Trans-Trommelfells Drug-Delivery für die Behandlung von Ototoxizität

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine Technik für lokalisierte Verabreichung von Medikamenten durch die Trans-Trommelfells Route in die Cochlea. Drug-Delivery über diesen Weg würden die Anti-Krebs-Wirksamkeit von Chemotherapeutika wie Cisplatin nicht beeinträchtigen.

Zusammenfassung

Der systemischen Verabreichung der Schutzmittel, Medikamenten-induzierten Ototoxizität zu behandeln ist begrenzt durch die Möglichkeit, dass diese Schutzmittel mit der chemotherapeutischen Wirksamkeit der primären Medikamente stören könnten. Dies gilt insbesondere für das Medikament Cisplatin, deren Anti-Krebs-Aktionen durch Antioxidantien gedämpft, die ausreichenden Schutz vor Verlust der Hörfähigkeit zu bieten. Andere aktuelle oder potenzielle Otoprotective Agenten könnte ein ähnliches Problem aufwerfen, wenn systemisch verabreicht. Die Anwendung verschiedener Biologicals oder Schutzstoffe direkt an die Cochlea würde hohe dieser Wirkstoffe lokal mit begrenzten systemischen Nebenwirkungen ermöglichen. In diesem Bericht zeigen wir eine Trans-Trommelfells Methode der Lieferung von verschiedenen Drogen oder biologische Reagenzien der Cochlea, sollten grundlegende Wissenschaftsforschung auf der Cochlea und bieten eine einfache Möglichkeit, die Verwendung von Otoprotective Agenten in den Kliniken zu leiten. Dieser Bericht beschreibt eine Methode des Trans-Trommelfells Drug-Delivery und bietet Beispiele dafür, wie diese Technik erfolgreich bei Versuchstieren eingesetzt hat, um Cisplatin Ototoxizität zu behandeln.

Einleitung

Die peripheren Hörsystems ist exquisit empfindlich auf Medikamente wie Cisplatin und Aminoglykosid-Antibiotika. Cisplatin ist ein weit verbreitetes Chemotherapeutikum zur Behandlung von einer Vielzahl von soliden Tumoren, wie Eierstöcke, Hoden und Kopf und Hals-Tumoren. Ototoxizität erlebt mit der Verwendung dieser Droge ist Dosis-Begrenzung und durchaus üblich, 75-100 % der Patienten betroffen¹behandelt. Andere Drogen, wie z. B. Carboplatin und Oxaliplatin, entstanden als Alternativen zu Cisplatin^2,3,4,5, aber ihre Nützlichkeit ist auf wenige Krebsarten beschränkt.

Frühe Studien haben die kritische Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gezeigt, bei der Vermittlung der Ototoxizität von Cisplatin und Aminoglykoside produziert. Nachfolgende Studien zeigten, dass die NOX3 Isoform von NADPH-Oxidase die primäre Quelle von ROS in der Cochlea ist und durch Cisplatin^6,7aktiviert. Die Generation der ROS Kompromisse stieg das Antioxidans Pufferkapazität der Zellen, was zu Lipidperoxidation von Zellmembranen⁸. Cisplatin erhöht darüber hinaus die Produktion von Hydroxyl-radikale die hochgiftigen Aldehyd 4-Hydroxynonenal (4-HNE), Initiator der Zelle Tod^9,10erzeugen. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wurden mehrere Antioxidantien für die Behandlung von Cisplatin Ototoxizität untersucht. Dazu gehören D-Methionin, N-Acetyl-Cystein (NAC), Natriumthiosulfat (STS) und Amifostine. Ein Hauptanliegen der antioxidative Therapie ist jedoch, dass diese Antioxidantien Cisplatin chemotherapeutischen Wirksamkeit bei¹¹ durch das Zusammenspiel von Cisplatin mit Thiol-Gruppen in den antioxidativen Molekülen systemisch verabreicht senken könnte.

Angesichts dieser Probleme mit antioxidative Therapie war das Ziel dieser Studie zu prüfen, die Trans-Trommelfell Weg der Bereitstellung von Antioxidantien und anderen Drogen zu der Cochlea, Verlust der Hörfähigkeit zu reduzieren. Der Trans-Trommelfell Weg von Drogen und kurze Einmischung (Si) RNA, wie unten beschrieben, scheint besonders Erfolg versprechend.

