Mesures de Sphincter urétral cystométriques et externe chez le rat éveillé avec cathéter implanté et électrodes permettant des mesures répétées

Résumé

Ce protocole décrit d’abord l’intervention chirurgicale de l’implantation permanente d’un cathéter de vessie combinée avec électrodes du sphincter urétral externe et, deuxièmement, la mesure de la fonction de la vessie et l’urètre externe sphincter chez des animaux éveillés implantés.

Résumé

Fonction urinaire inférieur est principalement évaluée au moyen d’une analyse de fonction vessie cystométriques chez les rongeurs. Cystometries classiques sont généralement effectués comme terminal analyse sous anesthésie uréthane. Il est bien connu que les drogues anesthésiques peuvent influencer la fonction vésicale. Par conséquent, le but de cette technique est d’effectuer des mesures cystométriques de la vessie et le sphincter urétral externe chez le rat éveillé légèrement restreint. Pour cela, une sonde vésicale est implantée dans le dôme de la vessie. Par la suite, les deux électrodes sont implantées bilatéral au sphincter urétral externe et une électrode de masse est suturée à un muscle squelettique non recevable. Le cathéter de la vessie et les trois électrodes sont enfin en tunnel par voie sous-cutanée à la région du cou et apposés à un harnais. Avec cette technique, les voies urinaires basses peuvent être mesurés à plusieurs points dans le temps chez le même animal pour évaluer la fonction des voies urinaires inférieure. Le principal de l’application de cette technique est la suite de simultanée de la vessie et de la fonction du sphincter urétral externe chez le rat sain éveillé et après induction d’une maladie ou une blessure. En outre, suivi des voies urinaires inférieures peut être effectuée au cours de l’évaluation de la maladie/blessure ainsi qu’à surveiller l’efficacité du traitement.

Introduction

Pour analyser le stockage urinaire et invalider la fonction ou la dysfonction, la plupart des études ont utilisé des modèles de rongeurs. Grâce à l’activation séquentielle des réflexes, la miction est produite. La coordination de ces réflexes est essentielle pour les mictions efficace¹. Techniques d’enregistrement cystométriques fournissent des outils précieux pour analyser la fonction vessie sous son contrôle neural¹.

Cystometries plus classiques chez les rats se font comme une analyse unique et définitive en anesthésie, principalement uréthane²et mettre l’accent uniquement sur la vessie. Toutefois, dans certaines pathologies comme le dysfonctionnement urinaire inférieur neurogène (NLUTD), non seulement de la vessie, mais aussi de la vessie, le sphincter urétral externe, est dysfonctionnel^3,4. Il est NLUTD difficile de suivi, si seulement la vessie est examinée dans une mesure unique cystométriques. Pour obtenir des résultats fiables qui sont comparables aux humains, il est essentiel de mesurer avec précision la vessie et de la fonction du sphincter urétral externe et de ses interactions². En outre, il est essentiel d’effectuer des analyses fonctionnelles chez le rat éveillé que l’anesthésie est très susceptible d’altérer la vessie fonction^2,5,6. Un bon cystométriques enregistrement chez l’animal éveillé est la base pour l’identification de la vessie fonction et mauvais fonctionnement⁷.

La station de petits animaux cystométrie utilisée (p. ex., station de cystométrie Catamount (CCS)) est une unité d’effectuer des analyses de cystométriques en petits animaux éveillés⁸. Au moyen d’une sonde vésicale permanente et électrodes implantés sphincter urétral externe, mesures répétitives peuvent être effectuées sur un plus long temps périodes². Ainsi, la CSC fournit un outil précieux pour les non-neurogène et évaluations de NLUTD dans le modèle de rongeur, dans lequel les pathomécanismes peut changer au cours du suivi de court ou moyen terme. En outre, cette méthode comprend une analyse de cystométriques artefact-réduite en utilisant une drisse pour effectuer des mesurages de la vessie chez le rat éveillé.

