент времени.

Благодаря способности оценить BF ткани и быстрых изменений перфузии во время стимуляции можно применять этот протокол для оценки мозгового BF14,15 , а также измерения других тканей, таких как печень16, 17, кожи18,19и20кишечника. В мышиной модели временной окклюзии средней мозговой артерии Лазерные доплеровские чтений были использованы для обеспечения надлежащего сокращения темпов BF к уровням, которые ожидаются в ишемической полутени14. У крыс, которые претерпели индукции ишемии (CLI) нижних конечностей лазерного допплеровского сканирования был применен для наблюдения за задние конечности BF до и после процедуры CLI и в разные периоды после лечения21. Кроме того биодоступность и метаболических Распродажа некоторых препаратов зависит от печеночной BF, который был обнаружен на МСО16. Таким образом МСО могут использоваться широко в экспериментальной модели, фармакодинамика и фармакокинетические оценки.

протокол

Животных протоколы с участием экспериментальных животных следовать руководящим принципам национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и были одобрены животное уход и использование Комитета столицы медицинского университета.

В опубликованном исследовании1были использованы процедуры внедрения SCI и измерения BF спинного мозга с помощью лазера Doppler оборудование, описанные ниже.

1. Подготовка к операции

  1. Подготовить Пентобарбитал натрия раствор 3% (w/v) в солевой раствор и администрировать в дозе 35 мг/кг.
    Предупреждение: Пентобарбитал натрия идет о контролируемом веществе. Подробные записи должны храниться и решения хранятся в безопасной, запираемом помещении.
  2. Стерилизовать оборудование и подготовить области хирургии.
    1. Очистить хирургическое оборудование с помощью следующих шагов: 75% этанола, очистки, а затем Обработайте автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 30 мин, затем сушат в 60 ° C духовке на ночь. Стерилизуйте области хирургии с 75% алкоголя.

2. Подготовка крыса для хирургии

  1. Анестезировать Крыса с внутрибрюшинного введения Пентобарбитал натрия (35 мг/кг). Вся процедура должна занять 30-40 мин, включая хирургию, BF измерений и швы.
  2. Бритье спинной области крысы от нижней части спины на шее. Волосы должны быть сокращены как можно более коротким. Место крысы на 40 ° C, грелку для поддержания температуры тела постоянным.

3. Ламинэктомия и сотрясения мозга в спинной

Примечание: Выполните шаги 3.1 до 3.6 для ламинэктомии только для группы Шам.

  1. Положение животных спинной стороне вверх. Стерилизуйте бритая часть с йодом, следуют 75% алкоголя, используя стерильные ватные шарики. Сделайте разрез (4 см) с скальпель над Ламинэктомия сайт, освещающий позвонками T7 для T11.
  2. Вырежьте прилагаемый мышцы по обе стороны от T8 до T10 подвергать остистого отростка, пластинки и фасеточных суставов.
  3. Используйте скальпель, чтобы сделать надрезы, которые отключить стыке T10 и T11. Далее, тщательно разоблачить перекрестка, путем рассечения слой мышечной автомобиле подвергать кости.
  4. Используйте ножницы для дальнейшей очистки мышцы от пластинки и вокруг ножке с небольшой ножницы. Это позволит открыть небольшое пространство между позвонками в T10 и T11 (рис. 1A). Медленно и деликатно вставить один гемостатический пинцет в этот разрыв и разорвать ножке (рис. 1B). Убедитесь, что кривизны щипцы всегда располагается сбоку, от шнур. Повторите с другой стороны.
  5. Разоблачить спинного мозга (рис. 1 c) и аккуратно поднимите и разорвать пластинки. Убедитесь в том, чтобы не оставить любой свободный или неровными костных фрагментов.
  6. Повторите этот процесс для дальнейшего удаления T8 и T9 пластинки.
  7. Переместить животное в таблице оборудование ударного элемента и использовать пару щипцами Adson, присоединенные к таблице для стабилизации позвоночника животного путем зажима на остистых процесса T7 и T11, а затем отрегулировать щипцы для выпрямления позвоночника (рис. 1 d).
  8. Поставьте животное под ударного элемента, Цель забастовки стержня к центру подвергаются спинного и снизить стержня до в течение 3-5 мм на поверхности спинного мозга.
  9. Установить влияние параметры, такие как сила удара (160 KD) и время задержки (1 s)
    1. Побудить SCI, нажав на кнопку «Начать эксперимент» на интерфейс программного обеспечения, а затем нажмите кнопку «Да» на следующий интерфейс для автоматического запуска воздействия. После удара программное обеспечение будет отображаться фактические данные о воздействии рядом с заданными параметрами, проверить данные, чтобы убедиться, что он был близок к контрольной точке (Рисунок 1E).
      Примечание: Типичный знак для успешного проведения эксперимента был короткий период недобровольного хвост качели и конечности движения после удара. Стимулы к хвосту проверить для отражения конечности также может быть сделано. Однако необходимо определить эффективность индуцированных повреждений опорно оценки таких Бассо, Битти и Ласпейреса (BBB) опорно масштаба22,23 .

