Medições de esfíncter uretral Cystometric e externo em ratos acordados com cateter implantado e eletrodos permitindo medições repetidas

Resumo

Este protocolo descreve primeiramente o procedimento cirúrgico da implantação permanente de um cateter de bexiga urinária combinado com eletrodos de esfíncter uretral externo e segundo, a medição da função da bexiga urinária e externo uretral sphincter em animais acordados implantados.

Resumo

Função do trato urinário inferior é avaliada principalmente por meio da análise de função da bexiga cystometric em roedores. Cystometries convencionais geralmente são executadas como terminal análise sob anestesia de uretano. É sabido que drogas anestésicas podem influenciar a função da bexiga. Portanto, o objetivo desta técnica é realizar medições de cystometric da bexiga e do esfíncter uretral externo em ratos acordados levemente comedidos. Para este fim, um cateter na bexiga é implantado para a cúpula da bexiga. Posteriormente, dois eletrodos são implantados bilateral para o esfíncter uretral externo e um eléctrodo de terra é suturado para um músculo esquelético não-responsivos. O cateter da bexiga e os três eletrodos são finalmente um túnel subcutâneo para a região do pescoço e apostos em um chicote de fios. Com esta técnica, o trato urinário inferior pode ser medido em vários pontos de tempo no mesmo animal para avaliar a função do trato urinário inferior. A principal aplicação desta técnica é o seguimento de simultânea da bexiga urinária e a função do esfíncter uretral externo em ratos saudáveis acordados e após a indução de uma doença ou lesão. Além disso, o posterior acompanhamento de trato urinário inferior pode ser realizada durante a avaliação da doença/lesão e para monitorar a eficácia do tratamento.

Introdução

Para análise de armazenamento urinário e função e disfunção da micção, a maioria dos estudos utilizaram-se modelos de roedores. Através da ativação sequencial de reflexos, micção é produzida. A coordenação destes reflexos é essencial para anulação eficiente¹. Técnicas de gravação Cystometric fornecem ferramentas valiosas para analisar a função da bexiga urinária sob seu controle neural¹.

Cystometries mais convencionais em ratos são feitas como uma análise única e final em anestesia, principalmente uretano²e concentrar-se exclusivamente na bexiga urinária. No entanto, em algumas patologias como neurogênica de disfunção do trato urinário inferior (NLUTD), não apenas a bexiga urinária, mas também a saída da bexiga, o esfíncter uretral externo, é disfuncional^3,4. Isto faz com que NLUTD difícil de acompanhamento, se a bexiga é examinada em uma único cystometric medição. Para obter resultados fiáveis e comparáveis aos seres humanos, é essencial para medir com precisão tanto a bexiga urinária e a função do esfíncter uretral externo e suas interações². Além disso, é crucial realizar análises funcionais em ratos acordados como anestesia é muito susceptível de modificar a função de bexiga^2,5,6. Um bom cystometric de gravação em animais acordados é a base para a identificação de bexiga função e mau funcionamento⁷.

A estação de pequenos animais cistometria usada (por exemplo, estação de cistometria Catamount (CCS)) é uma unidade para realizar análises de cystometric em pequenos animais acordado⁸. Por meio de um cateter permanente da bexiga e esfíncter uretral externo implantados eletrodos, medições repetitivas podem ser executadas por um longo tempo períodos². Assim, o CCS fornece uma ferramenta valiosa para não-neurogênica e avaliações de NLUTD no modelo de roedor, em que o pathomechanisms pode mudar durante o seguimento de curto ou médio prazo. Além disso, este método inclui uma análise de artefato-reduzida cystometric usando uma retenção para realizar medições de bexiga em ratos acordados.

Neste trabalho, descrevemos a abordagem cirúrgica para implante permanentemente um cateter da bexiga e do esfíncter uretral externo eletrodos, juntamente com medidas de cystometric em ratos acordados.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de ética governamental austríaco para pesquisas com animais (Bundesministerium für Wissenschaft, pesquisa und Wirtschaft, WF / V /3b) e estavam em conformidade com a associação de avaliação de laboratório Animais cuidados diretrizes para uso de animais. Ratos usados para esta abordagem foram ratos Lewis de sexo femininos, 12 semanas de idade. Use instrumentos esterilizados em todo o protocolo.

1. material preparação

1. Fabricação do cateter
   1. Corte o cateter (polietileno tubos PE-50) de comprimento adequado (20 a 25 cm) para ajustar o tamanho do animal.
      Nota: Deixe algum comprimento extra para encapsulamento e fácil manuseio.
   2. Incendiar uma extremidade com um isqueiro para obter uma ponta arredondada. Verifique se há abertura apropriada final e fim brusco do cateter.
   3. Coloque um tubo de silicone longa 2mm sobre o cateter até que encontra-se apenas abaixo do queimado.
2. Fabricação de eletrodos
   1. Prepare um fio de aço revestido de politetrafluoroetileno de 20-25 cm (comprimento apropriado dependendo do tamanho do animal).
   2. Prepare um fio de prata de 2 cm de comprimento e torcê-las até um pequeno loop permanece. Dispam-se 2 mm da isolação Teflon em uma extremidade. Solde o fio de prata torcido terminando para o fio de aço despojado.
   3. Aplica verniz convencional na zona de revestimento. Preparar tubos de polietileno longa de 4 mm sobre a região revestida e selar o fim por aplicação de calor para a pinça de compressão.

2. animal preparação

1. Anestesia
   1. Use uma cocktail de anestesia adequada aprovados pela instituição para um general anestesia.
   2. Prepare o coquetel da anestesia com medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (0,08 mg/kg) e fentanil (0,01 mg/kg) e injetar por via intramuscular por uma seringa de 1 mL, com uma agulha de calibre 27.
2. Preparação cirúrgica
   1. Raspe o abdômen com um barbeador elétrico, incluindo a região genital e costas região a nível das escápulas.
   2. Desinfectar o abdominal e pescoço as regiões com 70% etanol primeira e em seguida 3 alternados esfrega com solução de iodo-povidona.

3. implantação de cateter na bexiga

1. Realizar uma laparotomia de linha média baixa no nível do terceiro e quarto teto (aproximadamente de 2 a 2,5 cm de comprimento) usando um bisturi para a pele e uma tesoura cirúrgica para o músculo abdominal.
2. Expor a bexiga, orientando a parede abdominal na direção cranio-caudal e corrigi-lo nesta posição, colocando a parte de trás de um fórceps atrás da bexiga para evitar re-posicionamento.
3. Coloque uma sutura em bolsa ao redor da cúpula da bexiga usando uma sutura de monofilamento não absorvível de 6-0 com uma agulha de ponta cónica.
4. Incise a cúpula de bexiga dentro da bolsa-sequência de caracteres, por ponta de bisturi ou agulha de 18G, para inserir o cateter da bexiga (Veja o protocolo passo 1).
5. Introduza o cateter preenchido com a solução de cloreto de sódio 0,9% fisiológico estéril e retraia cuidadosamente o cateter da bexiga até abertura alargada do cateter é posicionada logo abaixo a cúpula da bexiga.
6. Segura a sutura em bolsa ao redor do cateter e fazer uma paragem-sutura ao redor do corpo do cateter para fixação adicional.
7. Verifique se há fugas através da cúpula da bexiga encher lentamente a bexiga através do cateter com solução de cloreto de sódio fisiológico estéril de 0,9%.

4. implante de eletrodo uretral do esfíncter

1. Preparar três eletrodos para implantação (Veja o protocolo passo 1).
2. Marca um eléctrodo com uma caneta de feltro colorida permanente para posterior identificação do futuro eletrodo nula. Desinfecte o eletrodos com etanol a 70%.
   Nota: Os cateteres não são adequados para o calor e os procedimentos de esterilização química. Em vez disso frio esterilizar os eletrodos para 24h.
3. Estender a incisão abdominal, tesoura cirúrgica até o osso púbico, mas não corte a sínfise púbica.
4. Identificar a uretra e criar um bolso sem corte usando fórceps bem em ambos os lados da uretra, mas evitar o trauma de vasos sanguíneos ou nervos.
5. Identifica o adequado bolsas de gordura perto da uretra dentro desta janela.
6. Fixe eletrodos bilateralmente para a bolsa de gordura adequado utilizando a sutura de monofilamento não absorvível de 6-0.
   Nota: A posição final dos eléctrodos deve ser bilateral em meados da região da uretra.
7. Amarre os dois eletrodos juntamente com sutura de monofilamento não absorvível de 6-0.
8. Sutura o eletrodo marcado nulo para o músculo da parede abdominal a distância da uretra. Amarre todos os três eletrodos juntamente com uma sutura simples.

5. encapsulamento

1. Faça uma incisão de pele pequena entre as escápulas para encapsulamento.
2. Túnel fios eletrodos no pescoço e fazer uma verificação final para colocação correta e verificar a posição dos eléctrodos depois de tunelamento.
3. Cateter de bexiga de túnel para o nível de escápula - preste atenção à bexiga enquanto o cateter para evitar a torção da bexiga de encapsulamento. Para este fim, segure o cateter antes de entrar a cúpula da bexiga para evitar a torção da bexiga.
4. Fechar os músculos abdominais por pontos contínuos ou separados com uma sutura absorvível de polyfilament 4-0. Feche a incisão cutânea por suturas interrompidas.
5. Estica o animal em todo o seu comprimento ter distensão máxima dos fios eletrodo e cateter.
6. Consertar o cateter e eletrodo fios por uma sutura afundado-para o músculo do ombro.
7. Feche a pele por um único ponto com a sutura de 4-0.

6. cinto encaixe

1. Encaixar um arnês para o animal, puxando o cinto na cabeça do animal e puxar os membros dianteiros para uma posição final entre as tiras de duas silicone. Verifique o tamanho da selete pelo peso do animal antes da cirurgia com o distribuidor.
2. Túnel do cateter da bexiga para o furo central do chicote de fios e eletrodos através do furo feito sob medido por uma broca ajustado para o tamanho dos fios eletrodo.
3. Ajuste o cinto puxando as tiras de silicone. Ajustar o arnês assim que não é muito folgado, mas certifique-se de que algum espaço permanece manter a capacidade de movimento do rato.
4. Use uma cinta de cabo para corrigir as tiras de silicone.
5. Cortar o comprimento do cateter da bexiga a 3 cm acima do arnês, ligue para a rolha de 23-G e finalmente corrigi-lo para o chicote de fios.

7. fabricação do eletrodo conector

1. Prepare-se três tubos de calor pequeno psiquiatra (uma cor diferente para o elétrodo nula). Prepare-se dois tubos de encolher calor adicionais em um tamanho maior adequado.
2. Encurte o comprimento dos fios eletrodo para um comprimento ideal para poder ligar mais tarde para o plugue fêmea sem ser demasiado curto ou demasiado solta. Tira o isolamento de Teflon dos três fios (cerca de 2 mm) e torcer os fios de aço para uma sequência de caracteres.
3. Coloque tubos de calor grande psiquiatra sobre todos os fios, coloque os tubos pequenos individualmente para todos os três fios e usar o tubo colorido para o elétrodo nulo.
4. Solde os eléctrodos para a 3-conexão-macho. Coloque o eléctrodo nulo no meio e diminuir a área de três pequenos tubos individuais acima soldadas.
5. Encolha o primeiro os tubos maiores ao final das terminações tubo individuais e o tubo grande final para a fronteira de macho.
6. Conecte o plugue macho ao conector fêmea fixado ao arnês e reparo com um pedaço de fita para ainda mais segurança.

8. cuidados pós-operatório de

1. Áreas cirúrgicas de limpar e desinfetar com iodo-povidona.
2. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento até acordado e dar a solução de cloreto de sódio 0,9% para a substituição da água, baseada nas orientações locais de cuidado animal, durante e após a cirurgia.
3. Administrar analgésicos (meloxicam 1 mg/kg) e antibióticos (sulfadoxinum 200 mg, trimethoprimum 40 mg, 15 mg/kg) como uma solução combinada de injeção por via subcutânea. Duas vezes por dia, dar analgésicos (manhã e noite) e uma vez por dia dar antibióticos, por cinco dias subsequentes.
4. Continue com os antibióticos na mesma dosagem ao longo do período todo acompanhamento em duas ou três injeções por semana.
5. Verifique diariamente encaixe apropriado do cinto de segurança e execute uma inspeção de campo cirúrgico, especialmente da região de pescoço. Ajuste o arnês, se fica muito apertado puxando cuidadosamente para as tiras de silicone.
6. Irrigue o cateter regularmente uma vez por semana para evitar um bloqueio.

9. preparação para medição de Cystometric

1. Realizar as medições de cystometric primeiras após seis dias de pós-operatório.
   Nota: As medições anteriores podem ser influenciadas pela irritação de medicação e/ou urotelial analgésica devido a implantação do cateter.
2. Ligue o interruptor principal, o computador e o amplificador de EMG.
3. Encha a bomba de seringa com temperatura aquecida 0,9% de cloreto de sódio. Abrir os conectores de três vias, um após o outro, de forma decrescente, a partir da bomba e liberar os tubos.
   Nota: Verifique cuidadosamente restantes bolhas de ar, como bolhas irão alterar as medições cystometric.

10. calibração

1. Inicie o software de uroflowmeter do programa e ir para calibração.
2. Feche o conector de três vias para a bomba e o animal.
3. Abra a válvula para o manómetro conectado e pressione zero no programa.
4. Ajustar a pressão no manómetro para 100 mmHg e pressione o botão de 100 mmHg no programa. Pressione confirmar para salvar o ajuste de calibração. A janela vai fechar automaticamente.
5. Feche a válvula para o manômetro e abrir os conectores de três vias da bomba para o animal esteja pronto para a medição.

11. animal (Animal DB) do banco de dados

1. Para registrar os animais, dar o animal uma identificação concisa.
2. Insira os dados complementares, tais como data de SCI, início do tratamento, data de implantação do cateter, grupo experimental e a data de nascimento do animal.
3. Para finalmente registrar em log os dados, pressione "loja de registro" e salvar em arquivo.

12. medição configurações antes da gravação

1. Inicie o programa de software, pressionando o botão Iniciar.
2. Selecione o animal e clique em escala de Tara e pressão zero.
   Nota: Preste atenção ao colocar o animal para a retenção, tal que nenhum cabo está preso, como isto poderia levar a uma remoção de um cabo de EMG.

13. animal preparação

1. Retire a ficha de cateter e desconecte o plugue de EMG do arnês.
2. Coloque o rato na retenção. Feche a retenção e tranque o chicote de fios com uma pinça.
3. Se o cateter e a ficha de EMG fora da retenção.
4. Lugar a retenção na unidade catamount. Colocar a cauda através do tubo e fixe o tubo com fita para evitar movimentos.
5. Conecte o plugue macho do EMG conector fêmea de EMG a gravação.
6. Pressione a pressão zero mais uma vez e depois conectar o cateter ao tubo de enchimento/gravação. Verifique a pressão no software.
   Nota: A pressão deve ser positiva, em torno de 5 a 10 cm H₂O na linha de base. Se a pressão for negativa, desconectar o cateter a cânula, pressione pressão zero e então reconecte o cateter.

14. gravação

1. Se o cateter e o EMG cabo estiver conectados, pressione gravação e execução de bomba.
2. Adapte a velocidade de enchimento para as necessidades experimentais em µ l/min.
3. Observe o tempo de início da gravação e da temperatura no diário de bordo.
4. Para parar a gravação cystometric, parar a bomba por bomba pressionando a executar e pressione gravar mais uma vez.
   Nota: A bomba será desligada e a luz verde na bomba está desligado.
5. Desconectar o cateter e use a ficha de rolha de 23G para fechar a extremidade do cateter. Desconecte o cabo de EMG.
6. Abrir a frente da retenção e guia o rato fora da retenção.
   Nota: Manuseie com cuidado o rato e monitorar os fios para evitar qualquer bloqueio dos cabos.
7. Conecte o cateter volta o arnês. Volte a ligar a ficha do EMG ao arnês e colocar um pedaço de fita em torno do plug.
   Nota: Se o animal tem uma patologia do trato urinário inferior, expressa a bexiga no final manualmente para evitar o overdistention da bexiga.
8. Coloque o animal de volta em sua gaiola em casa.
9. Feche o programa pressionando a saída.
10. Limpe a retenção e o copo.
11. Perto dos conectores de três vias para a bomba e a saída de animais.
12. Desligar o computador, a unidade de EMG e o sistema através do interruptor principal.
    Nota: Dados são salvos na pasta "Dados de sessão" separada com o arquivo de subpasta do rato medido ID. Única gravações são classificadas nas pastas de ID único rato por data.

Resultados

Um esquema mostrando o processo de cystometric acordado medições é apresentado na Figura 1 e a anatomia interna para implantação do cateter da bexiga é mostrada na Figura 2. Cirurgia leva aproximadamente 2 h. analgesia pós-operatória de antibióticos, conforme descrito no protocolo, dor e infecções durante cinco dias após a cirurgia. Não há sinais de dor foram notados posteriormente. Duas vezes por dia inspeção cui...

Discussão

Este protocolo descreve o procedimento cirúrgico de um cateter permanente e implantação de eléctrodos do esfíncter uretral e a cystometric técnica de gravação em ratos acordados, levemente comedidos, incluindo tanto a análise simultânea da bexiga urinária e esfíncter uretral externo.

Passos críticos durante a cirurgia são a implantação do cuidado do cateter da bexiga, evitando fugas e extensiva manipulação. Além disso, uma implantação precisa dos eletrodos bilaterais para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing PE 50	Becton Dickinson	427411	Catheter
Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c)	Ethicon	EH7403H	Suture
Teflon coated steel wire	Cooner wire	AS631	Electrode material
Silver wire 0.250 mm	World Precision Instruments	AGW1030	Electrode material
Rotilabo - PVC tube	Carl Roth	97241	Harness
Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c)	Ethicon	V4940H	Suture
Quick Connect Single Harness	SAI Infusion Technologies	QCH-23CW	Harness
Shrinking tubes	ChiliTec	17894	Electrode soldering
Soldering wire Pb60 Sn40	Stannol	LD0029	Electrode soldering
Fluxing agent 157	Castolin Eutectin	157 0150	Electrode soldering
Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	801-87-050-10-001101	Electrode soldering
Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	890-18-003-10-001101	Electrode soldering
Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis)	Catamount Research and Development Inc.	CAT-CYT-R
Differential amplifier with active headstage	AD instruments	DP-311	EMG amplifier
Restrainer Medium size for rats 200-300 g	emka Technologies	HLD-RM
Uro Dyn Software	Zürich of University		MTA-based
Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age	Charles River, Sulzfeld, Germany		animals