Protokoll

Männliche Wistar Ratten in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Tier behandelt wurden verwenden Richtlinien und ein Protokoll vom südlichen Illinois Universität Schule von Medizin Laboratory Animal Care and verwenden Committee genehmigt. Auditory Brainstem Response (ABR) wurde an Ratten während der Narkose vor der Medikamentengabe und 72 h nach durchgeführt, um zu überprüfen, die Wirkung von Trans-Trommelfells Drug-Delivery.

1. auditory Brainstem Response (ABR)

Hinweis: ABR-Messungen wurden mit dem auditiven Test-Equipment und Software gesammelt. ABR steht für evozierte Potentiale oder Hochfrequenz-Wellen erzeugt durch den achten Hirnnerven (wave I und II) und andere höhere auditive Hirnstamm Strukturen einschließlich Anteroventral cochlear Nucleus (Welle III), seitlicher Lemniscus (Welle IV) und minderwertig Colliculus (Welle V). Diese Wellen unterscheiden sich je nach der Latenz. ABR Messungen wurden bereits¹²beschrieben.

1. Ratten mit einer Mischung aus 90 mg/kg Ketamin und 17 mg/kg Xylazin über intraperitoneale Injektion zu betäuben. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose über Zeh-Prise Reflex. Wenden Sie ophthalmologische Schmierung (oder Mineralöl Tropfen an) auf beiden Augen, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern und zu vermeiden Geschwürbildung während der Narkose
2. Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf ein Heizkissen (37 ° C) innerhalb einer kontrollierten akustischen Stand. Audiologie Prüfeinrichtungen befindet sich außerhalb und neben dem Stand.
3. Edelstahl-Elektroden entsprechend einfügen: der Masseelektrode im hinteren Flanke, die positive Elektrode zwischen den beiden Ohren direkt oben auf dem Schädel und der negativen Elektroden unterhalb der Pinna jedes Ohr.
4. Gelten Sie akustische Reize mit Hochfrequenz-Wandler als ein 5 ms Ton Burst auf 8, 16 und 32 kHz. Stimulus Intensitäten als Dezibel Schalldruck (dB SPL) zu bestimmen. Dies beginnt bei 10 dB SPL und 90 dB SPL mit einer Schrittweite von 10 dB erreicht. Die soliden Intensitäten zu einer maximalen Leistung von 90 dB SPL mit einer Impuls Präzision-Schallpegelmesser zu kalibrieren.
   Hinweis: Das Testergebnis gibt Aufschluss über die Integrität der periphere Hörorgan, der Cochlea und die vorgenannten auditiven Strukturen. Die Wellenformen werden innerhalb von 15 ms Impuls Eingabe generiert und die Latenz der Wellen hängt Wärmeleitung Zeit, die wiederum von drei kritischen Faktoren geregelt ist: Volumen des Gehirns, die Intensität und die Frequenz des Tones. Akustische evozierte Potentialen verzeichneten mit vom Hersteller mitgelieferten Software.
5. Betrachten Sie die minimale Intensität, die zwei verschiedene Wellenformen (II und III) von 0,5 µV Amplitude prominent als Schwellenwert hervorrufen kann.
   Hinweis: Verschiebung der Schwelle entspricht der Differenz in der Schwelle nach Behandlung im Vergleich mit dem Schwellwert erhalten vor der Behandlung gemessen.

2. Trans-Trommelfells Injektionen

1. Um das Medikament Trans-tympanically zu verwalten, legen Sie die Ratte in der linken seitlichen Dekubitus-Position.
   1. Einweg-Ohrtrichter 2,5 mm in den Gehörgang einsetzen.
   2. Positionieren Sie mit dem Einsatz eines OP-Bereichs der Spekula so, dass das Trommelfell sichtbar ist.
   3. Mit einem 29 X ½, 0,5 mL Insulin Spritze, 50 µL [R] - N - Phenyl Isopropyl Adenosin aufzustellen (R-PIA) Lösung (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-Dipropylxanthine (DPCPX)-Lösung (3 µM) oder SiRNA-Lösung (0,9 µg), (5 Stück) zu injizieren.
   4. Verwenden der Spekula, die Nadel auf die minderwertige Frontzahnbereich das Trommelfell.
   5. Poke ein Loch durch die Membran mit der Nadel und verabreichen der Medikamente in 1.2.3 erwähnt. Lassen Sie die Ratte in dieser Position für 15 min ruhen.
      Hinweis: 50 µL sollte ausreichend Volumen hinter dem Trommelfell zu passen. Nach der Verabreichung sollte keine Flüssigkeit im Gehörgang sein.
   6. Legen Sie die Ratte in der rechten seitlichen Dekubitus positionieren und wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.5 für die Verwaltung in das andere Ohr.
2. Legen Sie für Ratten intraperitoneal Cisplatin empfangen die Ratte in der Rückenlage auf ein Heizkissen bei 37 ° C.
   1. Mit einer 21 X 3/4 Schmetterling Nadel (Länge Schlauch 12"), Cisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL Lösung in sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung [PBS]) aufzustellen.
   2. Über eine Spritzenpumpe, verwalten Sie Cisplatin (1 mg/mL) über intraperitoneale Injektion über 30 min.
      Hinweis: Für eine 250-g-Ratte würde das Volumen 2,75 mL mit einer Rate von etwa 0,1 mL / min. betragen.
3. Auch die Tiefe der Narkose während dieser Verfahren zu verfolgen. Wenn Cisplatin Verwaltung abgeschlossen ist, legen Sie die Ratte zurück in den Käfig in Bauchlage, sicherstellen, dass gibt es nichts, ihre Atmung behindern.
4. Überwachen Sie die Ratte bis vollständig erholt.

(3) Cochlea Dissection und Entkalkung

1. Im Anschluss an die letzte ABR (nach 72 h) die Ratte mit einer Mischung aus 90 mg/kg Ketamin und 17 mg/kg Xylazin über intraperitoneale Injektion zu betäuben. Anästhesie mit einem Zeh-Prise Reflex zu bestätigen. Die Ratte über Enthauptung einschläfern.
2. Sezieren Sie, Felsenbein bereits¹³beschrieben.
3. 4 % Paraformaldehyd in 1 x PBS-Lösung in einem 7-mL-Glas funkeln Fläschchen (vollständig bedeckt die Cochlea) entgegenbringen Sie Cochlea. Im Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C. Entfernen Sie Paraformaldehyd zu und waschen Sie mit 1 X PBS bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie PBS zu und füllen Sie das Rohr vollständig zu, mit einer 120-mM-Lösung von EDTA (pH 7,3). Legen Sie auf ein Rotator bei Raumtemperatur und ermöglichen Sie Entkalkung für 2 bis 3 Wochen, täglich wechselnden die EDTA-Lösung zu.

(4) Kryoschneiden

1. Nach dem Abschluss der Entkalkung komplett zu halten der Cochlea in den folgenden Lösungen (7 mL) für 24 h bei 4 ° C: 10 % Saccharose, 20 % Saccharose, 1:1 Mischung aus 20 % Saccharose und optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte einbetten.
2. Legen Sie frische OCT Verbindung zu füllen und vollständig bedecken die Cochlea in ein 15 x 15 mm x 5 mm Einweg Form einbetten. Richten Sie die Cochlea auf seiner Seite, so dass es parallel zum Boden der einbettenden Form, wie von Whitlon Et al.beschrieben. ¹⁴
3. Legen Sie die Form sofort auf Trockeneis, das Office-Anpassungstool zu festigen und über Nacht bei-80 ° C lagern.
4. Tauchen Objektträger in 0,01 % Poly-L-Lysin bei Raumtemperatur für 30 min. entfernen die Folien nicht ausspülen und über Nacht trocknen lassen. Verwenden Sie diese Folien für Cryosections.
5. Entfernen der Cochlea im Oktober aus dem-80 ° C Gefrierschrank und legen Sie es auf Trockeneis. Mit einem scharfen Mikrotom Klinge (L x b: 80 mm x 8 mm, Stärke 0,25 mm, Schnittwinkel von 34°), Abschnitt die OCT-Blöcke bei 10 µm mit einem Kryostaten bei-30 ° C. Legen Sie zwei Abschnitte pro Folie.
6. Kühlen Sie Folien bei 4 ° C, wenn Sie fertig sind.