4. Лазерная доплеровского сканирования

  1. Смотрите Таблицу материалов для деталей Doppler сканер, используемые в данном исследовании. Для сканирования подвергаются спинного, место крыса спинной стороне вверх на фоне черный, антибликовое.
  2. Настроить параметры сканирования: Откройте программное обеспечение для сканирования, нажмите кнопку «Мера» ввести измерения графического интерфейса пользователя и нажмите на кнопку «Настройка сканера», чтобы открыть интерфейс установки сканера. Для проверки небольших районов, таких, как этот эксперимент, выберите «Высоким разрешением» под «Проверять размер и параметры отображения» для тонкой режим сканирования с высоким разрешением (256 × 256 точек охватывающих 4 × 10 см2) (рис. 2A). Нажмите на параметр «Сканировать изображения» для проверки сканирования периметра (рис. 2B).
  3. Нажмите на опцию «Видео и расстояние» для проверки живой видео изображения. Расположите сканера 10-13 см выше хирургического окно и переместить фон с животным в центр подвергается спинного мозга на окне сканирования (рис. 2 c).
  4. Используйте функцию «auto отдаленные» для тонкой настройки сканирования высоты, обратите внимание, что высота сканирования следует последовательно во всех измерениях в эксперименте Рисунок 2 c.
  5. Используйте nonreflective крышка с окном подвергать только хирургические области для дальнейшего минимизировать фон и Марк направление животного.
  6. Щелкните на странице «повторить поиск», установите количество сканов (мы используем 8 повторить сканирование в этом случае), а затем нажмите кнопку «ОК», чтобы открыть интерфейс повторного сканирования. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сканирование, и весь процесс займет около 3-4 мин (Рисунок 2D).

5. Лазерная допплеровская мониторинг

  1. Мы использовали мониторе сканера с VP3 тупой конец иглы доставки зонд монитор BF и так2 с течением времени. Прикрепите лазера Doppler зонд перпендикулярно стереотаксического инструмента для настройки мониторинга оборудования.
  2. Крыса на спинной стороне стереотаксического аппарата, подложки животное с небольшой кусок пенопласта при необходимости на уровне спинного мозга подвергаются.
  3. Нижняя зонд спинного монитор BF.
    Примечание: Шаг 5.3 имеет решающее значение для воспроизводимости измерения как чтения данных чувствительны к давление зонд, поэтому осторожность требуется для не более чем - или под - положения зонда.
    1. Изучить разрез и удалить любое чрезмерное жидкости или крови, используя стерильным ватным тампоном.
    2. Используйте аппарат осей X и Y, чтобы найти зонд до 2 мм ростральной к центральной точке подвергаются спинного или поражения точки и избежать центральной жилки.
    3. Используйте оси Z для медленно опустите зонд до уровня, просто касаясь поверхности спинного мозга. Зонд должен просто коснуться поверхности спинного мозга но не так свободно, чтобы разрешить любой яркий свет, чтобы бежать от точки контакта со стороны.
  4. Запись данных
    1. Откройте программное обеспечение получения данных, нажмите на кнопку «новый эксперимент», чтобы открыть интерфейс установки. Под «Общие» параметр проверки конфигурации системы и нажмите кнопку «Далее» (Рисунок 3А), в настройках дисплея выберите канал для BF и SO2 и нажмите кнопку «Далее» (рисунок 3B).
    2. Ввод сведений файла и нажмите кнопку «Далее» (рис. 3 c), чтобы войти в интерфейс записи данных, нажмите на кнопку зеленый треугольник, чтобы начать запись данных от датчика (рис. 3D).
    3. После того, как сигнал является стабильной, запись данных для 8 последовательных мин. Затем поднимите зонд и удалить животное из стереотаксического аппарата шов надрез и положить животное в послеоперационный уход.

6. швы и послеоперационный уход

  1. Шовные разрез: вставьте иглой шов мышц по обе стороны разреза. Протяните нить через, стягивая тканях, тем самым покрывая подвергаются спинного мозга на сайте удалены пластинки. Использование иглодержателя, потяните весь поток через форму три площади knots и обрезать нить как недалеко от узлов как можно.
  2. Шовные кожи с сучками площади 3-4 в так же, как ушивания разреза, а затем обрезать нитки примерно 1 см от узлов.
  3. Место на его стороне в своей клетке, избегая контакта между хирургии сайта и нижней клетке крыса. Клетки должен быть сделан на электрогрелки.
  4. Мониторинг животных до тех пор, пока он просыпается от анестезии для обеспечения нет кровотечения после операции и что швы остаются закрытыми.
  5. Подкожно вводить бензил пенициллин натрия в крыса для 3 дней после операции, 120 мг/кг в день. Внутрибрюшинно впрыскивают бупренорфин (0,05 мг/кг) сразу же после операции и послеоперационного каждые 6 часов за 1 день.
  6. Чтобы убедиться, что животные имеют доступ к достаточно пищи и воды, подходят бутылки воды с расширенной носики и положить еду близко к животное в клетке.
    Примечание: Мы провели BBB рейтинговой шкале оценить функцию опорно задних конечностей после травмы животного 24 h исключить животных с рейтингом BBB выше 0, поэтому обеспечение того, что животное была парализована индуцированных повреждений.
  7. После операции, предоставляют руководство пустой мочевой пузырь, мягко, применяя давление на живот, два раза в день, при необходимости.

Результаты

LDPI был использован для измерения BF в спинной мозг, который был количественно вдоль оси ростральной хвостового спинного мозга путем извлечения линейной профилей (рис. 4). Рисунок 5А и 5B рисунке представляют поток томограф?...

Обсуждение

Следует отметить некоторые детали при выполнении настоящего Протокола. Во-первых процесс анестезии и операции должны осуществляться быстро и элегантно, как можно свести к минимуму введенной стресс для животного. Чтобы уменьшить помехи на результаты, держите животное в состоянии отно?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы имеют без подтверждений.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Laser Doppler Line ScannerMoor InstrumentsmoorLDLS2
Laser Doppler MonitorMoor InstrumentsmoorVMS-LDF
Probe for MonitorMoor InstrumentsVP3Blunt needle end delivery probe
ImpactorPrecision Systems and InstrumentationIH-0400
Phenobarbital sodiumSigma-AldrichP3761
BuprenorphineSigma-AldrichB-908
SyringeBecton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd300841
Surgical suture needles with threadShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd18T0329 (batch number) /4-0
ScalpelOperation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J11030 4#
Scalpel bladeOperation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J12130 20#
Ophthalmic forcepsOperation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.JD1040
Hemostatic forcepsOperation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J31050
Benzyl penicillin sodiumNorth China Pharmaceutical Co., LtdF6072116 (batch number)
75% alcoholDezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd150421R (batch number)
IodineShandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd20170102 (batch number)
RatLaboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical SciencesSprague-Dawly (rat strain)

