Trans-Tympanic ilaç dağıtım ototoksisite tedavisi için

Özet

Biz bir teknik trans-tympanic rota üzerinden uyuşturucu yerelleştirilmiş yönetim koklea içine için mevcut. Bu rota üzerinden ilaç dağıtım gibi sisplatin kemoterapi ilaçların anti-kanser etkinliği ile müdahale olmaz.

Özet

Sistemik yönetim ototoksisite ilaçla tedavi etmek için koruyucu ajanlar bu koruyucu ajanlar ile birincil ilaçların etkinliğini kemoterapötik engelleyebilir imkanı ile sınırlıdır. Bu, özellikle antikanser eylemlerini işitme kaybına karşı yeterli koruma sağlamak Antioksidanlar tarafından zayıflatılmış uyuşturucu sisplatin için geçerlidir. Diğer mevcut ya da potansiyel otoprotective temsilcileri benzer bir sorun, sistemik yönetilen doğuracak. Koklea doğrudan çeşitli biyolojik madde veya koruyucu uygulamayı yerel olarak sınırlı sistemik yan etkileri ile bu ajanların yüksek düzeyleri için izin vermez. Bu raporda, çeşitli uyuşturucu veya biyolojik reaktifler teslimat için temel bilim araştırma koklea geliştirmek ve otoprotective ajanlar kliniklerde kullanımını yönlendiren basit bir yol sağlar koklea, trans-tympanic bir yöntemi göstermektedir. Bu rapor trans-tympanic ilaç dağıtım yöntemi ayrıntıları ve nasıl bu tekniği başarıyla deneysel hayvanlarda sisplatin ototoksisite tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır kullanım örnekleri sağlar.

Giriş

Periferik işitme sisteminin zarif sisplatin ve aminoglikosite antibiyotik gibi ilaçlar duyarlıdır. Sisplatin solid tümör, yumurtalık, testis ve baş gibi çeşitli tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoterapötik ajan olduğunu ve boyun kanserleri. Bu ilaç kullanımı ile deneyimli ototoksisite doz-sınırlayıcı olduğunu ve oldukça yaygın, hastaların % 75-100 etkileyen¹ele. Carboplatin ve oxaliplatin'i, gibi diğer ilaçlar sisplatin^2,3,4,5alternatif olarak ortaya çıkmıştır, ama bazı kanserler için onların yararlılığı sınırlıdır.

Erken çalışmalar Reaktif oksijen türleri (ROS) kritik rolü sisplatin ve aminoglikozitler tarafından üretilen ototoksisite arabuluculuk göstermiştir. Sonraki çalışmalarda NADPH oksidaz NOX3 izoformu ROS birincil kaynak koklea içinde ve sisplatin^6,7tarafından aktif gösterdi. ROS tavizler nesil hücreler lider, kapasiteli tampon antioksidan lipid peroksidasyon hücresel zarları⁸arttı. Ayrıca, sisplatin yüksek derecede toksik aldehid 4-hydroxynonenal (4-HNE), hücre ölüm^9,10başlatıcı oluşturmak hidroksil radikalleri üretimi artar. Bu bulgulara dayanarak, birkaç antioksidanlar sisplatin ototoksisite tedavisi için inceledik. Bu N-asetil sistein (NAC), sodyum thiosulfate (STS), amifostine ve D-metionin içerir. Ancak, antioksidan tedavinin asıl ilgilendiği temel konu bu antioksidanlar sistemik¹¹ sisplatin thiol gruplar halinde antioksidan molekülleri ile etkileşimi aracılığıyla yönetilen zaman sisplatin kemoterapi etkinliğini azaltabilir olduğunu.

Antioksidan tedavisi ile bu sorunların içinde görüş-in bu çalışmanın hedefi, antioksidanlar ve diğer uyuşturucular işitme kaybı azaltmak için koklea teslim etme trans-tympanic rota incelemek için oldu. Uyuşturucu ve kısa (SI) RNA, aşağıda açıklanan engel trans-tympanic güzergahı özellikle umut verici görünüyor.

Protokol

Erkek Wistar fareler Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan uygun olarak ele kullanma yönergeleri ve Southern Illinois Üniversitesi okul tıp laboratuvar hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi tarafından onaylanmış bir iletişim kuralı. İşitsel beyin sapı davranım Odyometrisi (ABR), trans-tympanic ilaç dağıtım etkisini doğrulamak için önce ilaç idaresi ve 72 h sonra anestezi altında fareler üzerinde gerçekleştirildi.

1. işitsel beyin sapı davranım Odyometrisi (ABR)

Not: ABR ölçümleri işitsel test cihazları ve yazılım kullanılarak toplanmıştır. ABR uyarılmış potansiyeller veya yüksek frekanslı dalgalar sekizinci kranial sinir tarafından oluşturulan temsil eder (dalga ı ve II) ve anteroventral koklear çekirdeği (dalga III), lateral lemniscus (dalga IV) ve inferior gibi daha yüksek diğer işitsel beyin sapı yapıları olacaklar (dalga V). Bu dalgalar gecikme süresi bağlı olarak farklı. ABR ölçümleri¹²daha önce açıklandığı gibi yapıldı.

1. Fareler 90 mg/kg ketamin ve 17 mg/kg xylazine üzerinden mayi enjeksiyon karışımı ile anestezi. Anestezi ile ayak-çimdik refleks derinliği onaylayın. Oftalmik yağlama (veya madeni yağ damla) gözlerinin kurumasını önlemek ve ülserasyon anestezi sırasında önlemek için her iki gözde uygulanır.
2. Yüzükoyun kontrollü bir akustik kabin içinde bir Isıtma yastık (37 ° C) üzerinde fareyi yerleştirin. Odyoloji test etme donanımları dışında ve kabine yanında yer alır.
3. Paslanmaz çelik elektrotlar buna göre ekle: zemin elektrot arka kanat, doğrudan kafatası tepesine iki kulak ve her kulak pinna aşağıda negatif elektrotlar arasında pozitif elektrot.
4. Akustik uyaranlara 5 ms sesi patlama 8, 16 ve 32 kHz olarak yüksek frekans dönüştürücü kullanarak uygulayın. Uyarıcı yoğunluklarda desibel ses basınç seviyesi (dB SPL) belirleyin. Bu 10 dB SPL başlar ve 90 dB SPL bir 10-dB adım boyu ile ulaşır. Bir dürtü hassas ses seviyesi ölçer kullanarak 90 dB SPL maksimum çıkış ses yoğunluklarda kalibre.
   Not: Test sonucu periferik işitme organı, koklea ve söz konusu işitsel yapıları bütünlüğünü bir göstergesi verir. Dalga biçimleri uyarıcı giriş 15 ms içinde oluşturulur ve sırayla üç kritik faktörler tarafından düzenlenir ve tel zaman dalgalar gecikme süresi bağlıdır: beyin, yoğunluğu ve frekans ses hacmi. İşitsel uyarılmış potansiyeller yazılım üreticisi tarafından sağlanan kullanarak kaydedildi.
5. İki farklı dalga biçimleri (II ve III) 0.5 µV genlik, eşik olarak belirgin uyandırmak en düşük yoğunluk göz önünde bulundurun.
   Not: Eşik üst karakter sonra tedavi tedavi öncesi elde edilen eşik ile karşılaştırıldığında ölçülen eşik farkı temsil eder.

2. Trans-Tympanic enjeksiyon

1. Trans-tympanically ilacı vermek için fareyi sol yanal dekübitus pozisyonda yerleştirin.
   1. 2.5 mm tek kullanımlık kulak ayna kulak kanalı içine yerleştirin.
   2. Böylece kulak zarı görülebilir bir cerrahi kapsam kullanımı ile Ayna getirin.
   3. 29 G X ½, 0.5 mL insülin şırınga, kullanarak çizdiğiniz [R] - N - fenil izopropil adenozin 50 µL kadar (R-PIA) çözüm (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) çözüm (3 µM) veya (5 adet) enjekte siRNA çözüm (0.9 µg).
   4. Kulak zarı ön alt bölgeye iğne yönlendirmek için ayna kullanın.
   5. İğne ile membran delik poke ve 1.2.3 içinde belirtilen uyuşturucu yönetmek. Fareyi 15 dakika bu pozisyonda dinlenmek izin verir.
      Not: 50 µL kulak zarı sığdırmak için yeterli güç olması gerekir. Hiçbir sıvı içinde belgili tanımlık kulak kanal yönetim sonra olmalıdır.
   6. Fareyi sağ yanal dekübitus getirin ve diğer kulakta Yönetim için adımları 1.2.1 1.2.5 aracılığıyla yineleyin yerleştirin.
2. Sisplatin intraperitoneally alma sıçanlara sırtüstü pozisyonda 37 ° C'de bir Isıtma yastık üzerinde fareyi yer
   1. 21 G X 3/4 kullanarak iğne (12" uzunluğu boru) cevap ver, sisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL steril fosfat tampon serum [PBS] çözümde) çekmek.
   2. Bir şırınga pompa kullanarak, sisplatin (1 mg/mL) ile mayi enjeksiyon 30 dk yönetmek.
      Not: 250 g sıçan için birimin 2.75 mL yaklaşık 0.1 mL min başına oranında olacaktır.
3. Bu yordamları boyunca anestezi derinliği izlemeye devam edin. Sisplatin yönetim tamamlandıktan sonra fare geri onun nefes engel bir şey olmadığına emin yapma yüzükoyun, kafeste yerleştirin.
4. Tamamen iyileşti kadar fare izleyin.

3. koklea diseksiyon ve kalsiyumun

1. (Sonra 72 h) son ABR fareyi 90 mg/kg ketamin ve 17 mg/kg xylazine üzerinden mayi enjeksiyon karışımı ile anestezi. Anestezi ayak-çimdik refleks ile onaylayın. İşten çıkarma yolu ile sıçan ötenazi.
2. Temporal¹³daha önce açıklandığı gibi kemik incelemek.
3. Koklea (koklea tamamen kaplayan) 7-mL cam mercek şişe çözümde PBS x 1 %4 paraformaldehyde yerleştirin. Gecede 4 ° C'de soğutmak Paraformaldehyde kaldırmak ve oda sıcaklığında 1 x PBS ile yıkayın.
4. PBS çıkartın ve tüp tamamen EDTA (pH 7.3) 120-mM çözüm ile doldurun. Oda sıcaklığında bir rotator yerleştirin ve 2-3 hafta, EDTA çözüm her gün değişen incelemelerine izin.

4. Cryosectioning

1. Kalsiyumun tamamlandığında, aşağıdaki çözümleri (7 mL her) koklea 24 h 4 ° c % 10 Sükroz, % 20 Sükroz, % 20 sukroz ve bileşik katıştırma en uygun kesme sıcaklık (OCT) 1:1 karışımı için tamamen bırakın.
2. Taze OCT bileşik doldurup tamamen koklea içinde bir 15 x 15 mm x 5 mm kalıp katıştırma tek kullanımlık kapak koyun. Koklea kendi tarafında Whitlon ve arktarafından açıklandığı gibi gömme kalıp alt paralel gelecek şekilde yönlendirin. ¹⁴
3. Hemen kalıp OKT kuvvetlendirmek ve-80 ° C'de gecede depolamak için Kuru Buza koyun.
4. Mikroskop slaytları % 0,01 bırakın Poly-L lizin, oda sıcaklığında 30 dk. Kaldır slaytları, değil durulayın ve kuru gecede için izin. Bu slayt için cryosections kullanın.
5. Koklea Ekim-80 ° C dondurucudan çıkarın ve kuru buza yerleştirin. Bir keskin microtome bıçak (L x W: 80 mm x 8 mm, kalınlık 0.25 mm, kesme açısı 34 °), kullanarak bölüm 10 µm-30 ° C'de bir cryostat kullanarak, OCT blokları Slayt başına iki bölüme yerleştirin.
6. Ne zaman tamamlanmak 4 ° C'de slaytlar buzdolabında bekletin.

5. immünhistokimya

1. Slaytları bir slayt raf tabak boyama cam mikroskop kaymak yerleştirin. Çanak 350 mL 1 x PBS ile doldurulması ve 5 min için slaytlar üç kez oda sıcaklığında yıkayın.
2. Slaytlar çanağı kaldırmak ve doku kuru değil emin olmak bir Kuru Temizleme işlemi kullanarak doku çevresi kapalı kuru.
   1. Sıvı engelleme kalemi, doku bölümü bir daire çizin.
3. Oda sıcaklığında 1 h için doku 150 µL % 10 normal (eşek) serum, % 1 Noniyonik deterjan ve 1 x PBS % 1 BSA içeren engelleme çözümün ekleyerek engellemek.
4. Dokunun fazla engelleme çözüm ve doku gecede 4 ° C'de % 10 normal (eşek) serum, % 0,1 Noniyonik deterjan ve birincil antikor (aşağıdaki nota bakın) 150 µL ile oksijen odasında kuluçkaya 1 x PBS içinde.
   Not: Aşağıdaki antikorlar için bu dilutions kullanıldı: Şekil 2 ve 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1:300. Şekil 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, 1: 100 ve TRPV1 1: 100.
5. Slaytları bir slayt raf tabak boyama cam mikroskop kaymak yerleştirin. Çanak 350 mL 1 x PBS ile doldurulması ve slaytlar 5 min için üç kez oda sıcaklığında yıkayın.
6. % 0,01 Noniyonik deterjan ve 1 x PBS oksijen odası karanlık oda sıcaklığında 2-3 h için % 10 normal (eşek) serum içeren bir çözüm içinde seyreltilmiş ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
   Not: Aşağıdaki ikincil antikorlar için bu dilutions kullanıldı: Şekil 2 ve 3, Anti-tavşan eşek IgG 1:600. Şekil 4için 1:500 rodamine (TRITC) eşek Anti-tavşan IgG ve eşek Anti-keçi IgG 1:500.
7. Slaytları bir slayt raf tabak boyama cam mikroskop kaymak yerleştirin. Çanak 350 mL 1 x PBS ile doldurulması ve slaytlar 5 min için üç kez oda sıcaklığında yıkayın.
8. Aşırı sıvı slaydın dışına dokunun ve slayt etrafında doku kuru bir bezle kurulayın. Slaytlar DAPI montaj aracıyla doğrudan doku üzerine bir damla ekleyerek bağlayın. Yavaş yavaş üzerine hava kabarcığı yok altında kurulan sağlanması, coverslip yerleştirin ve slaytlar gecede karanlık oda sıcaklığında tedavi sağlar. Slaytları 4 ° C'de depolama
9. Görüntü confocal mikroskobu kullanarak slaytlar. Aşağıdaki gibi görüntüleme için lazer kullanır: UV lazer DAPI, 488 nm lazer için anti-tavşan eşek IgG ve 543 nm lazer rodamine TRITC için.

Sonuçlar

ABR yanıt-e doğru üç gün aşağıdaki sisplatin yönetim önemli bir ayrıcalık eşikleri gösterdi de, fareler ölçülür. Bu eşikleri yükselmesine önemli ölçüde azaltılmış trans-tympanic [R] - N - phenylisopropyladenosine ile yönetilen Sıçanlarda (R-PIA), adenozin bir₁ reseptör agonist¹⁵, sisplatin önce. Reylem özgüllük-₁ reseptör gösterdi bu 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine tarafından ...

Tartışmalar

Aksi takdirde önemli sistemik yan sistemik yönetilen etkiler üretmek olabilir koklea yerelleştirilmiş teslim edilmesi, uyuşturucu ve diğer aracıları için trans-tympanic yönetim yolu sağlar. Bu yöntemi ilaç idaresi, sistemik yönlendirme yolu elde daha anlamlı olarak daha yüksek dozda uyuşturucu eylem siteye hızlı erişim sağlar. Burada sunulan ve yayınlanan sonuçları daha önce gösterdi [R] - N - fenil izopropil adenozin, trans-tympanic o Yönetimi (R-PIA) koklea sisplatin kaynak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120