Dans cet article, nous décrivons l’approche chirurgicale pour implanter définitivement un cathéter de la vessie et les électrodes du sphincter urétral externe, ainsi que de mesures cystométriques chez le rat éveillé.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique gouvernementale autrichienne pour la recherche sur les animaux (Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, WF / V /3b) et ont été en conformité avec l’Association pour l’évaluation de laboratoire Animal Care lignes directrices pour l’utilisation des animaux. Les rats utilisés pour cette approche étaient rats Lewis femelles, âgés de 12 semaines. Utiliser des instruments stériles dans tout le protocole.

1. matérielle préparation

1. Fabrication du cathéter
   1. Couper le cathéter (tuyaux en polyéthylène PE-50) de longueur appropriée (20 à 25 cm) à la taille de l’animal.
      Remarque : Laissez une longueur supplémentaire pour l’encapsulation et la manipulation plus facile.
   2. Attise une extrémité avec un briquet pour obtenir une extrémité arrondie. Vérifier la dernière ouverture appropriée et l’extrémité arrondie du cathéter.
   3. Placer un tube de silicone long de 2 mm sur le cathéter jusqu'à ce qu’il se trouve juste en dessous de l’extrémité évasée.
2. Fabrication des électrodes
   1. Préparer un fil d’acier enduit de polytétrafluoroéthylène de 20-25 cm (longueur appropriée selon la taille de l’animal).
   2. Préparer un fil d’argent 2 cm de longueur et torsadez les extrémités jusqu'à ce qu’une petite boucle reste. Enlever 2 mm de l’isolation téflon à une extrémité. Souder le fil d’argent torsadé terminé par le fil d’acier décapé.
   3. Appliquer le vernis à ongles classiques à la zone de revêtement. Préparer les longs tuyaux en polyéthylène 4 mm au-dessus de la région d’enduit et scelle la fin par application de chaleur à la pince à compression.

2. animale préparation

1. Anesthésie
   1. Utilisez une anesthésie appropriée cocktail approuvé par l’institution pour un général anesthésie.
   2. Cocktail d’anesthésie avec médétomidine (0,15 mg/kg), le midazolam (0,08 mg/kg) et le fentanyl (0,01 mg/kg), de préparer et injecter par voie intramusculaire par une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 27.
2. Préparation chirurgicale
   1. L’abdomen vous raser avec un rasoir électrique, y compris la région génitale et la région lombaire au niveau des omoplates.
   2. Désinfecter les abdominaux et le cou de régions avec 70 % éthanol premiers et puis 3 alternance gommages avec solution de povidone-iode.

3. Implantation de cathéter de la vessie

1. Effectuer une laparotomie basses de ligne médiane au niveau de la troisième et quatrième tétine (environ 2 à 2,5 cm de longueur) à l’aide d’un scalpel pour la peau et des ciseaux chirurgicaux pour les muscles abdominaux.
2. Exposer la vessie en guidant la paroi abdominale dans la direction cranio-caudale et le fixer dans cette position en plaçant le dos d’une pince derrière la vessie afin d’éviter le repositionnement.
3. Placez une suture en bourse autour du dôme de la vessie à l’aide d’une suture de monofilament non résorbable 6-0 avec une aiguille à pointe conique.
4. Inciser le dôme de la vessie à l’intérieur de la chaîne-sac à main, soit par la pointe de scalpel ou une aiguille 18G, d’insérer le cathéter de la vessie (voir protocole étape 1).
5. Insérer le cathéter rempli au préalable avec la solution stérile de chlorure de sodium 0,9 % physiologique et rétracter soigneusement le cathéter de la vessie jusqu'à ce qu’une ouverture évasée du cathéter est placée juste sous le dôme de la vessie.
6. Sécuriser la suture en bourse autour du cathéter et de faire une arrêt-suture autour de corps du cathéter pour une fixation supplémentaire.
7. Recherchez les fuites par le dôme de la vessie en remplissant lentement la vessie dans le cathéter avec une solution physiologique stérile de chlorure de sodium 0,9 %.

4. urethral Sphincter électrode Implantation

1. Préparer trois électrodes pour l’implantation (voir protocole étape 1).
2. Marquer une électrode avec un stylo feutre permanent coloré pour obtenir d’autres de l’électrode null futur. Désinfecter les électrodes avec de l’éthanol à 70 %.
   Remarque : Les cathéters ne conviennent pas pour la chaleur et les procédures de stérilisation chimique. Plutôt froid stériliser les électrodes pendant 24 h.
3. Prolonger l’incision abdominale de ciseaux chirurgicaux jusqu'à l’os pubien, mais ne coupez pas la symphyse pubienne.
4. Identifier l’urètre et créer une poche émoussée à l’aide de pinces fines sur les deux côtés de l’urètre, mais éviter les traumatismes des vaisseaux ou des nerfs.
5. Identifier appropriés pochettes graisses à proximité de l’urètre dans cette fenêtre.
6. Fixer les électrodes sur le plan bilatéral à la poche de graisse appropriée à l’aide de la suture de monofilament non résorbable 6-0.
   Remarque : La position finale des électrodes doit être bilatérale à la région moyenne de l’urètre.
7. Nouez les deux électrodes avec suture de monofilament non résorbable 6-0.
8. Suture de l’électrode de null marquée sur le muscle de la paroi abdominale à courte distance de l’urètre. Attachez tous les trois électrodes avec une suture simple.

5. tunneling

1. Faire une incision de la petite peau entre les omoplates pour le tunneling.
2. Tunnel des fils d’électrode à la nuque et faire une vérification finale pour le placement correct, vérifier la position des électrodes après la tunnelisation.
3. Cathéter de vessie tunnel au niveau des omoplates - faites attention à la vessie tout en tunnelisation le cathéter pour éviter les torsions de la vessie. Pour cela, maintenez le cathéter juste avant d’entrer dans le dôme de la vessie pour éviter les torsions de la vessie.
4. Muscles abdominaux à proximité des points de suture continues ou discontinues avec une suture résorbable polyfilament de 4-0. Refermer l’incision de la peau par des sutures de matelas interrompu.
5. Étirer l’animal sur toute sa longueur pour avoir une distension maximale du fils de l’électrode et cathéter.
6. Fixer les fils cathéter et électrode par une suture coulé dans le muscle de l’épaule.
7. Fermer la peau en un seul point avec la suture 4-0.

6. montage harnais

1. Monter un harnais à l’animal en tirant le harnais sur la tête de l’animal et tirer sur les membres antérieurs d’une fin de course entre les bandes de deux silicone. Vérifiez la taille du harnais par le poids de l’animal avant la chirurgie avec le distributeur.
2. Tunnel du cathéter de vessie dans le trou central du harnais et électrodes dans le trou fait sur mesure par une perceuse ajuste à la taille des fils électrode.
3. Régler le harnais en tirant sur les bandes de silicone. Régler le harnais n’est pas trop lâche, mais conserve sa place pour maintenir la capacité de mouvement du rat.
4. Utiliser une attache de câble pour fixer les bandes de silicone.
5. Couper la longueur de la sonde vésicale à 3 cm au-dessus du faisceau, connectez-vous à la butée de 23-G et enfin fixer le harnais.

7. fabrication du connecteur d’électrode

1. Préparer trois petite chaleur rétractables tubes (une couleur différente pour l’électrode null). Préparer deux tubes de rétrécissement de chaleur supplémentaires dans une taille plue appropriée.
2. Raccourcir la longueur des fils électrode à une longueur optimale pour pouvoir brancher plus tard à la prise femelle sans être trop lâche ou trop court. Enlever l’isolant téflon des trois fils (environ 2 mm) et torsadez les fils en acier à une chaîne.
3. Placez les tubes rétractables de grande chaleur sur tous les fils, placer les petits tubes individuellement pour les trois fils et utiliser le tube de couleur pour l’électrode null.
4. Souder les électrodes à la 3-connexion-fiche mâle. Placer l’électrode null au milieu et réduire la zone de trois petits tubes individuels ci-dessus soudés.
5. Rétrécir le premier les plus gros tubes à la fin des terminaisons tubes individuels et le gros tuyau final à la frontière de la prise mâle.
6. Branchez la fiche mâle sur le connecteur femelle fixé au harnais et fixer avec du ruban adhésif pour plus de sécurité.