Ссылки

  1. Jing, Y. L., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Meliorating microcirculatory with melatonin in rat model of spinal cord injury using laser Doppler flowmetry. Neuroreport. 27 (17), 1248-1255 (2016).
  2. Jing, Y. L., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Melatonin prevents blood vessel loss and neurological impairment induced by spinal cord injury in rats. J Spinal Cord Med. , 1-8 (2016).
  3. Han, S., et al. Rescuing vasculature with intravenous angiopoietin-1 and alpha v beta 3 integrin peptide is protective after spinal cord injury. Brain. 133 (Pt 4), 1026-1042 (2010).
  4. Gerzanich, V., et al. De novo expression of Trpm4 initiates secondary hemorrhage in spinal cord injury. Nat Med. 15 (2), 185-191 (2009).
  5. Phillips, J. P., Cibert-Goton, V., Langford, R. M., Shortland, P. J. Perfusion assessment in rat spinal cord tissue using photoplethysmography and laser Doppler flux measurements. Journal of Biomedical Optics. 18 (3), 037005 (2013).
  6. Garcia-Lopez, P., Martinez-Cruz, A., Guizar-Sahagun, G., Castaneda-Hernandez, G. Acute spinal cord injury changes the disposition of some, but not all drugs given intravenously. Spinal Cord. 45 (9), 603-608 (2007).
  7. Brown, A., Nabel, A., Oh, W., Etlinger, J. D., Zeman, R. J. Perfusion imaging of spinal cord contusion: injury-induced blockade and partial reversal by β2-agonist treatment in rats. Journal of Neurosurgery-Spine. 20 (2), 164-171 (2014).
  8. Olive, J. L., McCully, K. K., Dudley, G. A. Blood flow response in individuals with incomplete spinal cord injuries. Spinal Cord. 40 (12), 639-645 (2002).
  9. Yamada, T., et al. Spinal cord blood flow and pathophysiological changes after transient spinal cord ischemia in cats. Neurosurgery. 42 (3), 626-634 (1998).
  10. Gordeeva, A. E., et al. Vascular Pathology of Ischemia/Reperfusion Injury of Rat Small Intestine. Cells Tissues Organs. , (2017).
  11. Liu, M., et al. Insulin treatment restores islet microvascular vasomotion function in diabetic mice. J Diabetes. , (2016).
  12. Drain, L. . The laser Doppler technique. , (1980).
  13. Rajan, V., Varghese, B., van Leeuwen, T. G., Steenbergen, W. Review of methodological developments in laser Doppler flowmetry. Lasers Med Sci. 24 (2), 269-283 (2009).
  14. Dohare, P., et al. The neuroprotective properties of the superoxide dismutase mimetic tempol correlate with its ability to reduce pathological glutamate release in a rodent model of stroke. Free Radic Biol Med. 77, 168-182 (2014).
  15. Bai, H. Y., et al. Pre-treatment with LCZ696, an orally active angiotensin receptor neprilysin inhibitor, prevents ischemic brain damage. Eur J Pharmacol. 762, 293-298 (2015).
  16. Vertiz-Hernandez, A., et al. L-arginine reverses alterations in drug disposition induced by spinal cord injury by increasing hepatic blood flow. J Neurotrauma. 24 (12), 1855-1862 (2007).
  17. Garcia-Lopez, P., Martinez-Cruz, A., Guizar-Sahagun, G., Castaneda-Hernandez, G. Acute spinal cord injury changes the disposition of some, but not all drugs given intravenously. Spinal Cord. 45 (9), 603-608 (2007).
  18. Li, Z., et al. Post pressure response of skin blood flowmotions in anesthetized rats with spinal cord injury. Microvasc Res. 78 (1), 20-24 (2009).
  19. Boyle, N. H., et al. Scanning laser Doppler is a useful technique to assess foot cutaneous perfusion during femoral artery cannulation. Critical Care. 3 (4), 95-100 (1999).
  20. Emmanuel, A. V., Chung, E. A. L., Kamm, M. A., Middleton, F. Relationship between gut-specific autonomic testing and bowel dysfunction in spinal cord injury patients. Spinal Cord. 47 (8), 623-627 (2009).
  21. Sheu, J. J., et al. Combination of cilostazol and clopidogrel attenuates rat critical limb ischemia. J Transl Med. 10, 164 (2012).
  22. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
  23. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A Sensitive and Reliable Locomotor Rating-Scale for Open-Field Testing in Rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  24. Oberg, P. A. Tissue motion--a disturbance in the laser-Doppler blood flow signal?. Technol Health Care. 7 (2-3), 185-192 (1999).
  25. Tenland, T., Salerud, E. G., Nilsson, G. E., Oberg, P. A. Spatial and temporal variations in human skin blood flow. Int J Microcirc Clin Exp. 2 (2), 81-90 (1983).
  26. Kernick, D. P., Tooke, J. E., Shore, A. C. The biological zero signal in laser Doppler fluximetry - origins and practical implications. Pflugers Arch. 437 (4), 624-631 (1999).
  27. Rudolph, A. M., Heymann, M. A. The circulation of the fetus in utero. Methods for studying distribution of blood flow, cardiac output and organ blood flow. Circ Res. 21 (2), 163-184 (1967).
  28. Dubory, A., et al. Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury. Jove-Journal of Visualized Experiments. (99), e52536 (2015).
  29. Kuliga, K. Z., et al. Dynamics of Microvascular Blood Flow and Oxygenation Measured Simultaneously in Human Skin. Microcirculation. 21 (6), 562-573 (2014).
  30. Li, Z. Y., et al. Post pressure response of skin blood flowmotions in anesthetized rats with spinal cord injury. Microvascular Research. 78 (1), 20-24 (2009).
  31. Muck-Weymann, M. E., et al. Respiratory-dependent laser-Doppler flux motion in different skin areas and its meaning to autonomic nervous control of the vessels of the skin. Microvasc Res. 52 (1), 69-78 (1996).
  32. Stefanovska, A., Bracic, M., Kvernmo, H. D. Wavelet analysis of oscillations in the peripheral blood circulation measured by laser Doppler technique. Ieee Transactions on Biomedical Engineering. 46 (10), 1230-1239 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены