TRANS-tympanique de médicaments pour le traitement de l’ototoxicité

Résumé

Nous présentons une technique pour l’administration déconcentrée de drogues par voie trans-tympanique dans la cochlée. Administration de médicaments par le biais de cette route ne serait pas interférer avec l’efficacité de la lutte contre le cancer des médicaments chimiothérapeutiques comme le cisplatine.

Résumé

L’administration systémique d’agents protecteurs pour traiter l’ototoxicité induite par le médicament est limitée par la possibilité que ces agents protecteurs susceptibles de gêner l’efficacité chimiothérapeutique de la drogue primaire. Cela est particulièrement vrai pour la cisplatine, dont l’action anticancéreuse est atténuées par des antioxydants qui assurent une protection adéquate contre la perte d’audition. Autres agents otoprotective actuels ou potentiels pourraient poser un problème similaire, s’il est administré de façon systémique. L’application des divers produits biologiques ou les agents de protection directement à la cochlée permettrait à des niveaux élevés de ces agents localement ayant limité les effets secondaires systémiques. Dans ce rapport, nous démontrons une méthode trans-tympanique de la livraison de divers médicaments ou réactifs biologiques à la cochlée, ce qui devrait améliorer la recherche scientifique fondamentale sur la cochlée et offrent un moyen simple de diriger l’utilisation d’agents otoprotective dans les cliniques. Ce rapport détaille un procédé de medicaments trans-tympanique et fournit des exemples de comment cette technique a été utilisée avec succès chez les animaux expérimentaux pour traiter l’ototoxicité de cisplatine.

Introduction

Le système auditif périphérique est extrêmement sensible aux médicaments comme les antibiotiques aminosides et cisplatine. Cisplatine est un agent chimiothérapeutique utilisé pour le traitement d’une variété de tumeurs solides, comme les ovaires, testicules et tête et cou cancers. Ototoxicité expérimentée avec l’utilisation de ce médicament est limitant la dose et assez fréquent, touchant 75-100 % des patients traités¹. D’autres drogues, telles que le carboplatine et d’oxaliplatine, ont émergé comme alternative au cisplatine^2,3,4,5, mais leur utilité est limitée à quelques cancers.

Les premières études ont montré le rôle essentiel des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la médiation de l’ototoxicité produite par cisplatine et aminoglycosides. Des études ultérieures ont montré que l’isoforme NOX3 de la NADPH oxydase est la principale source des ROS dans la cochlée et est activé par le cisplatine^6,7. La génération de compromis ROS l’antioxydant le pouvoir tampon des cellules, menant à a augmenté la peroxydation lipidique des membranes cellulaires,⁸. En outre, cisplatine augmente la production de radicaux hydroxyles qui génèrent l’aldéhyde hautement toxiques 4-hydroxynonenal (4-HNE), initiateur de cellule mort^9,10. Basé sur ces résultats, plusieurs antioxydants ont été examinés pour le traitement de l’ototoxicité de cisplatine. Il s’agit de N-acétyl-cystéine (NAC), thiosulfate de sodium (STS), amifostine et D-méthionine. Cependant, une préoccupation majeure de la thérapie antioxydante est que ces antioxydants pourraient réduire efficacité chimiothérapie cisplatine lorsqu’il est administré systématiquement¹¹ grâce à l’interaction du cisplatine avec des groupements thiol dans les molécules antioxydantes.

Compte tenu de ces problèmes avec la thérapie antioxydante, l’objectif de cette étude était d’examiner la route trans-tympanique de la prestation d’antioxydants et autres drogues à la cochlée pour réduire la perte d’audition. La route trans-tympanique des drogues et interférant court (si) RNA, décrit ci-dessous, semble particulièrement prometteuse.

Protocole

Wistar mâles rats ont été traités selon l’animal National Institutes of Health utiliser les lignes directrices et un protocole approuvé par le Comité à utiliser et de la Southern Illinois University School of médecine Laboratory Animal Care. Réponse auditif du tronc cérébral (PEATC) a été réalisée sur des rats, tandis que sous anesthésie avant l’administration de médicaments et 72 h après pour vérifier l’effet de l’administration de médicaments trans-tympanique.

1. réponse auditif du tronc cérébral (PEATC)

Remarque : Mesures d’ABR ont été recueillies à l’aide de l’équipement de test auditif et les logiciels. ABR représente potentiels évoqués ou des ondes de haute fréquence générées par le huitième nerf crânien (wave I et II) et autres structures auditifs du tronc cérébral supérieurs, y compris le noyau cochléaire antéroventral (wave III), lemnisque latéral (onde IV) et inférieure colliculus (onde V). Ces ondes sont différenciés selon le temps de latence. ABR mesures ont été réalisées comme décrit plus haut¹².

1. Anesthésier les rats avec un mélange de 90 mg/kg la kétamine et 17 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale. Confirmer la profondeur d’anesthésie par orteil-pinch réflexe. Appliquer les gouttes d’huile minérale (ou ophtalmiques lubrifiantes) pour les deux yeux pour que les yeux ne se dessèchent et éviter une ulcération pendant l’anesthésie.
2. Placez le rat en décubitus ventral sur un coussin chauffant (37 ° C) à l’intérieur d’une cabine acoustique contrôlée. Équipement de test audiologie est situé à l’extérieur, à proximité de la cabine.
3. Insérer des électrodes en acier inoxydable en conséquence : le flanc de l’électrode de terre à l’arrière, l’électrode positive entre les deux oreilles directement au sommet du crâne et les électrodes négatives sous le pavillon de chaque oreille.
4. Appliquer des stimuli acoustiques utilisant des transducteurs haute fréquence comme une rafale de ton ms 5 à 8, 16 et 32 kHz. Déterminer des intensités de stimulation comme niveau de pression acoustique de décibel (dB SPL). Cela commence à 10 dB SPL et atteint 90 dB SPL avec une taille d’étape 10-dB. Calibrer les intensités sonores à un débit maximal de 90 dB SPL à l’aide d’une impulsion précision sonomètre.
   Remarque : Le résultat donne une indication de l’intégrité de l’organe de l’audition périphérique, la cochlée et les structures auditives susmentionnés. Les ondes sont générées dans les 15 ms d’impulsion d’entrée et de la latence des ondes dépend des temps de conduction, qui à son tour, sont régi par trois facteurs essentiels : volume du cerveau, l’intensité et la fréquence du son. Potentiels évoqués auditifs ont été enregistrés à l’aide du logiciel fourni par le fabricant.
5. Considérer l’intensité minimale qui peut évoquer deux formes d’onde différentes (II et III) d’une amplitude 0,5 µV comme seuil en bonne place.
   Remarque : Déplacement de seuil correspond à la différence du seuil mesuré après que traitement contre le seuil obtenu avant le traitement.

2. Trans-tympanique Injections

1. Pour administrer le médicament trans-tympanically, placez le rat en position de décubitus latéral gauche.
   1. Insérer les spéculums jetables oreille 2,5 mm dans le conduit auditif.
   2. Avec l’utilisation d’une chirurgie étendue, positionnez le spéculum pour que la membrane tympanique est visible.
   3. À l’aide d’un 29 X ½, seringue de 0,5 mL de l’insuline, dresser 50 µL de l’adénosine d’isopropylique [R] - N - phényl (R-PIA) solution (1 µM), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) solution (3 µM) ou siRNA (0,9 µg) à injecter (5 unités).
   4. Utiliser le spéculum pour diriger l’aiguille dans la région antérieure et inférieure de la membrane tympanique.
   5. Piquez un trou à travers la membrane avec l’aiguille et administrer les médicaments mentionnés au point 1.2.3. Laissez le rat se reposer dans cette position pendant 15 min.
      Remarque : 50 µL devrait être le volume adéquat pour monter derrière la membrane tympanique. Aucun fluide ne devrait être dans le conduit auditif après l’administration.
   6. Placez le rat en décubitus latéral position et répéter les étapes 1.2.1 à 1.2.5, pour administration dans l’autre oreille à droite.
2. Pour les rats recevant le cisplatine par voie intrapéritonéale, placez le rat en décubitus dorsal sur un coussin chauffant à 37 ° C.
   1. À l’aide d’un 21 X 3/4 papillon aiguille (tuyau 12"), dresser cisplatine (11 mg/kg, 1 mg/mL d’une solution dans une solution saline tampon de phosphate stérile [PBS]).
   2. À l’aide d’un pousse-seringue, administrer le cisplatine (1 mg/mL) par injection intrapéritonéale pendant 30 min.
      Remarque : Pour un rat de 250 g, le volume serait 2,75 mL à un taux d’environ 0,1 mL / min.
3. Continuer à surveiller la profondeur de l’anesthésie tout au long de ces procédures. Une fois que l’administration de cisplatine est terminée, replacez le rat dans la cage en décubitus ventral, assurant qu’il n’y a rien pour gêner sa respiration.
4. Surveiller le rat jusqu'à ce que complètement guéri.

3. détartrage et Dissection de la cochlée

1. Après la final ABR (après 72 h), anesthésier le rat avec un mélange de 90 mg/kg la kétamine et 17 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale. Confirmer l’anesthésie avec un réflexe d’orteil-pincement. Euthanasier la rat par décapitation.
2. Disséquer sur l’OS temporal comme décrit plus haut¹³.
3. Placer cochlée dans 4 % de paraformaldéhyde à 1 x solution de PBS dans un flacon de verre de 7 mL à scintillation (recouvrant complètement la cochlée). Réfrigérer pendant une nuit à 4 ° C. Enlevez paraformaldéhyde et lavez avec une solution de 1 PBS x à température ambiante.
4. Retirez les PBS et remplir le tube avec une solution d’EDTA (pH 7,3) de 120 mM. Placer sur un agitateur à température ambiante et laisser décalcification pendant 2 à 3 semaines, en changeant la solution d’EDTA par jour.

4. Cryosectioning

1. Après le détartrage, immergez complètement la cochlée dans les solutions suivantes (7 mL) pendant 24 h à 4 ° c : 10 % de sucrose, 20 % de sucrose, mélange 1:1 de 20 % de sucrose et de coupe optimale de température (OCT) incorporation composé.
2. Placez OCT frais composé de remplir et de couvrir complètement la cochlée dans un 15 mm x 15 mm x 5 mm jetable enrobage moule. Orienter la cochlée sur son côté il est parallèle au fond du moule encastrement, tel que décrit par Whitlon et al. ¹⁴
3. Placer immédiatement le moule sur la glace sèche pour solidifier l’OPO et stocker à-80 ° C durant la nuit.
4. Plonger les lames de microscope à 0,01 % Poly-L Lysine à température ambiante pendant 30 min. Retirer les lames, ne pas rincer et laisser sécher pendant la nuit. Utiliser ces lames pour coupes cryogéniques.
5. Retirez la cochlée en OCT du congélateur-80 ° C et placez-le sur la glace sèche. Utiliser une lame à tranchant microtome (L x w : 80 mm x 8 mm, épaisseur 0,25 mm, angle de coupe de 34 °), la section des blocs de OCT à 10 µm à l’aide d’un cryostat à-30 ° C. Placez les deux parties par diapositive.
6. Réfrigérer les lames à 4 ° C lorsque vous avez terminé.

5. immunohistochimie

1. Déposer les lames dans une lame de microscope de verre plat sur une grille coulissante de coloration. Remplir le plat avec 350 mL de solution 1 PBS x et laver les lames pendant 5 min trois fois à la température ambiante.
2. Supprimer les diapositives de la capsule et sécher la zone qui entoure le tissu à l’aide d’un chiffon sec, en veillant à ne pas sécher les tissus.
   1. À l’aide d’un stylo liquid de blocage, tracez un cercle autour de la section de tissu.
3. Bloquer le tissu pendant 1 h à température ambiante en ajoutant 150 µL de solution de saturation contenant du sérum normal de 10 % (âne), détergent non-ionique 1 % et 1 % de BSA dans du PBS 1 x.
4. Touchez au large de la solution de saturation excessive et incuber le tissu pendant la nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée avec 150 µL de sérum normal de 10 % (âne), 0,1 % de détergent non ionique et anticorps primaire (voir la remarque ci-dessous) dans du PBS 1 x.
   Remarque : Pour les anticorps suivants, ces dilutions ont été utilisées : Figure 2 et 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1 : 300. Figure 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, au 1/100 et 1/100 de TRPV1.
5. Déposer les lames dans la lame de microscope de verre plat sur une grille coulissante de coloration. Remplir le plat avec 350 mL de solution 1 PBS x et les lames pendant 5 min trois fois à la température ambiante.
6. Incubation avec l’anticorps secondaires dilués dans une solution contenant un détergent non-ionique 0,01 % et sérum normal de 10 % (âne) dans du PBS 1 x pendant 2 à 3 h à température ambiante dans une chambre humidifiée dans l’obscurité.
   Remarque : Pour les anticorps secondaires suivantes, ces dilutions ont été utilisées : Figure 2 et 3, 1:600 âne anti-lapin IgG. Pour la Figure 4, Rhodamine (TRITC) âne anti-lapin IgG 1/500 et Donkey anti-Goat IgG 1/500.
7. Déposer les lames dans la lame de microscope de verre plat sur une grille coulissante de coloration. Remplir le plat avec 350 mL de solution 1 PBS x et les lames pendant 5 min trois fois à la température ambiante.
8. Pressez l’excès de liquide hors de la diapositive et sécher la lame avec un chiffon sec autour du tissu. Monter les diapositives en ajoutant une goutte de l’agent de montage au DAPI directement sur le tissu. Lentement, placez le couvre-objet sur le dessus, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forment au-dessous et laisser les lames guérir du jour au lendemain à la température ambiante dans l’obscurité. Stocker les lames à 4 ° C.
9. Diapositives d’image à l’aide de la microscopie confocale. Utilisent des lasers pour l’imagerie comme suit : laser UV pour DAPI, laser 488 nm âne des IgG anti-lapin et 543 nm laser pour la rhodamine TRITC.

Résultats

ABR réactions mesurées chez des rats à trois jours après administration de cisplatine a montré une nette élévation des seuils. Élévation de ces seuils a été significativement réduite chez les rats, administrés en association avec trans-tympanique [R] - N - phénylisopropyladénosine (R-PIA), l’adénosine A₁ récepteur agoniste¹⁵, avant le cisplatine. La spécificité de l’action de R-PIA à l’adénosine, un r...

Discussion

La route trans-tympanique administration autorise une livraison localisée de médicaments et d’autres agents à la cochlée qui pourrait produire autrement des effets secondaires systémiques importants s’il est administré de façon systémique. Cette méthode d’administration des médicaments permet un accès rapide des médicaments sur le site d’action à des doses nettement plus élevés que se ferait par voie systémique. Les résultats présentés ici et publiés a déjà montrent que l’administration de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120