Метаболические поддержке подакцизным, живые ткани мозга во время приобретения микроскопии магнитного резонанса

Резюме

Текущий протокол описывает метод, по которому пользователи могут поддерживать жизнеспособность острый срез гиппокампа и корковые препаратов во время сбора данных магнитного резонанса микроскопии.

Аннотация

Этот протокол описывает процедуры, необходимые для поддержки нормальных метаболических функций мозга, острый срез препаратов во время сбора данных микроскопии магнитный резонанс (МР). Хотя это можно выполнять г-н коллекций на живых, подакцизным млекопитающих ткани, такие эксперименты традиционно были ограничены пределы резолюции и таким образом не способны визуализации микроструктуры ткани. И наоборот Мистер протоколы, которые удалось достичь микроскопических изображений требуется использование фиксированных образцов, чтобы удовлетворить потребность для статических, неизменные условия более длительные проверки раз. Текущий протокол описывает первый доступных MR технику, которая позволяет изображений образцов ткани жизни, млекопитающих в микроскопических резолюций. Такие данные имеют чрезвычайно большое значение для понимания как на основе патологии контраст изменения, происходящие на микроскопическом уровне влияние содержание макроскопических MR сканирования таких используемых в клинике. После такого понимания реализуется, методы диагностики с большей чувствительностью и точностью может быть превращено, который будет переводить непосредственно к ранее лечение заболеваний, более точного мониторинга терапии и улучшения результатов лечения пациентов.

Хотя описанные методики фокусируется на препараты срез мозга, протокол адаптируется к любой фрагмент подакцизным ткани учетом того, что изменения вносятся в газ и perfusate подготовку для удовлетворения конкретных метаболических потребностей ткани. Успешное выполнение протокола должно привести к жизни, острый срез препараты, которые exhibit MR распространения сигнала стабильности для периодов до 15,5 ч. Основными преимуществами нынешней системы над другими MR совместимый перфузии аппараты являются его совместимость с оборудованием микроскопии MR, необходимых для достижения выше разрешение изображения и способность обеспечить постоянный, непрерывный поток с тщательно регулируемые perfusate условий. Сокращенной пробы пропускная способность — это рассмотрение с этой конструкции, как кусочек ткани только один может быть imaged одновременно.

Введение

Как магнитно-резонансная томография (МРТ) системы неуклонно продвинулись прочностями поля все выше и выше, более подробную информацию о составе и состоянии живых тканей стали заметной. Несмотря на такие успехи оборудования Мистер изображений в резолюции достаточно для визуализации клеточных структур тканей еще не доступен в клинике. В результате сотовой уровне характеристики тканей должна быть выведен при рассмотрении содержание клинических сканирования. Такое определение требует знания эквивалентных процессов, почерпнутые из данных в модели систем, которые можно наблюдать непосредственно. Традиционно эти модели включают клетки от водных организмов, таких как Xenopus laevis ооцитов и Аплизия californica L7 нейрон^1,2. Они были среди первых животных клеток, доступных для наблюдения с MR методами из-за их типично большой размер: примерно 1000 мкм и 300 мкм в диаметре, соответственно. Совсем недавно, достижений в области дизайна оборудования позволили для одной из крупнейших примеров mammalian клеток — α-двигательного нейрона — к записи образа, используя методы микроскопии MR на фиксированной ткани^3,4. Хотя эти исследования продемонстрировали прямая визуализация млекопитающих клеточного материала с помощью MR, фиксированная образцы занятых существенно отличаются в их господин свойства из живой ткани и таким образом не может служить эквивалент представитель модель^{5, 6}. Что еще более важно наблюдения MR контраст изменений, которые происходят в концерте с сложных биологических процессов требует живых образцов, которые могут быть возмущенных и измеряется в течение изображений эксперимента.

Для облегчения MR микроскопии исследования на живые ткани, протокол представлен, которая включает в себя коммерческие microimaging оборудования⁷ интерфейсом специально, совместимы, в родила Оксигенатор MR и перфузии устройство описано ранее⁸ . Уникальные преимущества этой конструкции включают возможности сотовой уровне резолюции тканей млекопитающих и точного контроля над содержанием растворенного газа и рН на сайте перфузии тканей. Кроме того в отличие от большинства экспланта MR исследований, которые прервать перфузии во время захвата изображений чтобы избежать артефактов потока, этот дизайн поддерживает использование непрерывного перфузии во время сбора данных, которое было показано для улучшения физиологического состояния изолированные тканей^9,10. И наконец его закрытые записи камеры и ломтик сохранение оборудования помощи в снижения вероятности артефакты движения, которые могут возникнуть во время затяжной коллекции изображений.

В то время как текущий протокол описывает процедуры, подходящие для использования с острой гиппокампа и корковые ломтиками, точный контроль над perfusate метаболитов позволяет этой системы для размещения широкий спектр типов различных тканей и экспериментальных условиях. Ограничения этого дизайна включают в себя сокращение образца пропускной способности по сравнению с многослойная перфузии палатой¹¹; Однако это ограничение можно преодолеть в будущем с использованием мульти катушки массивы.

Кроме того хотя описанная система может использоваться в горизонтальной или вертикальной конфигурации, текущий протокол особенности ее использования в вертикально, спектрометр 600 МГц. Любая система, способная исследований г-н microimaging — обычно узкие родила (≤6 см), спектрометры высокое поле (пола≥500 МГц) — разместятся описано оборудование Оксигенатор и перфузии. Однако изменения изображений катушки, градиент, зонд системы или других необходимых изображений оборудования занятых может потребовать изменений перфузии и г-н проверки параметров.

протокол

описал все эксперименты на животных следовать руководящим принципам, изложенным в национальных академий наук ' руководство для ухода и использования лабораторных животных и были рассмотрены и одобрены в университете Флориды ' s Институционального ухода за животными и использования Комитет (IACUC). Следуйте все применимые правила и положения, когда участие в животных исследования.

1. Подготовка Perfusate для поддержания тканей центральной нервной системы

1. сделать свежий искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО).
   1. Для создания 2 Л perfusate гидрокарбонатно амортизированное фаго, отмерить 1500 мл очищенной путем двойной дистилляции или обратного осмоса в колбе 4 Л воды. Магнитные перемешать бар в колбу и агитировать жидкости с помощью пластины перемешать.
   2. В очищенную воду, распустить следующее количество солей: 14.03 г (120 мм), натрия хлорида, 4.37 g (26 мм) бикарбоната натрия, фосфат монокальций калия 0,41 g (1,5 мм), 0,69 г (1,4 мм) магния сульфата гептогидрата, 0,59 г (2 мм), кальция хлорид дигидрат, хлорид калия 0,45 г (3 мм) и глюкоза 3,6 г (10 мм).
      Примечание: Химический состав perfusate будет отличаться в зависимости от конкретных метаболические потребности тканей и желаемых условий эксперимента.
   3. Тщательно перемешать это решение до тех пор, пока все соли развели. Отрегулируйте громкость до 2 Л, с использованием дополнительных очищенной воды.
   4. Тест осмоляльность фаго, используя осмометре депрессии точки замерзания. Приспособиться к 300 мОсм/кг с помощью сорбитол. Добавлением сорбита 324 мг до 2 Л 299 мОсм/кг фаго perfusate приведет к увеличению осмотического давления до 300 мОсм/кг (примерно 1 мОсм на 324 мг).
      Примечание: Фаго можно хранить при 4 ° C, воздух плотный, герметичная бутылка для в течение не более 24 ч.

2. Установите перфузии системы

1. подготовить фаго perfusate.
   1. Equilibrate фаго к температуре (~ 23 ° C) при дегазации с 95% Карбоген (95% O ₂, 5% CO ₂; 1/16 Л/мин) через прямой восходящей для не менее 1 ч.
      Примечание: Типы различных тканей или желаемого экспериментальных условиях могут потребовать корректировки содержания perfusate температуры или газ. Желаемых условий для содержания растворенного газа в perfusate можно управлять точно варьируя процент концентрации отдельных компонентов поставок газа ( рис. 1).
   2. Фаго достижении требуемой температуры и насыщенности Карбоген, подтвердить, что pH в пределах физиологических (7.3-7,4). Продолжать газовый пузырь непосредственно в perfusate водохранилище (1/16 Л/мин) в ходе эксперимента с целью поддержания надлежащего растворенного содержание кислорода и рН благоприятных условий для здорового тканевой метаболизм.
2. Премьер линии перфузии.
   1. Submerge в трубку подключен к микро насос перистальтический в подготовленных Фаго (300 мОсм, pH 7,3-7,4, непрерывно загазованность).
   2. Перевал Оксигенатор устройства ( рис. 2) и перфузии линии через оба магнита родила и градиента катушки стека (сверху вниз) и катушек сторону до зонд Ассамблеи. Повесить Оксигенатор выше стакан поймать любой фаго стоков.
      Примечание: В зависимости от конструкции система MRI, перфузии линии может потребоваться быть пропущен через отверстие магнита и катушек градиента или зонд тела базы до грунтовки системы с фаго. Подтвердите, что размещение линии перфузии не будет вмешиваться с Ассамблеей органа зонд или вставки зонда в отверстие перед началом процедуры грунтование.
   3. Подтверждения предполагаемого расхода (2 мл/мин) выбран и начать перфузии линии розлива, переключившись на насосе.
   4. Инвертировать пустой, в линии Пузырь ловушки, чтобы фаго будет вытеснять воздух, содержащийся внутри.
   5. Подключить Оксигенатор ' s газа порт на второй источник Карбоген (коллектор или цилиндра вторичный Карбоген) и установите скорость потока 1/16 Л/мин
   6. Подтверждают, что Карбоген пропуская над Оксигенатор ' s-газообмена мембраны путем погружения в воду выхлопной порт на вершине Оксигенатор.
   7. Обнаружении фаго капает из камеры перфузии, очистить любые видимые газовых пузырей от линии приток путем ручной перемешивания.
   8. Подтверждают Оксигенатор функционирует правильно, погрузив кислорода электрод в фаго, вытекающих из камеры перфузии.
      Примечание: Чтение на кислорода метр следует примерный процент кислорода, содержащегося в пределах предоставленного газ.

3. Подготовка тканей

1. эвтаназии
   1. место, крыса (125-150 g) в камеру всасывание анестезия машины и подвергать 4% изофлюрановая в несущей кислород газ в размере 1 Л/мин 4 мин
   2. Удалить бессознательного крысы из камеры анестезии.
   3. Выполнить восстанавливающих рефлекс тест, поместив крыса в лежачем положении. Проверить наличие любых движений — головы поворотный, подъем ног, позвоночника, сгибание и т.д. — свидетельствуют, что животное превращается на его живот.
   4. Выполнить рефлекторный тест глаз Моргните, прикоснувшись Открытый глаз животного с помощью ватного тампона. Проверить для любого ответа — крышка закрытия территорий, мышечные подергивания, и т.д. — для этого сенсорного ввода.
   5. , Наконец, выполнить конечности снять рефлекс тест, щипал кожу между пальцами крысы ' s протянутой задней ноги с помощью пинцета или hemostats. Проверить для сгибания leg.
      Примечание: в случае рефлексивный позитивный результат, не переходите с эвтаназии.
   6. В случае, если любой из трех рефлекс испытаний вызывает ответ, немедленно вернуться крыса в зале анестезии и позволяют еще 2 мин воздействия 4% изофлюрановая.
   7. Выполняют все три рефлексивный тесты над во всей их полноте. Повторите 2 мин экспозиции анестезии при необходимости и только продолжить после наблюдается полное отсутствие реакции на всех трех испытаний рефлексивный.
   8. Усыпить крыс через гильотинные обезглавливание.
2. Мозга резекции
   1. удалить мозга крысы, брутто рассечение. Начать с головой в лежачем положении. Ножницами, вырезать рострально через кожу от задней части шеи к носу и разоблачить черепа.
   2. Удаление мягких тканей от поверхности черепа с зондом тупым.
   3. Работает с хвостового конца, удалите затылочной, теменной и лобной кости черепа с помощью rongeurs.
   4. Отозвать Дура путем разрезания вдоль продольной щели с микро ножницы и пилинг назад слой из обоих полушарий.
   5. Удаление мозга от черепа, повернув голову в лежачем положении и разорвав черепных нервов на вентральной стороне.
3. Среза изоляции
   1. возвращение мозга в лежачем положении и изолировать Центральная часть, содержащая гиппокампе путем удаления всех тканей каудально к поперечной щели и Ростральные бахромок. Сделать два надреза вдоль поперечной плоскости (т.е. корональные срезы) с прямыми краями бритвой.
   2. Аффикс мозга ' s хвостового большинство плоскости к центру vibratome резки ванны с использованием Цианакрилатный клей.
   3. Добавить ледяной, Карбоген кипела фаго vibratome резки ванну и место нейлон крепления аппаратных внутри.
   4. Cut 300 мкм толстые ломтики для получения препаратов использовать срез 3-4 за полушарие (всего 6-8).
   5. Изолировать гиппокампа или корковые раздел из одного полушария и обрезать срез, таким образом, чтобы она вписывается в microcoil ' s 5 мм диаметр ткани хорошо.

4. Позиционирование и перфузии системы Ассамблеи

1. катушки подготовки
   1. заполнения миcrocoil ' s ткани камеру с кислородом фаго от vibratome ' s Ванна резки с помощью передачи пипетки.
   2. Взять образец подстриженные мозга и положение области интереса (например. слоя пирамидальных клеток) над microcoil, с использованием рассечения области.
   3. Вставить устройство крепления ткани (нейлоновая сетка чистая прикреплены к нейлоновые шайбы) сохранить образец позицию на протяжении всего изображений эксперимент.
      Примечание: Быстро пройдите образца позиционирования процедуры для сведения к минимуму воздействия интенсивного света. Обеспечивать дополнительные кислородом фаго по мере необходимости, с помощью передачи пипетки.
2. Сборка - родила Оксигенатор, microcoil и зонд
   1. модифицированных microcoil в сборе ( рис. 3) крепится в таблице зажим и прикрепить устройство в отверстие Оксигенатор, вставив Ацетали поддержки колышек в отверстие на верхней части катушки.
   2. Печать системы перфузии, поместив перфузии палаты microcoil ' s ткани хорошо и обеспечивающая два вместе с помощью миниатюрных кабельная стяжка.
   3. Обрезать излишки длиной от кабельной стяжки с помощью кусачки.
      Примечание: После успешного уплотнения, perfusate должен соблюдаться выход через линии отток и никакой утечки должно быть очевидным вокруг силиконовую прокладку палаты перфузии. Неспособность подтвердить эти условия до зонд Ассамблея может привести к серьезный ущерб для визуализации оборудования.
   4. После фаго можно увидеть капает в резервуар для отходов, microcoil и Оксигенатор и прикрепить Ассамблея в верхней части изображения тела зонд.
   5. Скользить Ассамблея градиента стека и сиденья градиента на вершине зонда. Фотографии, детализируя относительное размещение и правильное подключение катушки, Оксигенатор и зонд аппаратные компоненты предоставляются ( рис. 4).

5. Выполняет коллекцию изображений MR

1. вставки, собранный зонд в магнит родила
   1. место тела зонд в непосредственной близости от спектрометр родила отверстие в нижней части магнита.
   2. Отозвать избыточной длины линий перфузии через отверстие, открытие в верхней части магнита.
   3. После того, как все доступные слабину была взята из линии перфузии, заранее зонд тела в магнит родила на базе одновременно удаляя больше слабину от линии перфузии из верхней части ствола.
   4. Резьба два винта крепления на базе зонда в соответствующие пазы стека ШИМ.
   5. Прежде чем продолжить, проверьте, что перфузии линии были не пережат или сильно перегнут во время вставки зонд, подтвердив фаго отток в резервуар для отходов.
      Примечание: Неподтверждение perfusate отток может привести к повреждению перфузии линий и риски катастрофический ущерб MR изображений оборудования.
   6. В случае, если не perfusate видно выхода линии возврата в резервуар для отходов, удалить зонд тела и подтвердить, что perfusate поток возобновлен перед реинтеграции. Принципиальная схема собрал перфузии системы и томографии спектрометра был ранее описанные ⁸.
2. Подключение зонда тела
   1. прикрепить линии приток и отток воды из градиента чиллера.
   2. Включите насос для градиента Чиллер и подтвердить выставленную температуру воды (19 ° C).
   3. Прикрепить воздушный шланг от блока охлаждения воздуха к корпусу зонда с помощью хомут.
   4. Поверните регулятор потока на охладитель воздуха для " 1 " положение.
   5. Прикрепить термопара проволоки к корпусу зонда.
   6. Подсоедините коаксиальный кабель от предусилителя к радиочастотного (RF) ввода/вывода на корпусе датчика ' канал s Протон (H).
   7. Подключите кабель питания от градиента усилители к корпусу зонда.
   8. Внутри РФ кабинета, включите питание блок компенсации B0, все три градиента усилители (x, y, z), и мастер исполнимых
3. Подготовка спектрометр
   1. температуры предназначены отверстия с помощью переменной температуры модуля регулировки в консоли.
   2. Матч (импеданс) и настраивать цепь (частота) РФ, регулируя переменных конденсаторов в пределах зонд. Это достигается путем манипулирования палочки на базе тела зонда.
   3. Изменить текущие настройки для спектрометр ' s ШИМ катушки для максимизации гомогенность магнитного поля в образце.
4. Начать коллекцию изображений
   1. собирать экспериментальный изображения, чтобы определить пространственное положение образца в магнит родила. Типичные параметры для двух мерных градиента эхо являются следующие (TR/TE = 100/4 мс, средние = 1, пульс угол = 30 ^o, время = 6 сек, матрица = 64 x 64, поле зрения = 0,3 x 0,3 см, резолюции = 47 x 47 мкм).
   2. Собирать диффузии взвешенный пилотов с целью подтверждения надлежащей проверки геометрии и ткани позицию, если применимо. Типичные параметры для двух мерных диффузии взвешенный экспериментальной проверки являются следующие (TR/TE = 2000/11,6 мс, время = 4,3 мин, Δ = 6 мс, δ = 1 мс, средние = 1, b = 1200 (1860 эффективной) s/мм ², матрица = 64 x 64, поле зрения = 0,2 х 0,2 см резолюции = 31 мкм).
   3. Собирать диффузии взвешенный временных рядов для определения стабильности характеристик препарата острый срез. Типичные параметры для двух мерных диффузии взвешенные изображения являются следующие (TR/TE = 2000/11,6 мс, время = 1,5 h, Δ = 6 мс, δ = 1 мс, средние = 42, b = 1200 s/мм ², матрица = 64 x 64, поле зрения = 0,2 х 0,2 см, резолюции = 31 мкм). Примечание: Характеризующие стабильность в данной системе будет отличаться от описанных протокол в зависимости от таких факторов, как Мистер контраст занятых (например, T1, T2, диффузии, восприимчивость), физического возмущения учился и Мистер изменения сигнала в единицу времени результате сказал возмущений.

Результаты

Perfusate подготовка

После успешного трудоустройства оксигенации в отверстия устройства газов, присутствующих в предоставленный Карбоген достигнет 100% насыщения условий в рамках фаго perfusate. Это может быть продемонстрировано различной концентрации кислорода поставляемого газа и измерения изменений в содержание растворенного кислорода в фаго perfusate в зале перфузии, с использованием кислорода метр (рис. 1)⁸. Согласно закону Генри количество растворенного газа, который находится в равновесии с жидкой образец прямо пропорциональна парциальное давление газа, при том условии, что температура остается постоянной¹². С помощью этого знания и точность газ стандартов, можно подсчитать количество растворенного кислорода, содержащихся в образце фаго, как описано. Это достигается путем калибровки кислорода метр, использование насыщенных растворов (непосредственно кипела на 1 час или более) фаго подвергается газов известные композиции: один газ с высоким кислорода концентрация таких Карбоген (95% O₂), а другой с низким содержанием кислорода концентрация таких азота (0% O₂). Потом измерения могут быть приняты погружаясь наконечник электрода кислорода в образец. Подтверждение, что в родила Оксигенатор функционирует нормально можно достичь путем измерения стоков от перфузии хорошо. Процент растворенного кислорода как измеряется метр кислорода должно соответствовать процент концентрации кислорода в поставок газа. Если измеренные значения ниже, чем в поставок газа, это предполагает аппаратного сбоя, что может привести к метаболических недостаточность в кусочек ткани.

Образцы внешнего вида и поведения

Острый срез препараты, которые получают перфузии, достаточным, чтобы поставлять необходимые метаболитов и унести метаболические отходы вскоре достичь состояния относительной стабильности. С этого момента острый фрагменты могут быть подвергнуты внешних возмущений, и их ответы на эти изменения могут быть измерены для научных исследований. Для MR экспериментов отслеживание сигнала интерес со временем является широко используется практика продемонстрировать относительную стабильность острый срез препараты¹³. Диффузия взвешенный сигнал особенно чувствительны к изменениям ткани воды мобильности, содержание и распределение, как могут быть оценены с использованием этого механизма контраст для обнаружения инфаркта в ишемического инсульта^14,15. Заговоре сигнал нормализованные диффузии с течением времени в острой корковых ломтиками, под разнообразные условия перфузии демонстрирует относительно стабильности (2 ± 3% более 15,5 ч) после изоляции ткани достигается (рис. 5). Распространения сигнала стабильность была сохранена независимо от условий перфузии (периодической или постоянной) или МРТ сканирования длины (короткий [4 мин] или [1,5 h])⁸. Если фрагменты не проявляют стабильность сигнала с течением времени, такие как резкое распространение сигнала увеличение наблюдается в жизни коры, которые не получают перфузии, это наводящий субоптимальные экспериментальных условиях. Не следует пытаться возмущений эксперименты до подтверждения условий стабильного сигнала в ломтик препаратов.

В дополнение к стабильности сигнала правильный пример позиционирования должно быть подтверждено на момент коллекции изображений. Даже несмотря на то, что образец положение контролируется во время размещения ткани на рассечения микроскопа, сдвиги в положении образца может произойти во время Ассамблеи перфузии аппарата, или из-за грубой обработки катушки или зонд до вставки в магнит. Подтверждение правильного размещения гиппокампа может быть достигнуто путем сбора коротких (2 мин), пилот сканирует с контрастом диффузии (рис. 6). Потому что слоя пирамидальных клеток более чувствительна к диффузии утяжеление чем прилегающих гиппокампа пластинки, эта структура будет отображаться как темные полосы в диффузии взвешенных изображениях. Установок, которые не отображают это характерная особенность содержат образцы-центр и скорее всего нужно будет повторить.

Рисунок 1: Распустил содержание кислорода фаго perfusate как функция % O₂ содержимое поставляемого газа. Карбоген смеси, содержащие переменную концентрации кислорода (95%, 60% и 19%), работают как поставок газа. Процент растворенного кислорода чтений затем взяты из перфузии хорошо и по сравнению с двух известных элементов управления: perfusate водохранилище непосредственно кипела с Карбоген (95% O₂) и perfusate водохранилище, воздействию атмосферных условий (23% O₂ ). В каждом случае, процент кислорода насыщенность на сайте ткани перфузии подходы 100% концентрации₂ O в рамках Карбоген смеси используется. Стандартное отклонение выборки средств равны погрешностей. Рисунок воспроизводится с разрешения из оригинальной статьи⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: схема, чертеж-родила Оксигенатор и перфузии камеры. Эта диаграмма показывает подробные элементы отвечает за функции этих критически важных устройств. Свежие perfusate, который был перекачивается через пузырь ловушки входит Оксигенатор через в верхней части трубки ЯМР 10 мм. Поступая таким образом, он переходит в очень газа проницаемыми Силиконовая трубка (синий сегмент), обмотанный вокруг открытого, трубки 5 мм ЯМР вложенные. Карбоген газ, поставляемый через верхней части трубки 5 мм входит в камеру через дно открытого и проходит через спиральный Силиконовая трубка удалились Оксигенатор через выпускное отверстие в крышке трубки 10 мм. Во время этой экспозиции perfusate, протекающей через трубы силиконовые насыщается химических компонентов в предоставленный газовой смеси. При выходе из Оксигенатор, perfusate проходит непосредственно в камеру перфузии перед входом возвращения линии, ведущей к водохранилище сбора отходов. Другие компоненты, решающее значение для этой конструкции включают ацеталя поддержки колышек, что позволяет Оксигенатор стоять вертикально на вершине модифицированных microcoil РФ, силиконовые шайбы (красное кольцо), который образует жидкость герметичное уплотнение между Оксигенатор перфузии камеры и microcoil ткани хорошо и кабельная стяжка паз, который вмещает размещение кабельная стяжка, используется для формирования этой реверсивные печати. Этот рисунок был изменен и воспроизводится с разрешения из оригинальной статьи⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: изменения microcoil Ассамблее, которые позволяют интерфейс-родила Оксигенатор. Две канавки 3,0 х 1,5 мм (черные стрелки) были отрезаны в сторону сборки, размещения ширину кабельная стяжка, используется для герметизации камеры перфузии. Канал (15 x 3 x 4 мм) соединяет рощи по задней поверхности катушки. Два пространства нейлон помещены в сторонах канала (красные стрелки) закон как catch для головы кабель галстук, который облегчает процедуру герметизации. В верхней части катушки Ассамблеи (желтый arr пробурено отверстие (2 x 14 мм)ВЛ) присоединяется к ацеталя поддержка привязки для обеспечения Оксигенатор. Этот рисунок был изменен и воспроизводится с разрешения из оригинальной статьи⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Фото Монтаж подробно относительное размещение и надлежащего Ассамблеи microcoil, Оксигенатор и компоненты зонда. Эти изображения имеют ключевые компоненты оборудования устройства Оксигенатор и microperfusion в отверстие и иллюстрируют, как отдельных частей взаимодействовать друг с другом. (A) взорвалась посмотреть фото показаны относительное размещение всех компонентов до уплотнения ткани хорошо или Ассамблеи органа зонд. Меры приняты для отображения относительное расположение частей точно; Однако часть линии перфузии было удвоено обратно в этой серии так, чтобы все компоненты соответствовали в пределах кадра. (1 = зонд головы, 2 = microcoil Ассамблеи, 3 = нейлон ткань удержания кольцо, 4 = перфузии, 5 = Кабельная стяжка, 6 = в родила Оксигенатор, 7 = градиента катушек, 8 = Пузырь ловушки). (B) компонентов после катушки и Оксигенатор Ассамблеи. В этот образ кольцо крепления нейлон был помещен в microcoil ткани хорошо для защиты образца. Ацетали поддержки колышек на базе Оксигенатор обеспечено в соответствующее отверстие на вершине microcoil. Силиконовая прокладка на открытом конце перфузии хорошо был помещен над колодцем ткани, и кабель галстук был ужесточен вокруг этих компонентов для герметизации камеры перфузии. И наконец база microcoil был подключен к верхней части головы зонд. (C) компоненты после Ассамблеи зонд. В последней панели избыток длиной от кабельной стяжки заподлицо обрезается с microcoil. Градиент катушки стек затем скользнул в позиции, тщательно продвигая цилиндра к зонд во время прохождения его полые центр линии избыток перфузии, Оксигенатор и microcoil. Подключившись градиенты в зонд голову, они вы удерживается на месте привинчивать крепления воротника на зонд над резьбой база градиенты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: стабильности сигнала диффузии в superfused острый корковых ломтиками. (A) нормированный диффузии сигнала значения в четырех острых фрагментов, подвергается различным superfusion парадигмы строятся с течением времени, в течение до 21,5 ч после эвтаназии. Фрагменты остаются в пределах ± 5% от их первоначального распространения сигнала измерения в течение 15.5 h после эвтаназии независимо от того, является ли superfusion непрерывной или прерывистой и независимо от длины сканирования MR (1,5 ч или 4 мин). Записи сигнала, взяты из формальдегида Исправлена коры служат в качестве позитивного управления (n = 1) для стабильности из-за статических, неизменный характер образцов фиксированной ткани. И наоборот, распространения сигнала измеряется в живой кусочек отсутствует superfusion поддержки (n = 1) служит в качестве элемента управления для метаболических дефицит. Эксперимент параметры различных superfusion испытаний являются следующие: непрерывное (superfusion всегда вовремя, на скан = 1,5 ч), кратковременный (superfusion на 10 мин интервал между сканированием, время на сканирование = 1,5 h), длинные интервал, длинные сканирования (superfusion на во время сканирования, но приостановлена за 10 мин между операциями сканирования, время на сканирование = 1,5 ч), длинный интервал, краткое сканирования (superfusion на 1,5 ч интервал между сканированием, время на сканирование = 4 мин). (B) анализ данных показаны группы означает четыре жить срез superfusion экспериментов с панели (A). Распространения сигнала профиль из сгруппированных, superfused корковой ломтики экспонатов мало изменения с течением времени (2 ± 3% свыше 15,5 ч), тогда как элемент увлажненную (n = 1) экспонатов драматического сигнал нестабильности в начале эксперимента (15% от 6,5 ч). Этот рисунок был изменен и воспроизводится с разрешения из оригинальной статьи⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: подтверждение размещения гиппокампа ломтик во время экспериментального томографии. Перед запуском расширенный MR микроскопии сессии, правильное размещение образца имеет решающее значение для обеспечения ресурсов, таких как время сканера и дорогих perfusate добавки не впустую. Слоя пирамидальных клеток в регионе СА1 гиппокампа могут быть визуализированы в быстрее (4,3 мин), Нижняя экспериментального сканирует резолюции (31 мкм x 31 мкм в плоскости) чтобы убедиться, что ткани интерес помещается корректно по отношению к микро катушки. Параметры проверки общих для обоих изображений являются следующие: TR/TE = 2000/11,6 мс, Δ = 6 мс, δ = 1 мс, средние = 1. (A) b = 0 (227 эффективным) s/мм². В этой предварительной проверкой pyramidale слой только видно, как серый, Диагональ группы сосредоточены в профиль катушки возбуждения. (B) b = 1200 (1860 эффективной) s/мм². На более высоких диффузии взвешивание, interlamellar контрастность увеличивается как слоя пирамидальных клеток становится темнее, чем ткани в прилегающих пластинки (выше: пласт oriens; ниже: radiatum слой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Текущий протокол описывает процедуры, необходимые для стандартных метаболических обслуживания острого мозга среза препаратов претерпевает магнитного резонанса микроскопии. Эта процедура является единственным способом в настоящее время доступны, что позволяет визуализации живых тканей млекопитающих с MR в резолюциях способный разрешать клетки. Хотя описанные условия perfusate разработанных специально для тканей центральной нервной системы, протокол является широко адаптируемым к любым способом жизни Подготовка тканей путем корректировки perfusate и газовых составляющих, а также скорость потока перфузии и температуры.

Наиболее распространенные проблемы возникнуть во время описанные процедуры включают в себя те относящиеся к сбоям в поставках метаболит. Осадков солей кальция может произойти внутри фаго при газообразных недостаточность вследствие сбоев в бикарбонат, буферизацию системы. Такие осадки может засорить линии перфузии и привести к повреждению тяжелых оборудования. Если преципитаты соли наблюдаются в perfusate, после Ассамблеи зонд, перфузии поток немедленно прекратить, отключив Перистальтический насос. Подтвердите наличие достаточных уровней бикарбоната натрия (4,37 г/2 Л) в perfusate, CO₂ уровня (5,0%), поставок газа, и потока газа Карбоген (1/16 Л/мин) в водохранилище и Оксигенатор. Наконец убедитесь, что уровень pH стабилизируются в физиологическом диапазоне (7.3-7,4). В случае, если газ и pH уровень кислорода до сих пор не регулируется надлежащим образом, Обмен газа мембраны должны быть заменены.

Если фрагменты не проявляют стабильность сигнала в течение предполагаемого экспериментальной время-, убедитесь, что правильный химический присутствуют в фаго смеси и сохранить правильную осмотического давления (300 мОсм) и рН (7.3-7,4). Кроме того убедитесь, что Карбоген газ поставляется в perfusate водохранилище и Оксигенатор в 1/16 Л/мин. Если эти шаги не исправить perfusate условий, рекомендуется замена мембраны газообмена. Если не ткани стабильность достигается после устранения неполадок в perfusate условиях, рассмотрим уточнение хирургического протокола с упором на минимизации временной интервал между приложения урожай и перфузии тканей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusate Preparation
Osmette A	Precision Systems Inc.	5002	freezing point depression osmometer
Stir Plate Type 1000	Barnstead/Thermodyne	SPA1025B	magnetic stir plate with heating element
Accumet Basic pH Meter	Fisher Scientific	AB15	pH Meter
pH Probe	Fisher Scientific	13-620-AP61	probe for pH measurement
Oxygen Meter	Microelectrodes Inc.	OM-4	meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates
Oxygen Electrode	Microelectrodes Inc.	MI-730	microprobe for the oxygen meter
Scale	Denver Instrument Co.	A-160	microscale for weighing chemical components
Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Preparation
Lancer Vibratome	Ted Pella Inc.	Series 1000	vibratory tissue slicer
Disecting Microscope	Carl Zeiss Inc.	OPMI 1-FC	tabletop, binocular disecting microscope
Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion System
Masterflex L/S	Cole-Parmer	7523-50	peristaltic micro perfusion pump
Oxygen Regulators x 2	Victor Medical	VMG-05LY	device for regulating gas flow
e-sized carbogen cylinders x 2	Airgas		gas tanks containing carbogen gas
in-bore oxygenator	developed in house		device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate
Name	Company	Catalog Number	Comments
MR Imaging Hardware
Micro Surface Coil (200mm dia., modified)	Bruker Biospin	B6371/0001	four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil
Micro 5 probe body	Bruker Biospin	Z3395	microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer
Micro 5 gradient coils	Bruker Biospin	M81111	gradient coil stack used with micro 5 probe body
600 MHz Spectrometer	Oxford Instruments		superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation
Imaging Console	Bruker Biospin	Avance III	support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation
Air Blower	Bruker Biospin	BCU-II, -80/60	Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore
Gradient Chiller	Thermo Scientific	Neslab Merlin M33	Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils