Medición de esfínter uretral externo cistométrico en ratas despiertas con catéter implantado y electrodos para medidas repetidas

Resumen

Este protocolo describe primero el procedimiento quirúrgico de la implantación permanente de un catéter de vejiga urinaria combinada con electrodos del esfínter uretral externo y segundo, la medición de la función de la vejiga y uretral externo Esfinge en animales despiertos implantados.

Resumen

Función del tracto urinario inferior se evalúa principalmente mediante análisis de función de vejiga cistométrico en roedores. Cystometries convencionales se realizan generalmente como análisis terminal bajo anestesia de uretano. Es bien sabido que las drogas anestésicas pueden influir en la función vesical. Por lo tanto, el objetivo de esta técnica es realizar mediciones cistométrico del esfínter externo uretral y vejiga urinaria en ratas despiertas ligeramente restringidas. Para ello, se implanta un catéter de vejiga en la cúpula de la vejiga. Posteriormente, dos electrodos son implantados bilaterales en el esfínter uretral externo y un electrodo de tierra se sutura a un músculo esquelético no responde. El catéter de la vejiga y los tres electrodos son finalmente tunelizados subcutáneamente en la región del cuello y colocados en un arnés. Con esta técnica, las vías urinarias bajas puede ser medida en varios puntos del tiempo en el mismo animal para evaluar la función del tracto urinario inferior. La principal aplicación de esta técnica es el seguimiento simultánea vejiga urinaria y función del esfínter uretral externo en ratas sanas despiertas y después de la inducción de una enfermedad o lesión. Por otra parte, el posterior control de tracto urinario inferior puede realizarse durante la evaluación de la enfermedad, lesión y para monitorizar la eficacia del tratamiento.

Introducción

Para analizar almacenamiento urinario y anulación de la función y disfunción, mayoría de los estudios ha usado modelos de roedores. A través de la activación secuencial de los reflejos, se produce la micción. La coordinación de estos reflejos es esencial para la eficiente evacuación¹. Técnicas de grabación cistométrico proporcionan valiosas herramientas para el análisis de la función de la vejiga urinaria bajo su control neural¹.

Cystometries más convencionales en las ratas se hacen como un análisis único y final en anestesia, principalmente uretano²y únicamente se centran en la vejiga urinaria. Sin embargo, en algunas patologías como disfunción neurogénica de tracto urinario inferior (NLUTD), no sólo a la vejiga urinaria, sino también a la salida de la vejiga, el esfínter uretral externo, es disfuncional^3,4. Esto dificulta NLUTD seguimiento, si sólo se examina la vejiga en una medición cistométrico sola. Para obtener resultados confiables que son comparables a los seres humanos, es esencial para medir con precisión tanto la vejiga urinaria y la función del esfínter uretral externo y sus interacciones². Además, es crucial realizar análisis funcionales en ratas despiertas como la anestesia es muy probable que altere la función de vejiga^2,5,6. Un buen cistométrico en animales despiertos es la base para la identificación de la función y funcionamiento de la vejiga⁷.

La Cistometría animal pequeña estación (p. ej., estación de cystometry Catamount (CCS)) es una unidad para realizar análisis cistométrico en pequeños animales despiertos⁸. Por medio de un catéter vesical permanente y esfínter uretral externo implantado electrodos, pueden realizarse mediciones repetitivas durante un largo tiempo períodos². Así, la CCS proporciona una valiosa herramienta para no neurogénica y evaluaciones de NLUTD en el modelo de roedor, en los cuales los pathomechanisms puede cambiar durante el seguimiento a corto o medio plazo. Además, este método incluye un análisis reducido artefacto cistométrico utilizando un limitador para realizar mediciones de vejiga en ratas despiertas.

En este papel, describimos el abordaje para el implante permanente de un catéter de vejiga y esfínter uretral externo electrodos, junto con mediciones cistométrico en ratas despiertas.

Protocolo

Todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Comité de ética gubernamental austríaca para la investigación animal (Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, WF / V /3b) y en cumplimiento de la Asociación para la evaluación de laboratorio Pautas de cuidado animal para uso animal. Las ratas utilizadas este enfoque fueron ratas Lewis hembras, de 12 semanas de edad. Use instrumentos estériles en el protocolo.

1. material preparación

1. Fabricación del catéter
   1. Cortar el catéter (polietileno tubería PE-50) en la longitud correcta (20 a 25 cm) para ajustarse al tamaño del animal.
      Nota: Dejar un sobrante para hacer un túnel y facilitar el manejo.
   2. Estallar un extremo con un mechero para conseguir una punta redondeada. Comprobar apertura apropiado final y extremo romo del catéter.
   3. Coloque un tubo de silicona larga 2 mm sobre el catéter hasta que se encuentra justo debajo de la parte acampanada.
2. Fabricación de los electrodos
   1. Preparar un alambre de acero recubierto de politetrafluoroetileno de 20-25 cm (la longitud apropiada según el tamaño del animal).
   2. Preparar un alambre de plata 2 cm de longitud y retuerza los extremos hasta que quede un pequeño bucle. Tira de 2 mm del aislamiento de teflón en un extremo. El alambre trenzado de plata final el alambre desnudo de acero de la soldadura.
   3. Aplique el esmalte de uñas convencional en la zona de la capa. Preparación de tubería de polietileno largo 4 mm sobre la región cubierta y sellar el extremo aplicando calor a las pinzas de compresión.

2. animal preparación

1. Anestesia
   1. Use una Cóctel de anestesia apropiada aprobado por la institución para un general anestesia.
   2. Preparar Cóctel de anestesia con fentanilo (0,01 mg/kg), medetomidina (0,15 mg/kg) y midazolam (0,08 mg/kg) e inyectar por vía intramuscular por una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 27.
2. Preparación quirúrgica
   1. Afeitar el abdomen con una afeitadora eléctrica, incluyendo la región genital y la región lumbar a la altura de los omóplatos.
   2. Desinfectar abdominal y cuello regiones con 70% etanol primeros y luego 3 alternando peelings con solución de povidona-yodo.

3. implantación de Catéter vesical

1. Realizar una laparotomía de línea media baja a nivel de la tetilla tercera y cuarta (aproximadamente 2 a 2.5 cm de longitud) mediante un bisturí para la piel y una tijera quirúrgica de los músculos abdominales.
2. Exponer la vejiga guiando la pared abdominal en dirección craneo-caudal y fijarlo en esta posición colocando la parte posterior de un fórceps de detrás de la vejiga para evitar la reubicación.
3. Colocar una sutura en jareta alrededor de la cúpula de la vejiga usando una sutura de monofilamento no absorbible 6-0 con una aguja de punta cónica.
4. Haga una incisión en la cúpula de la vejiga dentro de la jareta, ya sea por la punta del escalpelo o aguja de 18G, para insertar el catéter de la vejiga (ver protocolo paso 1).
5. Inserte el catéter Prellenado con la solución fisiológica estéril de cloruro de sodio 0.9% y cuidadosamente retraiga el catéter de la vejiga hasta apertura abocinada del catéter se coloca justo debajo de la bóveda de la vejiga.
6. Asegurar la sutura en jareta alrededor de la sonda y hacer una parada de sutura alrededor del cuerpo del catéter por fijación más.
7. Verificar por fugas a través de la cúpula de la vejiga poco a poco llenando la vejiga a través del catéter con solución de cloruro sódico 0,9% fisiológico estéril.

4. implantación de electrodo uretral esfínter

1. Preparar tres electrodos para la implantación (ver protocolo paso 1).
2. Marque un electrodo con un rotulador permanente color para mayor identificación del electrodo nulo futuro. Desinfecte los electrodos con etanol al 70%.
   Nota: Los catéteres no son adecuados para el calor y los procedimientos de esterilización química. Por el contrario frío esterilizar los electrodos durante 24 h.
3. Extender la incisión abdominal por tijeras quirúrgicas hasta el hueso púbico, pero no corte la sínfisis púbica.
4. Identificar la uretra y crear un bolsillo embotado con unas pinzas finas a ambos lados de la uretra, pero evitar el trauma de vasos o nervios.
5. Identificar adecuadas bolsas de grasa cerca de la uretra dentro de esta ventana.
6. Fijar electrodos bilateralmente en la bolsa de grasa adecuado mediante el uso de la sutura de monofilamento no absorbible 6-0.
   Nota: La posición final de los electrodos debe ser bilateral en la región media de la uretra.
7. Atar los dos electrodos junto con sutura de monofilamento no absorbible 6-0.
8. Sutura el electrodo marcado null al músculo de la pared abdominal a distancia de la uretra. Ate todos los tres electrodos junto con una sutura única.

5. túnel

1. Hacer una incisión en la piel pequeñas entre los omóplatos para hacer un túnel.
2. Túnel de cables del electrodo hasta el cuello y hacer una verificación final para la colocación correcta y verificar la posición de los electrodos después de hacer un túnel.
3. Catéter de vejiga de túnel al nivel de la escápula - prestar atención a la vejiga mientras tunelizado el catéter para evitar la torsión de la vejiga. Para ello, sujete el catéter justo antes de entrar en la cúpula de la vejiga para evitar la torsión de la vejiga.
4. Cerrar los músculos abdominales por suturas continuas o interrumpidas con una sutura absorbible 4-0 polyfilament. Cerrar la incisión en la piel por suturas de colchonero interrumpidas.
5. Estirar el animal a su longitud total que la distensión máxima de los cables del electrodo y el catéter.
6. Fijar cables catéter y el electrodo por una sutura hundida en el músculo del hombro.
7. Cerca de la piel por una sola puntada con la sutura 4-0.

6. arnés montaje

1. Colocar un arnés al animal tirando del arnés sobre la cabeza del animal y tire de los miembros anteriores hasta una posición final entre las tiras de dos silicona. Compruebe el tamaño de arnés en el peso del animal antes de la cirugía con el distribuidor.
2. Túnel del catéter de la vejiga al orificio central del arnés y electrodos a través del agujero a medida por un taladro ajustado al tamaño de los cables de electrodo.
3. Ajuste el arnés tirando de las tiras de silicona. Ajuste del arnés por lo que no es demasiado flojo, sino garantizar un espacio mantener la capacidad de movimiento de la rata.
4. Utilice una correa de cable para fijar las tiras de silicona.
5. Cortar la longitud del catéter vesical a 3 cm por encima del arnés, conecte el tapón de 23 G y finalmente fijar el arnés.

7. fabricación de la conexión del electrodo

1. Prepare tres tubos de encogimiento de calor pequeña (un color diferente para el electrodo de null). Preparar dos tubos de encogimiento térmico más en un tamaño más apropiado.
2. Acortar la longitud de los cables de electrodo a una longitud óptima para poder conectar más adelante al enchufe hembra sin ser demasiado flojo o demasiado corto. Tira del aislamiento de teflón de los tres alambres (aproximadamente 2 mm) y tuerza los cables de acero en una cadena.
3. Coloque tubos de encogimiento de calor grande sobre todos los cables, coloque los tubos pequeños individualmente para todos los tres cables y utilice el tubo de color para el electrodo de null.
4. Los electrodos para el conector macho de 3-conexión de la soldadura. Coloque el electrodo nulo en el medio y reducir el área de tres pequeños tubos individuales arriba soldados.
5. Reducir el primero de los tubos más grandes al final de los finales de cada tubo y el tubo gran final a la frontera de enchufe macho.
6. Conecte el conector macho al conector hembra fijado al arnés y fijar con un trozo de cinta para mayor seguridad.

8. después de la cirugía atención

1. Áreas quirúrgicas de limpiar y desinfectar con povidona yodada.
2. Colocar el animal sobre una almohada hasta que despierto y dar solución de cloruro de sodio 0.9% para la sustitución de agua, basado en las pautas de cuidado de los animales locales durante y después de la cirugía.
3. Administrar analgésicos (meloxicam 1 mg/kg) y antibióticos (sulfadoxinum 200 mg, trimethoprimum 40 mg, 15 mg/kg) como una solución combinada inyección por vía subcutánea. Dos veces al día, dar analgésicos (mañana y tarde) y una vez al día dar antibióticos, durante cinco días posteriores.
4. Continuar con antibióticos en la misma dosis sobre el periodo de seguimiento conjunto en dos o tres inyecciones por semana.
5. Revise diariamente para la colocación adecuada del arnés y realizar una inspección de campo quirúrgico, especialmente de la región del cuello. Ajuste del arnés si se pone demasiado apretado tirando con cuidado las tiras de silicona.
6. Lave el catéter con regularidad una vez por semana para evitar un bloqueo.

9. preparación para la medición de cistométrico

1. Realizar las primeras mediciones cistométrico después de seis días de postoperatorios.
   Nota: Las medidas anteriores pueden ser influenciadas por analgésico medicamento o urotelial irritación debido a la implantación del catéter.
2. Encienda el interruptor principal, la computadora y el amplificador EMG.
3. Llenar la bomba de jeringa con cloruro de sodio 0.9% temperatura de la habitación calentada. Abrir los tres conectores uno tras otro en forma descendente, a partir de la bomba y enjuague los tubos.
   Nota: Revise cuidadosamente quedan burbujas de aire, como burbujas que alterará las mediciones cistométrico.

10. calibración

1. Inicie el software de uroflowmeter de programa y vaya a calibración.
2. Cerrar el conector de tres vías a la bomba y el animal.
3. Abrir la válvula para manómetro conectado y pulsa el cero en el programa.
4. Ajustar la presión en el manómetro a 100 mmHg y botón de mmHg 100 en el programa. Presione confirmar para guardar el ajuste de calibración. La ventana se cerrará automáticamente.
5. Cierre la válvula del manómetro y abrir los conectores de tres vías de la bomba al animal para estar listo para la medición.

11. animal (Animal DB) de la base de datos

1. Para registrar los animales, dar al animal una identificación conciso.
2. Entre otros datos, como fecha de SCI, comienzo del tratamiento, fecha de implantación del catéter, grupo experimental y la fecha de nacimiento del animal.
3. Para finalmente registrar los datos, pulsar "Guardar registro" y guardar en archivo.

12. medición ajustes antes de la grabación

1. Inicie el programa presionando el botón de inicio.
2. Seleccione el animal y pulse escala de Tara y cero presión.
   Nota: Preste atención colocando el animal en el limitador, de que ningún cable se pega, que esto podría conducir a un retiro de un alambre del cable del EMG.

13. animal preparación

1. Quite el tapón de la sonda y desconectar el enchufe de la EMG del arnés.
2. Colocar la rata en el limitador. Cierre el limitador y asegure el arnés con una abrazadera.
3. Conseguir que el catéter y la EMG enchufan el limitador.
4. Coloque el limitador en la unidad de catamount. Poner la cola a través del tubo y fijar el tubo con cinta para evitar movimientos.
5. Conecte el conector macho de EMG para el conector hembra de EMG de grabación.
6. Presione cero presión una vez más y luego conecte el catéter al tubo de llenado y grabación. Verifique la presión en el software.
   Nota: La presión debe ser positiva, alrededor de 5-10 cm H₂O en la línea de base. Si la presión es negativa, desconectar el catéter de la cánula, presione cero presión y vuelva a conectar el catéter.

14. grabación

1. Si el catéter y el EMG cable están conectados, presione registro y funcionamiento de la bomba.
2. Adaptar la velocidad de relleno a las necesidades experimentales en μL/min.
3. Tenga en cuenta el tiempo de la grabación se inicia y la temperatura en el libro de registro.
4. Para detener la cistométrico grabación, parar la bomba por bomba pulsar ejecutar y pulse grabación una vez más.
   Nota: La bomba estará apagada y la luz verde en la bomba está apagada.
5. Desconecta el catéter y el tapón de tope de 23G para cerrar el extremo del catéter. Desconecte el cable de EMG.
6. Abra el frente del limitador y guía la rata fuera el limitador.
   Nota: Maneje con cuidado rata y vigilar los cables para evitar cualquier bloqueo de los cables.
7. Conecte el catéter en el arnés. Vuelva a conectar el enchufe de la EMG para el arnés y ponga un pedazo de cinta alrededor de la clavija.
   Nota: Si el animal tiene una condición patológica de las vías urinarias inferior, expresan la vejiga al final manualmente para evitar la sobredistensión de la vejiga.
8. Puesto que el animal de nuevo en su jaula de la casa.
9. Cerrar el programa por presionar la salida.
10. Limpie el limitador y el vaso.
11. Cerca de los conectores de tres vías a la bomba y la salida del animal.
12. Apaga el ordenador, la unidad del EMG y el sistema mediante el interruptor principal.
    Nota: Los datos se guardan en la carpeta independiente "De datos conectado" con el archivo de la subcarpeta de la identificación de rata medido. Solo grabaciones se ordenan en las carpetas de identificador de rata solo por fecha.

Resultados

Un esquema mostrando el proceso de mediciones cistométrico despierto se presenta en la figura 1 y la anatomía para la implantación del catéter de la vejiga se muestra en la figura 2. La cirugía toma aproximadamente 2 h. analgesia postoperatoria y antibióticos, como se describe en el protocolo, cubren infecciones y dolor durante cinco días después de la cirugía. No hay signos de dolor se observaron después de eso. Dos ve...

Discusión

Este protocolo describe el procedimiento quirúrgico de un catéter permanente, implantación de electrodos del esfínter uretral y el cistométrico grabación técnica en ratas despiertas, ligeramente restringidas, incluyendo tanto el análisis simultáneo de la vejiga urinaria y esfínter uretral externo.

Pasos críticos durante la cirugía son la cuidadosa implantación de Catéter vesical, evitando fugas y la manipulación extensa. Por otra parte, una implantación precisa de los electrodo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing PE 50	Becton Dickinson	427411	Catheter
Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c)	Ethicon	EH7403H	Suture
Teflon coated steel wire	Cooner wire	AS631	Electrode material
Silver wire 0.250 mm	World Precision Instruments	AGW1030	Electrode material
Rotilabo - PVC tube	Carl Roth	97241	Harness
Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c)	Ethicon	V4940H	Suture
Quick Connect Single Harness	SAI Infusion Technologies	QCH-23CW	Harness
Shrinking tubes	ChiliTec	17894	Electrode soldering
Soldering wire Pb60 Sn40	Stannol	LD0029	Electrode soldering
Fluxing agent 157	Castolin Eutectin	157 0150	Electrode soldering
Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	801-87-050-10-001101	Electrode soldering
Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	890-18-003-10-001101	Electrode soldering
Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis)	Catamount Research and Development Inc.	CAT-CYT-R
Differential amplifier with active headstage	AD instruments	DP-311	EMG amplifier
Restrainer Medium size for rats 200-300 g	emka Technologies	HLD-RM
Uro Dyn Software	Zürich of University		MTA-based
Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age	Charles River, Sulzfeld, Germany		animals