Apoyo metabólico de suprimidos, los tejidos de cerebro vivos durante la adquisición de la microscopía de resonancia magnética

Resumen

El actual protocolo describe un método que los usuarios pueden mantener viabilidad de rebanada de hippocampal y cortical aguda preparados durante la recogida de datos de microscopia de resonancia magnética.

Resumen

Este protocolo describe los procedimientos necesarios para apoyar las funciones metabólicas normales de preparaciones de rebanada cerebral aguda durante la recogida de datos de microscopia de resonancia magnética (RM). Mientras que es posible realizar el Señor colecciones en tejidos de mamíferos vivos, suprimido, tales experimentos tradicionalmente se ven limitadas por la resolución y por lo tanto son incapaces de visualizar la microestructura del tejido. Por el contrario, señor protocolos que logró la resolución de la imagen microscópica requieren el uso de muestras fijadas para dar cabida a la necesidad de condiciones estática, inmutables sobre tiempos de exploración largos. El actual protocolo describe la primera técnica Sr. disponible que permite proyección de imagen de las muestras de tejido vivos, mamíferos en resoluciones microscópicas. Estos datos son de gran importancia para la comprensión de los cambios de contraste cómo basado en la patología que ocurre en la influencia de nivel microscópica el contenido de macroscópico Sr. exploraciones tales como utilizado en la clínica. Se realiza una vez tal entendimiento, métodos de diagnóstico con mayor sensibilidad y precisión pueden desarrollarse, que se traducirá directamente a tratamiento temprano de la enfermedad, control más preciso de la terapia y mejora los resultados del paciente.

Mientras que la metodología descrita se centra sobre los preparativos de rebanada del cerebro, el protocolo es adaptable a cualquier segmento del tejido suprimido se realizan cambios en los preparativos de gas y solución para acomodar necesidades metabólicas del tejido. Ejecución exitosa del protocolo debe resultar en preparaciones de rebanada viva y aguda que exhiben estabilidad de señal Señor difusión para periodos de hasta 15.5 h. Las principales ventajas del sistema actual sobre otros aparatos de perfusión compatible de Señor son su compatibilidad con el hardware de la microscopia de Señor necesario para lograr mayor imágenes de resolución y capacidad para proporcionar un flujo constante, ininterrumpido con cuidadosamente condiciones de solución regulada. Rendimiento reducido de la muestra es una consideración con este diseño como rebanada sola del tejido puede ser reflejada en un momento.

Introducción

Como sistemas de la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) han progresado constantemente a las intensidades de campo cada vez mayor, más detalles sobre la composición y el estado de los tejidos vivos son discernibles. A pesar de tales avances hardware, Sr. proyección de imagen en resolución suficiente para visualizar las estructuras celulares de los tejidos aún no está disponible en la clínica. Como resultado, características del nivel celular de los tejidos deben inferirse al considerar el contenido de análisis clínicos. Tal inferencia requiere el conocimiento de procesos equivalente recopilados a partir de datos tomados en sistemas modelo que pueden ser observados directamente. Tradicionalmente, estos modelos incluyen las células de los organismos acuáticos como los ovocitos de Xenopus laevis y Aplysia californica L7 neurona^1,2. Éstos estaban entre las primeras células animales disponibles para la observación con los métodos del Señor debido a su tamaño anormalmente grande: aproximadamente 1000 μm y 300 μm de diámetro, respectivamente. Más recientemente, han permitido avances en el diseño de hardware de uno de los más grandes ejemplos de células de mamífero, la α-motoneurona — a ser reflejada mediante técnicas de microscopía de Señor en tejido fijo^3,4. Aunque estos estudios demostraron la visualización directa de material celular mamífero Señor, las muestras fijadas empleadas difieren considerablemente en sus propiedades de Sr. de tejido vivo y por lo tanto no pueden servir como un modelo equivalente^{5, 6}. Más importante aún, observando cambios de contraste del Señor que se presentan en concierto con los complejos procesos biológicos requiere muestras de vida que pueden ser perturbadas y medidas a lo largo de la experiencia de proyección de imagen.

Para facilitar los estudios de la microscopia del Señor sobre los tejidos vivos, se presenta un protocolo que incluye microfilmes comercial hardware⁷ conectado a un propósito, señor compatible, en calibre oxigenador y dispositivo de perfusión descrito previamente⁸ . Las ventajas únicas de este diseño incluyen capacidades de resolución del nivel celular en tejidos mamíferos y control de precisión sobre el contenido de gas disuelto y el pH en el sitio de la perfusión del tejido. También, desemejante de la mayoría de los estudios de Señor de explante que interrumpir la perfusión durante la adquisición de imagen para evitar artefactos de flujo, este diseño apoya la utilización de perfusión continua durante la recogida de datos que se ha demostrado para mejorar la condición fisiológica de aislados los tejidos^9,10. Por último, su grabación cerrada Cámara slice-retención hardware ayuda y reducir la probabilidad de que los artefactos de movimiento que de lo contrario podría ocurrir durante prolongadas colección de imágenes.

Mientras que el actual protocolo describe los procedimientos adecuados para su uso con rebanadas hippocampal y corticales agudas, control preciso de solución metabolitos permite este sistema dar cabida a una amplia gama de tipos de tejidos diversos y condiciones experimentales. Limitaciones de este diseño incluyen una reducción en el rendimiento de la muestra en comparación con una perfusión de multicorte cámara¹¹; sin embargo, esta limitación puede superarse en el futuro mediante bobinas de múltiples arreglos de discos.

También, mientras que el sistema descrito puede emplearse en configuraciones horizontales o verticales, el protocolo actual cuenta con su uso en un orientación vertical, espectrómetro de 600 MHz. Cualquier sistema capaz de estudios Sr. microfilmes — típicamente narrow-bore (≤6 cm), espectrómetros de alto campo (≥500 MHz), acomodaremos el equipo oxigenador y perfusión descrito. Sin embargo, los cambios en la bobina de la proyección de imagen, degradado, sistema de sonda u otro hardware imagen esencial empleado pueden requerir alteraciones a los equipos de perfusión y Sr. exploración de parámetros.

Protocolo

todos los experimentos con animales se describe seguir las directrices establecidas en las Academias nacionales de Ciencias de la ' Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron revisadas y aprobadas por la Universidad de Florida ' s Cuidado institucional de los animales y el Comité uso (IACUC). Siga todas las reglas y regulaciones al participar en investigación animal tema.

1. preparación de solución para el mantenimiento de los tejidos del sistema nervioso Central

1. hacer fresco líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF).
   1. Para generar 2 L de solución tampón de bicarbonato aCSF, medir a 1.500 mL de agua purificada por doble destilación u ósmosis reversa en un frasco de 4 L. Colocar una barra de agitación magnética en el matraz y agite el líquido usando una placa de agitación.
   2. En el agua purificado, se disuelven las siguientes cantidades de sales: 14,03 g (120 mM) de cloruro de sodio, bicarbonato de sodio 4,37 g (26 mM), fosfato de potasio monobásico de 0,41 g (1,5 mM), 0,69 g (1,4 mM) sulfato de magnesio heptahidratado, calcio 0,59 g (2 mM) dihidrato del cloruro, 0,45 g (3 mM) de cloruro de potasio y glucosa de 3,6 g (10 mM).
      Nota: El contenido químico de la solución será diferente dependiendo de las necesidades metabólicas del tejido y las condiciones deseadas del experimento.
   3. Homogeneizar esta solución hasta que todas las sales se disuelvan. Ajustar el volumen de 2 L usando agua purificada adicional.
   4. Prueba la osmolalidad de la aCSF utilizando un osmómetro de depresión del punto de congelación. Ajustar a 300 mOsm/kg con sorbitol. Además de sorbitol 324 mg a 2 L de 299 mOsm/kg aCSF solución aumentará la osmolaridad 300 mOsm/kg (aproximadamente 1 mOsm por 324mg).
      Nota: La aCSF puede almacenarse a 4 ° C en un frasco hermético, cerrado por un período no debe exceder de 24 h.

2. Establecido por el sistema de perfusión

1. preparar la solución de la aCSF.
   1. ACSF equilibrar a temperatura ambiente (~ 23 ° C) mientras que gasear con carbogen 95% (95% O ₂, 5% CO ₂; 1/16 L/min) por propagación directa de no menos de 1 h.
      Nota: Tipos de tejido diferentes o deseadas condiciones experimentales pueden requerir el ajuste de los contenidos de gas o la temperatura de solución. Las condiciones deseadas para el contenido de gas disuelto en la solución pueden ser controladas precisamente variando las concentraciones porcentuales de los componentes individuales de la gas ( figura 1).
   2. Una vez que la aCSF alcanza la temperatura deseada y la saturación de carbogen, confirmar que el pH está en el rango fisiológico (7.3-7.4). Continúan gas burbuja directamente en el tanque de solución (1/16 L/min) durante todo el experimento con el fin de mantener el propio oxígeno disuelto contenido y condiciones de pH favorables para el metabolismo de tejido sano.
2. Prime las líneas de perfusión.
   1. Sumerja el tubo de entrada conectado a la bomba peristáltica de micro en la aCSF preparado (300 mOsm, pH 7.3-7.4, continuamente gaseado).
   Dispositivo de
   2. paso el oxigenador ( figura 2) y líneas de perfusión a través de ambos el imán agujero y bobina de gradiente pila (arriba abajo) y las bobinas a un lado hasta el montaje de la sonda. Colgar el oxigenador por encima de un vaso de precipitados para coger cualquier efluente aCSF.
      Nota: Dependiendo del diseño del sistema de MRI, las líneas de perfusión deba pasar a través del alesaje de imán y bobinas de gradiente o sonda cuerpo base antes de purgado del sistema con aCSF. Confirmar que colocación de la línea de perfusión no interferirá con la Asamblea del cuerpo de la sonda o la inserción de la sonda en el agujero antes de iniciar el procedimiento de cebado.
   3. Confirmar el caudal previsto (2 mL/min) es seleccionado y comenzar a llenar las líneas de perfusión de encender la bomba.
   4. Invertir la trampa de la burbuja vacía en línea para que aCSF desplazará el aire contenido dentro de.
   5. Conectar el oxigenador ' s gas puerto a una segunda fuente de carbogen (un colector o un cilindro secundario carbogen) y fijar un caudal de 1 / 16L/min
   6. Confirmar que carbogen está fluyendo sobre el oxigenador ' membrana de intercambio de gases s sumergiendo la lumbrera de escape en la parte superior el oxigenador en el agua.
   7. Una vez aCSF es detectado de la cámara de perfusión, purgar las burbujas de gas visible de las líneas de flujo por agitación manual.
   8. Confirmar el funcionamiento del oxigenador sumergiendo el electrodo de oxígeno en la aCSF que fluye de la cámara de perfusión.
      Nota: La lectura en el medidor de oxígeno debe aproximar el porcentaje de oxígeno contenido en el gas suministrado.

3. Preparación de tejido

1. eutanasia
   1. lugar una rata (125-150 g) en la cámara de inducción de una máquina de anestesia y exponer a 4% de isoflurano en un portador de oxígeno gas a una velocidad de 1 L/min durante 4 min.
   2. Quite la rata inconsciente de la cámara de anestesia.
   3. Pruebe righting reflex al colocar la rata en la posición supina. Busque cualquier movimiento — cabeza giro, elevación de piernas, columna vertebral flexión, etc. — indicativo que el animal se está convirtiendo en su estómago.
   4. Realizar una prueba reflexiva de parpadeo al tocar el ojo del animal utilizando un hisopo de algodón. Busque cualquier respuesta — tapa cierre, fasciculaciones musculares, etc. — a esta sensorial.
   5. Por último, realizar un test reflejo de retirar miembro pellizcando la piel entre los dedos de la rata ' s extendidos pata trasera usando pinzas o pinzas hemostáticas. Compruebe la flexión de la Leg
      Nota: en el caso de un resultado positivo reflexiva, no se debe proceder con la eutanasia.
   6. En caso de que cualquiera de las tres pruebas de reflejas produce una respuesta, devolver inmediatamente la rata a la cámara de anestesia y permite un adicional 2 min de exposición a 4% de isoflurano.
   7. Exámenes de todos tres reflexiva sobre en su totalidad. Repetir la exposición de anestesia de 2 min si es necesario y sólo procede una vez se ha observado una total falta de respuesta a todas las tres pruebas reflexivas.
   8. Eutanasia a la rata mediante decapitación guillotina.
2. Resección cerebral
   1. quitar el cerebro de la rata por disección bruta. Comience con la cabeza en la posición propensa. Con unas tijeras, cortar rostral a través de la piel de la parte posterior del cuello a la nariz y exponer el cráneo.
   2. Retirar los tejidos blandos de la superficie del cráneo con una sonda Roma.
   3. De trabajo desde el extremo caudal, quitar el occipital, parietal y los huesos frontales del cráneo usando gubias.
   4. Retraer la duramadre cortando a lo largo de la fisura longitudinal con micro tijeras y despegando la capa desde ambos hemisferios.
   5. Quitar el cerebro del cráneo girando la cabeza a la posición supina y cortar los nervios craneales en el lado ventral.
3. Segmento aislamiento
   1. el cerebro a la posición prona y aislar la porción central que contiene el hipocampo mediante la eliminación de todos los tejidos caudales a la fisura transversal y rostrales a la fimbria. Hacer dos cortes a lo largo de un plano transversal (es decir, cortes coronal) con una navaja de borde recto.
   2. Afijo el cerebro ' plano de más caudal de s al centro del baño vibratome corte usando el pegamento del cianocrilato.
   3. Agregar helado, carbogen burbujas aCSF al baño vibratome corte y colocar el hardware de retención de nylon en.
   4. Rodajas de corte 300 μm para obtener preparaciones de 3 a 4 rebanada usable por hemisferio (6 a 8 en total).
   5. Aislar un hipocampo o sección cortical de un hemisferio y recortar el trozo para que se ajuste al microcoil ' tejido de diámetro de 5 m m s bien.

4. Colocación y montaje de sistema de perfusión de la muestra

1. preparación de la bobina
   1. llene la microcoil ' cámara de tejido s con oxigenada aCSF desde el vibratome ' baño de corte de s con una pipeta de transferencia.
   2. Tomar la muestra de cerebro recortado y posición de la región de interés (ej. capa de células piramidales) sobre el microcoil de transcatheter usando un disección alcance.
   3. Inserte el dispositivo de retención de tejido (malla de nylon neto en arandela de nylon) para conservar la posición de la muestra durante todo el experimento de la proyección de imagen.
      Nota: Proceder rápidamente a través de la muestra procedimiento para minimizar la exposición a luz intensa de posicionamiento. Proporcionar aCSF oxigenada adicional según sea necesario utilizando una pipeta de transferencia.
2. Montaje de la en-agujerea oxigenador, microcoil de transcatheter y sonda
   1. asegure el microcoil modificada ( figura 3) en una mordaza de mesa y fije el dispositivo oxigenador en el agujero mediante la inserción de la clavija soporte de acetal en el agujero encima de la bobina.
   2. Sellar el sistema de perfusión mediante la colocación de la cámara de perfusión sobre el microcoil ' tejido s así y con cincha las dos juntas con un lazo de cable miniatura.
   3. Recortar el exceso de longitud de la atadura de cables usando cortadores de alambre.
      Nota: Sobre sellado exitoso, solución debe observarse saliendo a través de las líneas de salida y no hay fugas deben ser evidente alrededor de la goma de silicona de la cámara de perfusión. Para confirmar estas condiciones antes del montaje de la sonda podría resultar en serios daños al hardware de la proyección de imagen.
   4. Una vez aCSF puede verse gotas en el depósito de residuos, el microcoil de transcatheter y oxigenador y Anexe el montaje a la parte superior de la imagen corporal sonda.
   5. Deslice la pila de gradiente sobre la Asamblea y el gradiente en la cima de la punta de prueba del asiento. Fotografías detallando la posición relativa y adecuada conexión de la bobina, oxigenador y punta de prueba de componentes de hardware son proporcionados ( figura 4).

5. Realizar la colección de imágenes de Señor

1. Insertar la sonda montada en el imán del alesaje
   1. lugar el cuerpo de la sonda en proximidad cercana al espectrómetro dio apertura en la parte inferior del imán.
   2. Retraer el exceso de longitud de las líneas de perfusión a través del ánima de apertura en la parte superior del imán.
   3. Una vez que todos la holgura disponible ha sido tomado de las líneas de perfusión, avance del cuerpo de la sonda en el imán dio en la base mientras que simultáneamente quita más floja de las líneas de perfusión de la parte superior del alesaje.
   4. Enrosque los dos tornillos de fijación en la base de la sonda en las ranuras correspondientes de la pila de shim.
   5. Antes de continuar, compruebe que las líneas de perfusión no fueron atrapadas o dobladas durante la inserción de la sonda confirmando aCSF salida en el depósito de residuos.
      Nota: Si no se confirma la salida de la solución puede resultar en daño permanente a perfusión líneas y riesgos catastróficos daños a Sr. proyección de imagen hardware.
   6. En caso de que ninguna solución se ve salir de la línea de retorno en el depósito de residuos, retire el cuerpo de la sonda y confirmar que el flujo de solución ha reiniciado antes de intentar la reinserción. Un diseño esquemático del espectrómetro de sistema y la proyección de imagen de perfusión ensamblado ha sido descrito previamente ⁸.
2. El cuerpo de la sonda de conexión
   1. Conecte las líneas de agua de entrada y salida de la enfriadora gradiente.
   2. Encender la bomba para refrigerador de gradiente y confirme el ajuste de temperatura de agua (19 ° C).
   3. Conecte la manguera de aire de la unidad enfriadora de aire en el cuerpo de la sonda utilizando una abrazadera.
   4. La perilla del caudal en la unidad de enfriador de aire para el " 1 " posición.
   5. Fijar el alambre del termopar para el cuerpo de la sonda.
   6. Conecte el cable coaxial desde el preamplificador a la radiofrecuencia (RF) entrada/salida en el cuerpo de la sonda ' canal de protones (H) s.
   7. Conecte el cable de alimentación de los amplificadores gradiente al cuerpo sonda.
   8. Dentro de la RF gabinete, conecte la alimentación a la unidad de compensación de B0, todos los amplificadores gradiente tres (x, y, z) y la unidad principal.
3. Preparando el espectrómetro
   1. temperatura el agujero previsto mediante el módulo de ajuste de temperatura variable en la consola.
   2. Emparejar (impedancia) y sintonizar circuito (frecuencia) de la RF mediante el ajuste de los condensadores variables dentro de la sonda. Esto se logra mediante la manipulación de las varillas en la base del cuerpo sonda.
   3. Ajustar la configuración actual para el espectrómetro ' bobinas de espesor s para maximizar la homogeneidad del campo magnético en la muestra.
4. Colección de imágenes de comenzar
   1. recoger imágenes piloto para determinar la posición espacial de la muestra dentro del imán del alesaje. Parámetros típicos para dos dimensiones del eco del gradiente son los siguientes (TR/TE = 100/4 ms, promedio = 1, ángulo de pulso = 30 ^o, tiempo = 6 seg, matriz = 64 x 64, campo de visión = 0.3 x 0.3 cm, resolución = 47 x 47 μm).
   2. Recoger difusión-cargado pilotos para confirmar la exploración adecuada geometría y tejido posición si procede. Parámetros típicos para dos análisis piloto difusión-cargado dimensional son las siguientes (TR/TE = 2000/11.6 ms, tiempo = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, promedio = 1, b = 1200 (a partir de 1860) s/mm ², matriz = 64 x 64, campo de visión = 0.2 x 0.2 cm resolución = 31 μm).
   3. Recoge una serie de tiempo de difusión-cargada para determinar las características de estabilidad de la preparación de corte agudo. Parámetros típicos para una imagen de dos dimensiones difusión ponderada están la siguiente (TR/TE = 2000/11.6 ms, tiempo = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, promedio = 42, b = 1200 s/mm ², matriz = 64 x 64, campo de visión = 0.2 x 0.2 cm, resolución = 31 μm). Nota: Caracterización de la estabilidad en un sistema dado variará del protocolo descrito dependiendo de factores como el contraste de Señor empleado (por ejemplo, T1, T2, difusión, susceptibilidad), la perturbación física estudiada y el Señor cambio la señal por unidad de tiempo resultantes de perturbación, dijo.

Resultados

Preparación de la solución

Sobre empleo acertado del dispositivo de en-agujerea la oxigenación, gases presentes en el carbogen suministrado llega a 100% las condiciones de saturación en la solución de la aCSF. Esto puede demostrarse variando la concentración de oxígeno del gas suministrado y midiendo el cambio en el contenido de oxígeno disuelto en la solución de la aCSF dentro de la cámara de perfusión mediante un medidor (figura 1) de oxígeno⁸. Conforme a la ley de Henry, la cantidad de gas disuelto que está en equilibrio con una muestra de líquido es directamente proporcional a la presión parcial de ese gas, siempre que la temperatura permanezca constante¹². Con este conocimiento y precisión normas de gas, es posible cuantificar la cantidad de oxígeno disuelto dentro de una muestra de la aCSF como se describe. Esto se logra por calibrar el medidor de oxígeno utilizando soluciones saturadas (burbujeadas directamente durante 1 h o más) de la aCSF estar expuestos a gases de composición conocida: un gas con concentraciones elevadas de oxígeno como carbogen (95% O₂) y otro con bajo nivel de oxígeno concentración como el nitrógeno (0% O₂). Después, pueden tomarse medidas sumergiendo la punta del electrodo de oxígeno en una muestra. Confirmación que el oxigenador en-agujerea funciona correctamente se logra midiendo bien el efluente de la perfusión. El oxígeno disuelto por ciento medido por el medidor de oxígeno debe coincidir con la concentración porcentual de oxígeno en el gas de suministro. Si los valores medidos son inferiores a los de la de gas, esto sugeriría un fallo de hardware que podría conducir a una insuficiencia metabólica en la rebanada de tejido.

Comportamiento y el aspecto de la muestra

Preparaciones de rebanada aguda que reciben perfusión suficiente para suministrar metabolitos necesarios y llevar desechos metabólicos pronto llegar a un estado de relativa estabilidad. Desde ese punto, rebanadas agudos pueden ser sometidos a perturbaciones externas y sus respuestas a estos cambios pueden medirse para estudio científico. Para los experimentos del Señor, seguimiento de la señal de interés en el tiempo es una práctica comúnmente usada para demostrar la estabilidad relativa de rebanada aguda preparados¹³. La señal de difusión-cargada es especialmente sensible a los cambios en la movilidad de agua de un tejido, contenido y distribución, como se puede apreciar por el uso de este mecanismo de contraste para detectar infartos en Ictus isquémico^14,15. Trazar la señal de difusión normalizada con el tiempo en rebanadas corticales agudas mantenido bajo una variedad de condiciones de perfusión relativamente demuestra estabilidad (2 ± 3% más de 15.5 h) después de aislamiento de tejido (figura 5). Estabilidad de la señal de difusión se mantuvo independientemente de las condiciones de perfusión (intermitentes o continuo) o longitud de la exploración de MRI (corto [4 min] o [h 1,5] de largo)⁸. Si rebanadas no exhiben estabilidad de señal con el tiempo, tales como el aumento de la señal de difusión aguda observado en la corteza de la vida que no recibieron la perfusión, esto es sugestivo de condiciones experimentales subóptimas. Experimentos de perturbación no deben ser intentados antes de la confirmación de las condiciones de señal estable en preparaciones de la rebanada.

Además de la estabilidad de la señal, colocación correcta de la muestra se debe confirmar en el momento de la colección de imágenes. A pesar de que muestra posición es controlada durante la colocación del tejido en el microscopio de disección, cambios en la posición de la muestra pueden ocurrir durante el montaje de los aparatos de perfusión, o debido a la manipulación brusca de la sonda antes de la inserción en el imán o la bobina. Confirmación de la colocación correcta del hipocampo se logra recogiendo corta (2 min), pilot exploraciones con contraste de difusión (figura 6). Porque la capa de células piramidales es más sensible a la ponderación de difusión que las láminas hippocampal adyacentes, esta estructura aparece como una banda más oscura en imágenes difusión-cargadas. Configuraciones que no muestran esta característica contienen muestras fuera del centro y probablemente tendrá que repetirse.

