Zystometrischen und externen urethralen Sphincter Messungen in wach Ratten mit implantierten Katheter und Elektroden für wiederholte Messungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt zunächst den chirurgischen Eingriff der permanenten Implantation eines Harnblase Katheters in Kombination mit externen urethralen Sphinkter Elektroden, und zweitens die Messung der Funktion der Harnblase und Harnröhre externen Schließmuskel bei implantierten wach Tieren.

Zusammenfassung

Unteren Harnwege Funktion wird hauptsächlich durch zystometrischen Blase Funktionsanalyse bei Nagetieren beurteilt. Herkömmliche Cystometries werden in der Regel als terminal Analyse Urethan Narkose durchgeführt. Es ist bekannt, dass Anästhetika Blasenfunktion beeinflussen können. Daher ist das Ziel dieser Technik zystometrischen Messungen der Harnblase und der externen urethralen Sphinkter in leicht zurückhaltende wach Ratten durchführen. Zu diesem Zweck wird ein Blasenkatheter in die Blase Kuppel eingepflanzt. Anschließend werden zwei Elektroden zu den externen urethralen Sphinkter bilaterale implantiert und eine Masseelektrode mit eine nicht reagierende skelettartiger Muskel vernäht ist. Der Blasenkatheter und die drei Elektroden sind schließlich getunnelt subkutan in der Hals-Region und an einem Gurt befestigt. Mit dieser Technik kann der ableitenden Harnwege zu mehreren Zeitpunkten im gleichen Tier zur Bewertung der unteren Harnwege Funktion gemessen werden. Die Anwendung dieser Technik ist das Follow-up der gleichzeitigen Harnblase und externen urethralen Sphinkter Funktion wach gesund Ratten und nach Induktion einer Krankheit oder Verletzung. Darüber hinaus kann bei der Auswertung der Krankheit/Verletzung und Wirksamkeit der Behandlung zu überwachen anschließende unteren Harnwege Überwachung durchgeführt werden.

Einleitung

Harn Lagerung und Entleerung, Funktion und Dysfunktion zu analysieren, haben die meisten Studien Nager-Modelle verwendet. Durch sequentielle Aktivierung der Reflexe Miktion entsteht. Die Koordination dieser Reflexe ist Voraussetzung für effiziente Entleerung¹. Zystometrischen Aufnahmetechniken bieten wertvolle Werkzeuge für die Analyse der Harnblase-Funktion unter seiner neuronalen Kontrolle¹.

Die meisten herkömmlichen Cystometries in Ratten als eine einzige, letzte Analyse in Anästhesie, hauptsächlich Urethan²fertig sind und konzentrieren sich ausschließlich auf die Harnblase. Jedoch in einigen Pathologien wie neurogene unteren Harnwege Dysfunktion (NLUTD) ist nicht nur die Harnblase, sondern auch die Blase Steckdose, den externen urethralen Sphinkter dysfunktionalen^3,4. Dies erschwert NLUTD, Follow-up, wenn nur die Blase in einer einzigen zystometrischen Messung untersucht wird. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, die auf den Menschen vergleichbar sind, ist es unerlässlich, sowohl der Harnblase und der externen urethralen Sphinkter Funktion und seine Interaktionen²genau zu messen. Darüber hinaus ist es entscheidend, Funktionsanalysen in wach Ratten durchzuführen, da Anästhesie sehr Blase Funktion^2,5,6ändern dürfte. Eine gute zystometrischen Aufnahme in wach Tiere ist die Grundlage für die Identifizierung der Blase Funktion und Störung⁷.

Die kleinen Tiere Cystometry Station verwendet (z. B.Catamount Cystometry Station (CCS)) ist eine Einheit, zystometrischen Analysen in wach Kleintiere⁸durchzuführen. Mit Hilfe einer permanenten Blasenkatheter und implantierten externen urethralen Sphinkter Elektroden können sich wiederholende Messungen über eine längere Zeit Perioden²durchgeführt werden. So bietet die CCS ein wertvolles Instrument für nicht-neurogenen und NLUTD Auswertungen im Nagetier-Modell, in dem die Pathomechanismen während kurz- oder mittelfristigen Follow-up ändern können. Darüber hinaus enthält diese Methode eine Artefakt-reduzierte zystometrischen Analyse mithilfe eine einschränkende Blase Messungen in wach Ratten durchführen.

In diesem Artikel beschreiben wir das chirurgische Vorgehen um dauerhaft einen Blasenkatheter und externen urethralen Sphinkter Elektroden, zusammen mit zystometrischen Messungen in wach Ratten einnisten.

Protokoll

Alle hier beschriebene Verfahren wurden von der österreichischen staatlichen Ethikkommission für Tierversuche genehmigt (Bundesministeriums Für Wissenschaft, Forschung Und Wirtschaft, WF / V /3b) und wurden in Übereinstimmung mit der Association for Assessment of Laboratory Tier Pflege-Richtlinien für die Verwendung von Tieren. Ratten verwendet für diesen Ansatz waren weiblich, 12 Wochen altes Baby Lewis-Ratten. Verwenden Sie sterile Instrumente im gesamten Protokoll.

1. materielle Vorbereitung

1. Herstellung des Katheters
   1. Schneiden Sie den Katheter (Polyethylen-Rohre PE-50) in entsprechender Länge (20 bis 25 cm), die Größe des Tieres angepasst.
      Hinweis: Lassen Sie einige zusätzliche Länge für Tunnel- und einfachere Handhabung.
   2. Aufflammen Sie einem Ende mit einem Feuerzeug zu einer abgerundeten Spitze. Endgültige entsprechende Öffnung und stumpfen Ende des Katheters kontrollieren.
   3. Legen Sie eine 2 mm langen Silikonschlauch über den Katheter bis knapp unterhalb der ausgestellten Ende liegt.
2. Herstellung von Elektroden
   1. Bereiten Sie einen Polytetrafluorethylen beschichtet Stahldraht von 20-25 cm (entsprechende Länge je nach Größe des Tieres).
   2. Bereiten Sie ein Silberdraht 2 cm in der Länge und drehen Sie die Enden, bis eine kleine Schleife bleibt. Streifen Sie aus 2 mm der Teflon-Isolierung an einem Ende. Löten Sie die verdrehten Silberdraht Stahl abisolierte Ende.
   3. Gelten Sie herkömmlichen Nagellack an der Beschichtung-Zone. 4 mm lange Polyethylen-Schlauch über die beschichtete Region vorbereiten, und am Ende durch Anwendung von Hitze zu komprimieren Zange verschließen.

2. tierische Vorbereitung

1. Anästhesie
   1. Verwendung einer geeigneten Anästhesie cocktail genehmigt von der Institution für eine allgemeine Anästhesie.
   2. Bereiten Sie Anästhesie-Cocktail mit Medetomidine (0,15 mg/kg), Midazolam (0,08 mg/kg) und Fentanyl (0,01 mg/kg) und intramuskulär injizieren durch eine 1 mL Spritze mit einer 27 Gauge-Nadel.
2. OP-Vorbereitung
   1. Rasieren Sie den Bauch mit einem elektrischen Rasierer, einschließlich der Genitalbereich und Rückenbereich auf der Ebene der Scapulae.
   2. Desinfizieren Sie Bauch und Hals Regionen mit 70 % Ethanol erste und dann 3 alternierenden Peelings mit Povidon-Jod-Lösung.

3. Blase Katheter Implantation

1. Mit einem Skalpell für die Haut und eine chirurgische Schere für die Bauchmuskulatur durchführen Sie niedrigen Mittellinie Laparotomie auf Ebene der dritten und vierten Sauger (ca. 2 bis 2,5 cm in der Länge).
2. Setzen Sie die Blase durch die Bauchdecke in die Cranio-caudale Richtung führen und beheben Sie es in dieser Position zu, indem man das Ende einer Pinzette hinter der Blase, Re-Positionierung zu vermeiden.
3. Legen Sie eine Tabaksbeutelnaht um die Blase Kuppel mit einer 6-0 nicht resorbierbar Monofil Naht mit einem Kegel-Spitze Nadel.
4. Einschneiden der Blase Kuppel innerhalb der Geldbörse-String, per Skalpell Tipp oder 18G Nadel der Blasenkatheter einfügen (siehe Protokoll Schritt 1).
5. Legen Sie den Katheter mit der sterilen physiologischen 0,9 % Natriumchlorid-Lösung vorausgefüllt und zurückziehen Sie Katheter vorsichtig, bis ausgestellte Eröffnung des Katheters sich direkt unterhalb der Blase Kuppel befindet.
6. Sichern Sie der Tabaksbeutelnaht rund um den Katheter und machen Sie eine Stop-Naht um Katheter Körper für weitere Fixierung.
7. Suchen Sie nach Leckage über die Blase Kuppel füllen Sie langsam die Blase über den Katheter mit steriler physiologischer 0,9 % Natriumchlorid-Lösung.

(4) Harnröhre Schließmuskel Elektrode Implantation

1. Drei Elektroden für die Implantation vorbereiten (siehe Protokoll Schritt 1).
2. Markieren Sie eine Elektrode mit einem farbigen permanente Filzstift für weitere Kennzeichnung der zukünftigen null Elektrode. Elektroden mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.
   Hinweis: Die Katheter eignen sich nicht für Wärme und chemischen Sterilisationsverfahren. Stattdessen kalt sterilisieren Sie die Elektroden für 24 h.
3. Erweitern Sie der Bauchschnitt durch chirurgische Scheren bis zu dem Schambein, aber schneiden Sie der Schambeinfuge nicht.
4. Identifizieren Sie die Harnröhre zu und erstellen Sie eine stumpfe Tasche mit feinen Pinzette auf beiden Seiten der Harnröhre, aber vermeiden Sie Trauma der Gefäße oder Nerven zu.
5. Geeignete Fette Beutel in der Nähe der Harnröhre innerhalb dieses Fensters zu identifizieren.
6. Beheben Sie Elektroden auf bilateraler Ebene zu den entsprechenden Fett Beutel mithilfe der 6-0 nicht resorbierbare monofile Faden.
   Hinweis: Die endgültige Position der Elektroden sollte in der mittleren Region der Harnröhre bilaterale.
7. Binden Sie die beiden Elektroden mit 6-0 nicht resorbierbare monofile Faden.
8. Naht der markierten null Elektrode an der Bauchwand Muskel in Entfernung der Harnröhre. Binden Sie alle drei Elektroden zusammen mit einer einzigen Naht.

(5) tunneling

1. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt zwischen die Schulterblätter für den Tunnelbau.
2. Tunnel Elektrodenleitungen an den Hals und eine abschließende Kontrolle für die richtige Platzierung, und überprüfen Sie die Position der Elektroden nach Tunneln.
3. Tunnel Blasenkatheter zum Schulterblatt Level - achten Sie auf die Blase beim Tunnelbau des Katheters um Blase Verdrehen zu vermeiden. Halten Sie zu diesem Zweck den Katheter kurz vor dem Eintritt der Blase Kuppel um zu vermeiden, Verdrehen der Blase.
4. Schließen Sie Bauchmuskeln durch kontinuierliche oder unterbrochene Stiche mit einer 4: 0 Polyfilament resorbierbaren Naht. Schließen Sie der Hautschnitt durch unterbrochene Matratze Nähte.
5. Dehnen Sie das Tier auf seine volle Länge maximale Ausdehnung der Elektrodenleitungen und Katheter zu haben.
6. Beheben Sie Katheter und Elektrode Leitungen durch eine versenkt in Naht, der Schultermuskel.
7. Schließen Sie die Haut durch einen einzigen Stich mit dem 4: 0-Naht.

(6) Gurt Montage

1. Passt ein Geschirr, das Tier durch Ziehen des Gurts über den Kopf des Tieres, und ziehen Sie die Vorderbeine ein End-Position zwischen den zwei Silikon-Streifen. Überprüfen Sie die Kabelbaum-Größe durch das Gewicht des Tieres vor der Operation mit dem Distributor.
2. Tunnel der Blasenkatheter zum zentralen Loch der Kabelbaum und Elektroden durch das maßgeschneiderte Loch von einer Bohrmaschine angepasst an die Größe der Elektrodenleitungen.
3. Passen Sie den Kabelbaum durch Ziehen der Silikon-Streifen. Passen Sie der Kabelbaum an, so dass es nicht zu locker, aber sicherzustellen Sie, dass etwas Platz bleibt, um die beweglichen Fähigkeit der Ratte zu erhalten.
4. Verwenden Sie einen Kabelbinder um Silikon Streifen fixieren.
5. Schneiden Sie die Länge der Blasenkatheter bis 3 cm oberhalb der Kabelbaum, verbinden Sie mit den 23 G stopfen und schließlich an den Gurt befestigen.

7. Herstellung von der Elektrode-Connector

1. Bereiten Sie drei kleine Schrumpfschläuche (eine andere Farbe für die null-Elektrode). Bereiten Sie zwei weitere Schrumpfschläuche in eine geeignete größere Größe.
2. Verkürzen Sie die Länge der Elektrodenleitungen auf eine optimale Länge, später in die Buchse einstecken ohne zu locker oder zu kurz zu sein zu können. Abstreifen der Teflon-Isolierung der drei Drähte (ca. 2 mm), und drehen Sie die Stahldrähte in eine Zeichenfolge.
3. Legen Sie große Schrumpfschläuche über alle Kabel, legen Sie die kleinen Rohre einzeln für alle drei Drähte und verwenden Sie das farbige Rohr für die null Elektrode.
4. Löten Sie die Elektroden an den 3-Anschluss-Stecker. Platzieren Sie die null Elektrode in der Mitte zu, und schrumpfen Sie Bereich drei einzelne Röhrchen oben gelötet.
5. Schrumpfen Sie das erste größere Schläuche am Ende der einzelnen Röhre Endungen und die letzte große Röhre bis zur Grenze der Stecker.
6. Schließen Sie den Stecker an die Buchse der Kabelbaum und befestigen Sie mit einem Stück Klebeband für weitere Sicherheit fixiert.

8. postoperative Pflege

1. Chirurgische Bereiche reinigen und desinfizieren mit Povidon-Jod.
2. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen bis wach und geben Sie 0,9 % Natriumchlorid-Lösung für die Substitution von Wasser, basierend auf den lokalen Tierpflege Richtlinien während und nach der Operation.
3. Verwalten von Analgetika (Meloxicam 1 mg/kg) und Antibiotika (Sulfadoxinum 200 mg, Trimethoprimum 40 mg, 15 mg/kg) als eine kombinierte Injektionslösung subkutan. Zweimal täglich, Analgetika (morgens und abends), und einmal pro Tag geben Sie Antibiotika, für fünf nachfolgende Tage.
4. Fahren Sie mit Antibiotika in der gleichen Dosierung im gesamten Follow-up Zeitraum auf zwei bis drei Injektionen pro Woche.
5. Überprüfen Sie täglich, für passende des Kabelbaums und durchzuführen Sie eine OP-Feld-Inspektion, vor allem des Halsbereiches. Passen Sie das Geschirr, wenn es zu eng wird, sorgfältig auf die Silikon-Streifen ziehen.
6. Spülen des Katheters regelmäßig einmal pro Woche, um eine Blockade zu vermeiden.

9. Vorbereitung zur zystometrischen Messung

1. Führen Sie die erste zystometrischen-Messungen nach sechs postoperativen Tagen.
   Hinweis: Frühere Messungen können durch schmerzstillende Medikamente und/oder important Reizung durch die Katheter-Implantation beeinflusst werden.
2. Schalten Sie den Hauptschalter, der Computer und der EMG-Verstärker.
3. Füllen Sie die Spritzenpumpe mit Raumtemperatur erwärmt 0,9 % Natriumchlorid. Öffnen Sie die Dreiwege Stecker ein nach dem anderen in einer absteigenden Weise, ausgehend von der Pumpe und spülen Sie die Rohre.
   Hinweis: Prüfen Sie sorgfältig verbleibenden Luftblasen Luftblasen die zystometrischen Messungen verändern werden.

10.-Kalibrierung

1. Starten Sie das Programm Uroflowmeter Software und gehen Sie zu kalibrieren.
2. Schließen Sie den Dreiwege Stecker für die Pumpe und das Tier.
3. Öffnen Sie das Ventil auf die angeschlossenen Manometer und drücken Sie die Null in das Programm.
4. Anpassen der Druck am Manometer zu 100 MmHg und 100 MmHg Taste im Programm. Presse bestätigen, um die Kalibrierung Einstellung zu speichern. Das Fenster wird automatisch geschlossen.
5. Schließen Sie das Ventil, Manometer und öffnen Sie die drei-Wege-Stecker von der Pumpe zum Tier für die Messung bereit.

11. Tiere Datenbank (Tier DB)

1. Um Tiere zu registrieren, geben Sie dem Tier eine prägnante-ID.
2. Geben Sie weitere Daten, wie z. B. Datum der SCI, Beginn der Behandlung, Datum der Katheter Implantation, experimentelle Gruppe und das Geburtsdatum des Tieres.
3. Um schließlich die Daten protokollieren, drücken Sie auf "Eintrag speichern" und speichern in Datei.

12. Messung Einstellungen vor der Aufnahme

1. Starten Sie das Softwareprogramm durch Drücken der Schaltfläche "Start".
2. Wählen Sie das Tier, und drücken Sie Tara Waage und null Druck.
   Hinweis: Achten Sie beim Aufsetzen des Tieres in die Restrainer derart, dass keine Kabel stecken, da dies zu einer Entfernung eines Drahtes des EMG-Kabels führen könnte.

13. Tiere Vorbereitung

1. Entfernen Sie den Katheter stopfen und die EMG-Stecker aus dem Gurtzeug.
2. Legen Sie die Ratte in die Restrainer. Die Restrainer schließen und Verriegeln des Gurts mit einer Klammer.
3. Bekommen Sie Katheter und EMG-Stecker aus dem Restrainer.
4. Legen Sie die Restrainer in der Catamount Einheit. Legen Sie das Heck durch das Rohr und fixieren Sie das Rohr mit Klebeband, Bewegungen zu vermeiden.
5. Verbinden Sie den Stecker der EMG Aufnahme Buchse EMG.
6. Drücken Sie null Druck noch einmal und schließen Sie dann den Katheter an der Füllung/Aufnahme-Röhre. Überprüfen Sie den Druck in der Software.
   Hinweis: Druck sollte positiv, um 5-10 cm H₂O bei Studienbeginn. Wenn der Druck negativ ist, trennen Sie die Kanüle Katheter, drücken Sie die Taste null Druck und schließen Sie den Katheter.

14.-Aufnahme

1. Wenn der Katheter und EMG-Kabel verbunden sind, drücken Sie laufen Pumpe und Aufnahme.
2. Die Füllgeschwindigkeit auf die experimentelle Bedürfnisse in μl/min anzupassen.
3. Notieren Sie sich die Zeit startet die Aufnahme und die Raumtemperatur im Logbuch.
4. Um die zystometrischen, die Aufnahme zu stoppen, stoppen Sie die Pumpe vom drücken, führen Sie Pumpe und drücken Sie erneut aufnehmen.
   Hinweis: Die Pumpe wird ausgeschaltet und das grüne Licht an die Pumpe ausgeschaltet ist.
5. Trennen Sie den Katheter und mit 23G Stopfen Stecker am Ende des Katheters in der Nähe. Trennen Sie das EMG-Kabel.
6. Öffnen der Front die Restrainer und die Ratte aus dem Restrainer zu führen.
   Hinweis: Ratte sorgfältig zu behandeln und die Drähte um zu vermeiden, Sperren von Kabeln zu überwachen.
7. Stecken Sie den Katheter zurück ins Gurtzeug. Wieder den Stecker EMG am Gurtzeug, und legen Sie ein Stück Klebeband um den Stecker.
   Hinweis: Falls das Tier ein pathologischen Zustands der unteren Harnwege, Ausdrücken der Blase am Ende manuell zu Overdistention der Blase zu vermeiden.
8. Setzen Sie das Tier wieder in seine Heimat Käfig.
9. Schließen Sie das Programm durch Drücken der Exit.
10. Reinigen Sie die einschränkende und Becher.
11. Schließen Sie die Dreiwege Anschlüsse an der Pumpe und dem Tier Auslauf.
12. Herunterfahren des Computers, das EMG-Gerät und das System über den Hauptschalter.
    Hinweis: Daten werden in separate Ordner "Logged Data" mit der Unterordner-Datei der gemessenen Ratte ID. gespeichert Einzelne Aufnahmen werden in die einzige Ratte ID Ordner nach Datum sortiert.

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung zeigt den Prozess der wach zystometrischen Messungen ist in Abbildung 1 dargestellt, und die innere Anatomie für eine Blase-Katheter-Implantation ist in Abbildung 2dargestellt. Operation dauert ca. 2 h. Postoperative Analgesie und Antibiotika, da im Protokoll beschrieben umfassen Schmerzen und Infektionen über fünf Tage nach der Operation. Danach wurden keine Anzeichen von Schmerzen bemerkt. Zweim...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt den chirurgischen Eingriff eine permanente Katheter und Harnröhre Schließmuskel Elektroden Implantation und die zystometrischen Aufnahme Technik in wach, leicht zurückhaltende Ratten unter anderem sowohl die gleichzeitige Analyse der Harnblase und externen urethralen Sphinkter.

Wichtige Schritte während der Operation sind die sorgfältige Implantation von Blasenkatheter, Vermeidung von Leckagen und umfangreiche Manipulation. Darüber hinaus ist eine präzise Imp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing PE 50	Becton Dickinson	427411	Catheter
Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c)	Ethicon	EH7403H	Suture
Teflon coated steel wire	Cooner wire	AS631	Electrode material
Silver wire 0.250 mm	World Precision Instruments	AGW1030	Electrode material
Rotilabo - PVC tube	Carl Roth	97241	Harness
Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c)	Ethicon	V4940H	Suture
Quick Connect Single Harness	SAI Infusion Technologies	QCH-23CW	Harness
Shrinking tubes	ChiliTec	17894	Electrode soldering
Soldering wire Pb60 Sn40	Stannol	LD0029	Electrode soldering
Fluxing agent 157	Castolin Eutectin	157 0150	Electrode soldering
Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	801-87-050-10-001101	Electrode soldering
Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	890-18-003-10-001101	Electrode soldering
Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis)	Catamount Research and Development Inc.	CAT-CYT-R
Differential amplifier with active headstage	AD instruments	DP-311	EMG amplifier
Restrainer Medium size for rats 200-300 g	emka Technologies	HLD-RM
Uro Dyn Software	Zürich of University		MTA-based
Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age	Charles River, Sulzfeld, Germany		animals