5. Immunohistochemistry

1. Legen Sie die Folien in einen Glas-Objektträger Färbung Gericht auf einem Dia-Gestell. Füllen Sie die Schale mit 350 mL 1 X PBS und waschen Sie der Objektträger für 5 min bei Raumtemperatur dreimal.
2. Die Folien aus der Schale entfernen und das Gebiet rund um das Gewebe mit einem trockenen Tuch, wobei Sie nicht auf das Gewebe trocknen trocknen.
   1. Mit einem flüssigen blockierende Stift, zeichnen Sie einen Kreis um den Gewebe-Abschnitt.
3. Blockieren Sie das Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur durch Zugabe von 150 µL blocking Lösung mit 10 % Normal (Esel) Serum, 1 % nichtionische Reinigungsmittel und 1 % BSA mit 1 X PBS-Puffer.
4. Tippen Sie auf Ausschalten überschüssige blockierende Lösung und inkubieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 ° C in eine feuchte Kammer mit 150 µL Serum 10 % Normal (Esel), 0,1 % nichtionische Reinigungsmittel und primären Antikörper (siehe Hinweis unten) mit 1 X PBS-Puffer.
   Hinweis: Für die folgenden Antikörper wurden diese Verdünnungen verwendet: für Abbildung 2 und 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1: 300. Abbildung 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, 1: 100 und TRPV1 1: 100.
5. Legen Sie die Folien in Färbung Gericht auf eine Folie Rack Glas-Objektträger. Füllen Sie die Schale mit 350 mL 1 X PBS und waschen Sie Folien für 5 min bei Raumtemperatur dreimal.
6. Mit der Sekundärantikörper verdünnt in eine Lösung mit 0,01 % nichtionische Waschmittel und 10 % Normal (Esel) Serum mit 1 X PBS-Puffer für 2 bis 3 h bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer im Dunkeln inkubieren.
   Hinweis: Für die folgenden Sekundärantikörper wurden diese Verdünnungen verwendet: für Abbildung 2 und 3, Esel IgG Anti-Kaninchen-1:600. Abbildung 4Rhodamine (TRITC) Esel Anti-Kaninchen IgG 1: 500 und Esel Anti-Ziege IgG 1: 500.
7. Legen Sie die Folien in Färbung Gericht auf eine Folie Rack Glas-Objektträger. Füllen Sie die Schale mit 350 mL 1 X PBS und waschen Sie Folien für 5 min bei Raumtemperatur dreimal.
8. Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit aus der Folie, und trocknen Sie die Folie mit einem trockenen Tuch auf das Gewebe. Montieren Sie Folien durch Zugabe von einem Tropfen des Montage-Agents mit DAPI direkt auf das Gewebe. Langsam oben, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen, darunter entstehen legen Sie das Deckglas auf und lassen Sie die Folien über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln zu heilen. Speichern von Folien bei 4 ° C.
9. Bildfolien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Laser Imaging-wie folgt zu verwenden: UV-Laser für DAPI, 488 nm Laser für Esel IgG Anti-Kaninchen und 543 nm Laser für Rhodamin TRITC.

Ergebnisse

ABR Reaktionen gemessen bei Ratten an drei Tagen nach Cisplatin-Verabreichung eine deutliche Erhöhung Schwellen zeigte. Höhe dieser Schwellen wurde deutlich reduziert, bei Ratten verabreicht mit Trans-Trommelfell [R] - N - Phenylisopropyladenosine (R-PIA), Adenosin₁ Rezeptor Agonist¹⁵, vor Cisplatin. Die Spezifität des Handelns der R-PIA an der Adenosin-Rezeptor₁ zeigte sich durch die Beobachtung, dass es durch 8-...

Diskussion

Die Trans-Trommelfells Applikationsweges ermöglicht eine lokalisierte Lieferung von Arzneimitteln und sonstigen Erfüllungsgehilfen der Cochlea, die andernfalls erheblichen systemische Nebenwirkungen wenn systemisch verabreicht produzieren könnte. Diese Methode der Gesundheitsbehörde ermöglicht schnellen Zugriff von Medikamenten, um den Ort des Geschehens bei deutlich höheren Dosen, als durch die systemische Route erreicht werden würde. Ergebnisse hier vorgestellt und veröffentlicht zuvor gezeigt, dass Trans-Tromm...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120