Figura 1: Contenido de oxígeno del aCSF solución disuelto en función por ciento contenido en₂ O en gas suministrado. Mezclas de Carbogen que contienen concentraciones variables de oxígeno (95%, 60% y 19%) se emplean como fuente de gas. Lecturas de oxígeno disuelto por ciento son tomadas de la perfusión bien y comparadas con dos controles conocidos: un reservorio de solución directamente burbujas con carbogen (95% O₂) y un depósito de la solución expuesta a condiciones atmosféricas (23% O₂ ). En cada caso, la saturación de oxígeno por ciento en el sitio de enfoques perfusión de tejido 100% de la concentración de O₂ en la mezcla de carbogen utilizada. Barras de error son iguales a la desviación estándar de los medios de la muestra. Figura reproducida con permiso del original artículo⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: esquema de dibujo de la cámara en-agujerea oxigenador y perfusión. Este diagrama muestra el diseño detallado de elementos responsables de la función de estos dispositivos. Solución fresca que ha sido bombeada a través de una trampa burbuja entra en el oxigenador por la parte superior de un tubo de 10 mm NMR. De esta manera, las transiciones en un gas altamente tubo de silicona permeable (segmento azul) que está enrollado alrededor de un tubo de 5 mm NMR abierta, anidados dentro. CARBOGEN gas suministrado por la parte superior del tubo de 5mm incorpora el compartimiento a través del fondo abierto y pasa por el tubo de silicón en espiral antes de salir el oxigenador a través de un agujero de ventilación en la tapa del tubo de 10 mm. Durante esta exposición, la solución que fluye a través del tubo de silicona se satura con los componentes químicos de la mezcla de gas suministrada. Al salir el oxigenador, solución pasa directamente en la cámara de perfusión antes de entrar en la línea de retorno principal a un depósito de recogida de residuos. Otros componentes críticos para este diseño incluyen la clavija del soporte de acetal que permite el oxigenador colocarse verticalmente sobre el microcoil de RF modificada, una arandela de silicona (anillo rojo) que forma el sello hermético entre cámara de perfusión de oxigenador y tejido de microcoil bien y el cable de lazo muesca que acomoda la colocación de un lazo de cable utilizado para formar este sello reversible. Esta cifra ha sido modificada y reproducido con permiso del original artículo⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: modificaciones a la Asamblea de microcoil de transcatheter que permiten la interfaz para el oxigenador en calibre. Dos ranuras 3,0 x 1,5 mm (flechas negras) se cortaron en la parte de la Asamblea que acomodar la anchura de una sujeción de cable que se usa para sellar la cámara de perfusión. Un canal (15 x 3 x 4 mm) conecta los campos en toda la cara posterior de la bobina. Dos espacios de nylon colocan en los lados de la ley de la canal (flechas rojas) como un retén para la cabeza de amarre de cable que facilita el proceso de sellado. Perforar un orificio (2 x 14 mm) en la parte superior de la Asamblea de la bobina (arr amarilloujo) se une al acetal apoyo peg para asegurar el oxigenador. Esta cifra ha sido modificada y reproducido con permiso del original artículo⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: foto montaje detallando la posición relativa y ensamblaje correcto de microcoil, oxigenador y sonda componentes. Estas imágenes cuentan con componentes de hardware clave del dispositivo oxigenador y microperfusion en alesaje e ilustran cómo las distintas partes de interfaz uno con el otro. Foto de despiece (A) mostrando la posición relativa de todos los componentes antes de sellado de los tejidos bien o conjunto del cuerpo de la sonda. Se ha cuidado para mostrar la ubicación relativa de las piezas con precisión; sin embargo, una sección de las líneas de perfusión se duplicó nuevamente en esta serie para que todos los componentes encajen dentro del marco de imagen. (1 = cabeza de sonda, 2 = microcoil de transcatheter Asamblea, 3 = anillo de retención de tejido de nylon, 4 = bueno, perfusión 5 = atadura de cables, 6 = en-agujerea oxigenador, 7 = bobinas de gradiente, 8 = trampa de burbujas). (B) componentes después de bobina y oxigenador. En esta imagen, se ha colocado el anillo de retención de nylon en bien de tejido de microcoil para garantizar una muestra. La clavija del soporte de acetal en la base del oxigenador ha sido asegurada en el agujero correspondiente en la parte superior el microcoil. La Junta de silicona en el extremo abierto de la perfusión también se ha colocado sobre el pozo de tejido, y una sujeción de cable ha sido apretada alrededor de estos componentes para sellar la cámara de perfusión. Por último, la base del microcoil ha sido conectada a la parte superior de la cabeza de la sonda. (C) los componentes después de sonda. En el último panel, exceso de la longitud de la atadura de cables se ha recortado al ras con el microcoil. La pila de la bobina de gradiente es entonces empujar avanzando cuidadosamente el cilindro hacia la punta de prueba al pasar las líneas de exceso de perfusión, oxigenador y microcoil de transcatheter a través de su centro hueco. Una vez que los gradientes están conectados a la cabeza de la sonda, te mantiene en su lugar, girando el collar de fijación de la sonda sobre la base roscada de los gradientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: estabilidad de señal de difusión en rebanadas corticales agudas sobrefundidos. (A) valores de señal de difusión normalizada en cuatro rebanadas agudos sometidos a diferentes paradigmas superfusion se trazan con el tiempo por un período de hasta 21,5 h después de la eutanasia. Rebanadas de permanecen dentro de ± 5% de su medida de la señal de difusión inicial por un período de 15,5 h después la eutanasia sin importar si superfusion es continuo o intermitente e independiente de la duración de la exploración de Señor (1,5 h o 4 minutos). Grabaciones de señal tomadas de formaldehído-fija de la corteza sirven como control positivo (n = 1) para la estabilidad debido a la naturaleza de las muestras de tejido fijo estática, inmutable. Por el contrario, mide señal de difusión en un segmento vivo ausente de apoyo superfusion (n = 1) sirve como un control para la deficiencia metabólica. Experimento de parámetros de los distintos ensayos superfusion es como sigue: continua (superfusion siempre en tiempo por escaneo = 1,5 h), intermitente (superfusion en 10 min intervalo entre exploraciones, tiempo por escaneo = 1,5 h), largo intervalo, larga exploración (superfusion en durante la exploración, pero la pausa de 10 minutos entre las exploraciones, tiempo por escaneo = 1,5 h), largo intervalo, breve análisis (superfusion en para el intervalo entre las exploraciones, 1,5 h tiempo por escaneo = 4 minutos). (B) grupo de proyección de datos analizadas medios de los cuatro experimentos superfusion rebanada en vivo desde el panel (A). La difusión de la señal Perfil de agrupados, rebanadas corticales sobrefundidos exhibe poca variación con el tiempo (2 ± 3% sobre 15,5 h) mientras que el control sin perfusión (n = 1) exhibe inestabilidad de señal dramática en el experimento (15% por 6,5 h). Esta cifra ha sido modificada y reproducido con permiso del original artículo⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: confirmación de la colocación de hippocampal rebanada durante la proyección de imagen de piloto. Antes de ejecutar a un señor extendida sesión de microscopía, correcta colocación de la muestra es crítico para asegurar recursos tales como tiempo de scanner y costosa solución aditivos no se desperdicien. La capa de células piramidales de la región CA1 del hipocampo puede visualizarse en más rápido (minuto 4,3), menor análisis piloto resolución (μm 31 x 31 μm en el plano) para el tejido de interés se coloca correctamente en relación con la bobina del micro. Parámetros de análisis común a ambas imágenes son las siguientes: TR/TE = 2000/11.6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, promedio = 1. (A) b = 0 (227 eficaz) s/mm². En esta exploración preliminar, el pyramidale del estrato es apenas visible como un gris, banda diagonal en Perfil de excitación de la bobina. (B) b = 1.200 (1.860 eficaz) s/mm². A mayor difusión contraste equilibrado, interlaminar aumenta a medida que la capa de células piramidales se convierte en más oscura que los tejidos de las láminas adyacentes (arriba: estrato oriens; abajo: estrato radiatum). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El actual protocolo describe los procedimientos necesarios para el mantenimiento metabólico estándar de preparaciones de rebanada cerebral aguda sometidos a microscopía de resonancia magnética. Este procedimiento es el único método disponible que permite la visualización de los tejidos mamíferos vivos con Sr. resoluciones capaz de resolver las células. Mientras que las condiciones de solución descritas son adaptadas específicamente a los tejidos del sistema nervioso central, el protocolo es ampliamente adaptable a cualquier forma de vida preparación de tejido a través de ajustes de los componentes de la solución y de gas así como flujo de perfusión y la temperatura.

Los problemas más comunes probablemente encontrarse durante los procedimientos descritos son los relacionados con fallas en el suministro de metabolito. Precipitación de sales de calcio puede ocurrir dentro de la aCSF durante escasez gaseosa como resultado de fallas en el bicarbonato sistema de buffering. Estos precipitados pueden obstruir las líneas de perfusión y causar daños graves de hardware. Si se observan precipitados sal en la solución después de sonda, Cesar la perfusión flujo inmediatamente apagando la bomba peristáltica. Confirman presencia de suficientes niveles de bicarbonato de sodio (4,37 g/2 L) en solución, los niveles de CO₂ (5.0%) en el suministro de gas y el flujo de gas de carbogen (1/16 L/min) en embalse y oxigenador. Por último, confirmar los niveles de pH se estabilizaron en el rango fisiológico (7.3-7.4). En caso de que los niveles de oxígeno gas y pH no todavía están regulados adecuadamente, debe reemplazarse la membrana de intercambio de gases.

Si rebanadas no exhiben estabilidad de señal sobre el tiempo-curso experimental, confirmar que los componentes químicos correctos están presentes en la mezcla de la aCSF y que se mantuvieran la correcta osmolaridad (300 mOsm) y pH (7.3-7.4). Además, asegúrese de carbogen gas está conectada al depósito de la solución y oxigenador en 1/16 L/min. Si estos pasos no corrige las condiciones de la solución, se recomienda el reemplazo de la membrana de intercambio de gases. Si no se logra la estabilidad tisular después de las condiciones de solución de solución de problemas, considere refinamiento del protocolo quirúrgico con un enfoque en minimizar el intervalo entre aplicación de cosecha y perfusión del tejido.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusate Preparation
Osmette A	Precision Systems Inc.	5002	freezing point depression osmometer
Stir Plate Type 1000	Barnstead/Thermodyne	SPA1025B	magnetic stir plate with heating element
Accumet Basic pH Meter	Fisher Scientific	AB15	pH Meter
pH Probe	Fisher Scientific	13-620-AP61	probe for pH measurement
Oxygen Meter	Microelectrodes Inc.	OM-4	meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates
Oxygen Electrode	Microelectrodes Inc.	MI-730	microprobe for the oxygen meter
Scale	Denver Instrument Co.	A-160	microscale for weighing chemical components
Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Preparation
Lancer Vibratome	Ted Pella Inc.	Series 1000	vibratory tissue slicer
Disecting Microscope	Carl Zeiss Inc.	OPMI 1-FC	tabletop, binocular disecting microscope
Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion System
Masterflex L/S	Cole-Parmer	7523-50	peristaltic micro perfusion pump
Oxygen Regulators x 2	Victor Medical	VMG-05LY	device for regulating gas flow
e-sized carbogen cylinders x 2	Airgas		gas tanks containing carbogen gas
in-bore oxygenator	developed in house		device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate
Name	Company	Catalog Number	Comments
MR Imaging Hardware
Micro Surface Coil (200mm dia., modified)	Bruker Biospin	B6371/0001	four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil
Micro 5 probe body	Bruker Biospin	Z3395	microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer
Micro 5 gradient coils	Bruker Biospin	M81111	gradient coil stack used with micro 5 probe body
600 MHz Spectrometer	Oxford Instruments		superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation
Imaging Console	Bruker Biospin	Avance III	support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation
Air Blower	Bruker Biospin	BCU-II, -80/60	Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore
Gradient Chiller	Thermo Scientific	Neslab Merlin M33	Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils