Trans-timpánica fármaco para el tratamiento de la ototoxicidad

Resumen

Presentamos una técnica de administración localizada de fármacos a través de la ruta trans-timpánica en la cóclea. Administración de fármacos por esta vía no interferiría con la eficacia de la lucha contra el cáncer de los medicamentos quimioterapéuticos como el cisplatino.

Resumen

La administración sistémica de agentes protectores para el tratamiento de ototoxicidad inducida por drogas es limitada por la posibilidad de que estos agentes protectores podrían interferir con la eficacia quimioterapéutica de las drogas primarias. Esto es especialmente cierto para el medicamento cisplatino, cuyas acciones contra el cáncer son atenuadas por antioxidantes que ofrecen protección adecuada contra pérdida de oído. Otros agentes otoprotective actual o potencial podrían plantear un problema similar, si se administra sistémicamente. Altos niveles de estos agentes locales con limitados efectos secundarios sistémicos permitiría la aplicación de diversos biológicos o agentes protectores directamente a la cóclea. En este informe, se demuestra un método de trans-timpánica de la entrega de varias drogas o reactivos biológicos a la cóclea, que debe mejorar la investigación en ciencias básicas en la cóclea y proporcionan una forma sencilla de ordenar el uso de agentes otoprotective en las clínicas. Este informe detalla un método de entrega de drogas trans-timpánica y proporciona ejemplos de cómo esta técnica se ha utilizado con éxito en animales de experimentación para el tratamiento de la ototoxicidad del cisplatino.

Introducción

El sistema auditivo periférico es exquisitamente sensible a drogas como el cisplatino y aminoglucósidos antibióticos. Cisplatino es un agente quimioterapéutico ampliamente utilizado para el tratamiento de una variedad de tumores sólidos, tales como cabeza, ovárico y testicular y cáncer de cuello. Ototoxicidad experimentada con el uso de esta droga es dosis limitantes y bastante común, que afecta a 75-100% de los pacientes tratados¹. Otros fármacos como el carboplatino y el oxaliplatino, han surgido como alternativas a cisplatino^2,3,4,5, pero su utilidad es limitada a unos pocos tipos de cáncer.

Los primeros estudios han demostrado el papel fundamental de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en la mediación de la ototoxicidad por cisplatino y aminoglucósidos. Estudios posteriores demostraron que la isoforma NOX3 de la NADPH oxidasa es la principal fuente de ROS en la cóclea y se activa con cisplatino^6,7. La generación de compromisos ROS el antioxidante protegiendo la capacidad de las células, conduciendo a mayor peroxidación lipídica de las membranas celulares⁸. Además, cisplatino aumenta la producción de radicales hidroxilo que generan altamente tóxico aldehino 4-hydroxynonenal (4-HNE), iniciador de la célula muerte^9,10. Basado en estos resultados, se han examinado varios antioxidantes para el tratamiento de la ototoxicidad del cisplatino. Estos incluyen D-metionina, N-acetilcisteína (NAC), tiosulfato de sodio (STS) y amifostina. Sin embargo, una preocupación importante de la terapia antioxidante es que estos antioxidantes podrían reducir la eficacia de quimioterapia cisplatino cuando se administra sistémicamente¹¹ a través de la interacción de cisplatino con grupos tiol en las moléculas antioxidantes.

En vista de estos problemas con la terapia antioxidante, el objetivo de este estudio fue examinar la ruta trans-timpánica de brindar antioxidantes y otras drogas a la cóclea para reducir la pérdida de la audición. La ruta trans-timpánica de droga y corto interfiriendo (si) ARN, se describe a continuación, aparece particularmente prometedor.

Protocolo

Macho Wistar ratas fueron manejadas según el animal de institutos nacionales de salud utilice las directrices y un protocolo aprobado por el Southern Illinois Universidad Escuela de medicina laboratorio Animal cuidado y uso. Respuesta auditiva del médula oblonga (ABR) fue realizado en ratas mientras que bajo anestesia antes de la administración de drogas y 72 h después para comprobar el efecto de la entrega de drogas trans-timpánica.

1. respuesta auditivas del médula oblonga (ABR)

Nota: Mediciones de ABR se recopilaron utilizando el equipo de prueba auditiva y el software. ABR representa potenciales evocados o las ondas de alta frecuencia generadas por el octavo nervio craneal (onda I y II) y otras estructuras de tronco cerebral auditivo más alto incluyendo núcleo coclear anteroventral (onda III), la lemnisco lateral (onda IV) y la inferior colliculus (onda V). Estas ondas se diferencian dependiendo de la latencia. ABR las mediciones se realizaron como se describe anteriormente¹².

1. Anestesiar ratas con una mezcla de 90 mg/kg ketamina y 17 mg/kg xilacina por inyección intraperitoneal. Confirmar la profundidad del reflejo de anestesia a través del dedo del pie-pinch. Aplicar lubricante oftálmico (o unas gotas de aceite mineral) en ambos ojos para evitar que se seque los ojos y evitar ulceración durante la anestesia.
2. Colocar la rata en la posición prona en una almohadilla caliente (37 ° C) dentro de una cabina acústica controlada. Equipo de prueba de audiología se encuentra fuera y al lado de la cabina.
3. Inserte los electrodos de acero inoxidable en consecuencia: el electrodo de tierra en la parte posterior del flanco, el electrodo positivo entre los dos oídos directamente en la cima del cráneo y los electrodos negativos por debajo de la oreja de cada oído.
4. Aplicar estímulos acústicos utilizando transductores de alta frecuencia como una ráfaga de tono de 5 ms a 8, 16 y 32 kHz. Determinar las intensidades de estímulo como nivel decibelios de presión sonora (dB SPL). Esto comienza en 10 dB SPL y llega a 90 dB SPL con un tamaño de paso de 10 dB. Calibrar las intensidades de sonido para una salida máxima de 90 dB SPL con un impulso precisión sonómetro.
   Nota: El resultado da una indicación de la integridad del órgano de la audición periférica, la cóclea y las mencionadas estructuras auditivas. Las formas de onda se generan dentro del ms 15 de entrada del estímulo y la latencia de las ondas depende de tiempo de conducción, que a su vez está regulada por tres factores críticos: volumen del cerebro, la intensidad y la frecuencia del sonido. Potenciales evocados auditivos fueron registrados utilizando el software proporcionado por el fabricante.
5. Considerar la intensidad mínima que puede evocar dos formas de onda diferentes (II y III) de amplitud mV 0.5 como umbral prominente.
   Nota: Cambio de umbral representa la diferencia en el umbral medido después del tratamiento en comparación con el umbral obtenido antes del tratamiento.

2. Trans-timpánica inyecciones

1. Para administrar el fármaco trans-tympanically, colocar la rata en la posición de decúbito lateral izquierdo.
   1. Insertar espéculos desechables de 2,5 mm en el conducto auditivo externo.
   2. Con el uso de un endoscopio quirúrgico, coloque el espéculo para que la membrana del tímpano es visible.
   3. Usando un 29 X 1/2, jeringa de insulina de 0,5 mL, elaborar con 50 μl de la adenosina de isopropilo fenil [R] - N-(R-PIA) solución (1 μm), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) solución (3 μm) o siRNA (0,9 μg) para inyectar (5 unidades).
   4. Utilice los espéculos para dirigir la aguja en la región anterior inferior de la membrana timpánica.
   5. Hágale un agujero a través de la membrana con la aguja y administrar los medicamentos mencionados en 1.2.3. Permitir que la rata descanse en esta posición durante 15 minutos.
      Nota: 50 μl debe ser el volumen adecuado para caber detrás de la membrana timpánica. Ningún líquido debe estar en el canal auditivo después de la administración.
   6. Colocar la rata en el derecho decúbito lateral posición y repita los pasos 1.2.1 a través de 1.2.5 para la administración en la otra oreja.
2. Para las ratas recibiendo cisplatino intraperitoneal, colocar la rata en la posición supina sobre una almohadilla térmica a 37 ° C.
   1. 21 X 3/4 en mariposa aguja (tubería de longitud de 12"), elaboración de cisplatino (11 mg/kg, 1 mg/mL de solución en solución salina estéril de fosfato buffer [PBS]).
   2. Utilizando una bomba de jeringa, administrar cisplatino (1 mg/mL) mediante inyección intraperitoneal 30 min más.
      Nota: Para una rata de 250 g, el volumen sería 2,75 mL a una velocidad de aproximadamente 0,1 mL por minuto.
3. Seguir controlar la profundidad de la anestesia a lo largo de estos procedimientos. Una vez completada la administración de cisplatino, vuelva a colocar la rata en la jaula en la posición propensa, asegurándose de que no haya nada que obstruya su respiración.
4. Seguimiento de la rata hasta que se recuperó completamente.

3. cóclea disección y descalcificación

1. Después de la final ABR (después de 72 h), anestesiar la rata con una mezcla de 90 mg/kg ketamina y 17 mg/kg xilacina por inyección intraperitoneal. Confirmar la anestesia con un reflejo del pellizco del dedo del pie. Eutanasia a la rata mediante decapitación.
2. Disección del hueso temporal como se describió anteriormente¹³.
3. Coloque la cóclea en paraformaldehído al 4% en solución en un vial de centelleo de vidrio de 7 mL (cubriendo por completo la cóclea) de PBS 1 x. Refrigerar durante la noche a 4 ° C. Paraformaldehido de quitar y lavar con 1 x PBS a temperatura ambiente.
4. Quitar PBS y llenar completamente el tubo con una solución de 120 mM de EDTA (pH 7.3). Colocar en un agitador a temperatura ambiente y permiten la descalcificación durante 2 a 3 semanas, cambiando la solución de EDTA diariamente.

4. Cryosectioning

1. Tras la descalcificación, sumerja completamente la cóclea de las siguientes soluciones (7 mL) durante 24 h a 4 ° C: 10% de sacarosa, sacarosa al 20%, 1:1 mezcla de sacarosa al 20% y la temperatura de corte óptimo (OCT) incrustación compuesto.
2. Lugar fresco OCT compuesto para rellenar y cubrir completamente la cóclea en un 15 x 15 mm x 5 mm desechables molde de incrustación. Oriente la cóclea a su lado para que sea paralelo al fondo del molde de incrustación, descrito por Whitlon et al. ¹⁴
3. Inmediatamente Coloque el molde en hielo seco para solidificar el OCT y almacenar a-80 ° C durante la noche.
4. Sumerja el portaobjetos en 0.01% poli L lisina a temperatura ambiente durante 30 minutos quite las diapositivas, no enjuague y permita que seque durante la noche. Utilizar estas diapositivas para cryosections.
5. Quite la cóclea en OCT del congelador de-80 ° C y coloque en hielo seco. Usando una cuchilla de micrótomo sharp (L x W: 80 mm x 8 mm, espesor de 0.25 mm, ángulo de corte de 34 °), sección de los bloques de la OCT en 10 μm con un criostato a-30 ° C. Coloque dos secciones por diapositiva.
6. Refrigere diapositivas a 4 ° C una vez terminada.

5. inmunohistoquímica

1. Coloque los portaobjetos en un portaobjetos de vidrio plato en una parrilla de tinción. Llene el plato con 350 mL de 1 x PBS y lavar los portaobjetos durante 5 minutos tres veces a temperatura ambiente.
2. Quite las diapositivas del plato y seque el área que rodea el tejido usando un trapo seco, asegurándose de que no se seque el tejido.
   1. Usando una pluma líquida bloqueo, dibuje un círculo alrededor de la sección de tejido.
3. Bloquear el tejido por 1 h a temperatura ambiente, agregar 150 μL de solución de bloqueo que contiene suero 10% normal (burro), detergente no iónico 1% y 1% de BSA en PBS 1 x.
4. Toque el bloqueo exceso e incubar el tejido durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada con 150 μL de suero normal de 10% (burro), detergente no iónico 0.1% y anticuerpo primario (véase la nota de abajo) en PBS 1 x.
   Nota: Para los siguientes anticuerpos, se utilizaron las diluciones: figura 2 y 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1:300. Figura 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, 1: 100 y 1: 100 de TRPV1.
5. Coloque el portaobjetos en el portaobjetos de vidrio plato en una parrilla de tinción. Llene el plato con 350 mL de 1 x PBS y lave el portaobjetos durante 5 minutos tres veces a temperatura ambiente.
6. Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en una solución que contiene 0,01% de detergente no iónico y suero normal (burro) de 10% en PBS 1 x durante 2 a 3 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada en la oscuridad.
   Nota: Para los siguientes anticuerpos secundarios, se utilizaron las diluciones: figura 2 y 3, burro anti-conejo IgG de 1: 600. Figura 4, rodamina (TRITC) burro anti-conejo IgG de 1: 500 y 1: 500 de IgG de anti-cabra burro.
7. Coloque el portaobjetos en el portaobjetos de vidrio plato en una parrilla de tinción. Llene el plato con 350 mL de 1 x PBS y lave el portaobjetos durante 5 minutos tres veces a temperatura ambiente.
8. Aprovechar el exceso de líquido fuera de la diapositiva y secar el portaobjetos con un paño seco alrededor del tejido. Montaje de diapositivas agregando una gota del agente montaje con DAPI directamente sobre el tejido. Lentamente, colocar el cubreobjetos encima, asegurando que no hay burbujas se forman por debajo y deje que los portaobjetos curar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Almacenar diapositivas a 4 ° C.
9. Diapositivas de imagen usando microscopia confocal. Uso de láseres para la proyección de imagen como sigue: láser UV de 543 nm láser de rodamina TRITC, DAPI y 488 nm láser de burro anti-conejo IgG.

Resultados

Respuestas ABR medición en ratas a los tres días siguientes administración de cisplatino mostraron una elevación significativa en los umbrales. Elevación de los umbrales se redujo significativamente en ratas administradas con trans-timpánica [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosina₁ receptor agonista¹⁵, antes del cisplatino. La especificidad de la acción de R-PIA en la adenosina receptor₁ fue demo...

Discusión

La vía de administración trans-timpánica permite la entrega localizada de fármacos y otros agentes a la cóclea que de lo contrario podría producir efectos secundarios sistémicos significativos si se administra sistémicamente. Este método de administración permite el rápido acceso de drogas al sitio de acción a dosis significativamente mayores que se lograría a través de la vía sistémica. Resultados aquí presentados y publicados previamente demostraron que la administración trans-timpánica de adenosina ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120