8. après la chirurgie soins

1. Nettoyer les zones chirurgicales et désinfecter avec povidone-iode.
2. Placez l’animal sur un coussin chauffant jusqu'à éveillé et donner la solution de chlorure de sodium 0,9 % pour la substitution de l’eau, basée sur les directives de soins aux animaux locaux pendant et après la chirurgie.
3. Administrer les analgésiques (meloxicam 1 mg/kg) et d’antibiotiques (sulfadoxinum 200 mg, 40 mg, 15 mg/kg de trimethoprimum) comme une solution combinée injection par voie sous-cutanée. Deux fois par jour, donner des analgésiques (matin et soir) et une fois par jour donner des antibiotiques, pour cinq jours consécutifs.
4. Continuer avec des antibiotiques à la même dose au cours de la période de suivi ensemble à deux ou trois injections par semaine.
5. Vérifier tous les jours pour un raccord approprié du harnais et de procéder à une inspection du champ opératoire, en particulier de la région du cou. Régler le harnais si elle devient trop serré en tirant délicatement sur les bandes de silicone.
6. Rincer le cathéter régulièrement une fois par semaine pour éviter un blocus.

9. préparation pour la mesure cystométriques

1. Effectuer les premières mesures cystométriques après six jours post-opératoires.
   NOTE : Mesures antérieures peuvent être influencées par l’irritation de médicaments et/ou urothéliales analgésique en raison de l’implantation de cathéter.
2. Allumez l’interrupteur principal, l’ordinateur et l’amplificateur de l’EMG.
3. Remplir la seringue avec le chlorure de sodium 0,9 % température de la pièce chauffée. Ouvrir les trois voies connecteurs un après l’autre de manière descendante, à partir de la pompe et rincer les tubes.
   NOTE : Contrôler les bulles d’air, car bulles modifiera les mesures cystométriques.

10. Etalonnage

1. Lancez le programme uroflowmeter logiciel et aller à l’étalonnage.
2. Fermer le connecteur trois voies à la pompe et l’animal.
3. Ouvrez le robinet pour le manomètre connecté, puis appuyez sur zéro dans le programme.
4. Régler la pression sur le manomètre à 100 mmHg et appuyez sur le bouton 100 mmHg dans le programme. Appuyez sur confirmer pour enregistrer le réglage de l’étalonnage. La fenêtre se fermera automatiquement.
5. Fermer la vanne sur le manomètre et ouvrez les trois voies connecteurs de la pompe à l’animal d’être prêt pour la pesée.

11. animal (Animal DB) des bases de données

1. Pour l’enregistrement des animaux, donner à l’animal un code concis.
2. Entrer des données supplémentaires, telles que date de SCI, début du traitement, de la date d’implantation de cathéter, le groupe expérimental et la date de naissance de l’animal.
3. Pour enfin vous connecter les données, appuyez sur « mémoriser le dossier » et enregistrer dans fichier.

12. mesures paramètres avant enregistrement

1. Démarrez le logiciel en appuyant sur le bouton Démarrer.
2. L’animal et cliquez sur échelle de tare et de pression nulle.
   Remarque : Faire attention tout en plaçant l’animal dans la drisse, tel que le câble n’est coincé, car cela pourrait conduire à un retrait d’un fil du câble EMG.

13. préparation animaux

1. Enlever le bouchon de cathéter et débrancher l’EMG le harnais.
2. Mettre le rat dans la drisse. Fermer la drisse et verrouiller le harnais avec une pince.
3. Téléchargez le cathéter et la fiche d’EMG de la drisse.
4. Placez la drisse dans l’unité de catamount. Mettre la queue à travers le tube et fixer le tube avec du ruban adhésif pour éviter les mouvements.
5. Branchez la prise mâle de l’EMG au connecteur femelle enregistrement EMG.
6. Appuyez une fois de plus sur une pression nulle et ensuite raccorder le cathéter sur le tube de remplissage/enregistrement. Vérifiez la pression dans le logiciel.
   Remarque : La pression doit être positive, autour de 5 à 10 cm H₂O au départ. Si la pression est négative, débrancher le cathéter de la canule, appuyez sur zéro pression, et puis reconnectez le cathéter.

14. enregistrement

1. Si le cathéter et le câble de l’EMG sont connectés, appuyez sur enregistrement et exécution de pompe.
2. Adapter la vitesse de remplissage aux besoins expérimentaux en μL/min.
3. Notez l’heure l’enregistrement commence et la température de la pièce dans le registre.
4. Pour arrêter le cystométriques enregistrement, arrêter la pompe de la pompe en appuyant sur Exécuter, puis appuyez sur enregistrement une fois de plus.
   Remarque : La pompe sera éteint et le feu vert à la pompe est éteinte.
5. Déconnectez le cathéter et utilisez la fiche de bouchon 23G pour fermer l’extrémité du cathéter. Débranchez le câble de l’EMG.
6. Ouvrir l’avant de la drisse et guider le rat de la drisse.
   NOTE : Manipuler avec soin les rat et surveiller les fils afin d’éviter tout blocage des câbles.
7. Rebrancher le cathéter sur la sellette. Re-branchez le EMG au harnais et mettre un morceau de ruban autour du bouchon.
   Remarque : Si l’animal a un état pathologique des voies urinaires inférieur, exprimer la vessie à l’extrémité manuellement pour éviter les overdistention de la vessie.
8. Replacer l’animal dans sa cage maison.
9. Fermer le programme en appuyant sur exit.
10. Nettoyer la drisse et le bécher.
11. Fermer les connecteurs de trois voies à la pompe et la sortie de l’animale.
12. Arrêtez l’ordinateur, l’appareil d’EMG et le système par l’intermédiaire de l’interrupteur principal.
    NOTE : Les données sont enregistrées dans le dossier distinct « Logged data » avec le fichier sous-dossier de l’ID de rat mesurée. Simples enregistrements sont triés dans les dossiers d’ID unique rat par date.

Résultats

Un schéma montrant le processus de mesures cystométriques éveillé est présenté dans la Figure 1 et l’anatomie interne pour l’implantation de cathéter de la vessie est illustré à la Figure 2. La chirurgie prend environ 2 h. analgésie postopératoire et antibiotiques, tel que décrit dans le protocole, couvrent la douleur et les infections pendant cinq jours après la chirurgie. Aucun signe de douleur ont été remarq...

Discussion

Ce protocole décrit la procédure chirurgicale d’un cathéter permanent et implantation d’électrodes sphincter urétral et le cystométriques technique d’enregistrement chez le rat éveillé, légèrement restreint dont les deux l’analyse simultanée de la vessie et sphincter urétral externe.

Étapes critiques pendant la chirurgie sont l’implantation minutieuse de la sonde vésicale, en évitant la fuite et une vaste manipulation. En outre, une implantation précise des électrode...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing PE 50	Becton Dickinson	427411	Catheter
Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c)	Ethicon	EH7403H	Suture
Teflon coated steel wire	Cooner wire	AS631	Electrode material
Silver wire 0.250 mm	World Precision Instruments	AGW1030	Electrode material
Rotilabo - PVC tube	Carl Roth	97241	Harness
Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c)	Ethicon	V4940H	Suture
Quick Connect Single Harness	SAI Infusion Technologies	QCH-23CW	Harness
Shrinking tubes	ChiliTec	17894	Electrode soldering
Soldering wire Pb60 Sn40	Stannol	LD0029	Electrode soldering
Fluxing agent 157	Castolin Eutectin	157 0150	Electrode soldering
Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	801-87-050-10-001101	Electrode soldering
Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box	Preci-dip	890-18-003-10-001101	Electrode soldering
Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis)	Catamount Research and Development Inc.	CAT-CYT-R
Differential amplifier with active headstage	AD instruments	DP-311	EMG amplifier
Restrainer Medium size for rats 200-300 g	emka Technologies	HLD-RM
Uro Dyn Software	Zürich of University		MTA-based
Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age	Charles River, Sulzfeld, Germany		animals