難聴の治療のためのトランス鼓膜ドラッグデリバリー

要約

蝸牛にトランス鼓膜のルートを通じて医薬品の集中管理のための手法を提案します。この経路によるドラッグデリバリー シスプラチン化学療法剤の抗腫瘍効果と干渉しません。

要約

薬剤性難聴を治療するために保護剤の全身投与は、これらの保護剤が主な薬の化学療法の有効性と干渉する可能性可能性によって制限されます。これはその抗癌アクションは聴力損失に対して十分な保護を提供する抗酸化物質によって減衰は薬シスプラチンの特に当てはまります。他の現在か潜在的な otoprotective のエージェントは、全身投与する場合、同様の問題を引き起こす恐れが。限られた全身の副作用とローカルでこれらのエージェントの高いレベルの蝸牛に直接さまざまな生物学的製剤または保護剤のアプリケーションになります。本報告では、我々 は、蝸牛蝸牛に関する基礎科学研究を進めようと診療所で otoprotective エージェントの使用を指示する簡単な方法を提供するさまざまな薬や生物学的試薬の配信のトランス鼓膜メソッドを示します。このレポートは、トランス鼓膜薬物送達法の詳細をどのようにこの技術が正常に実験動物の治療に使用されてシスプラチン難聴の例を示します。

概要

聴覚末梢系は、シスプラチン、アミノグリコシド系抗生物質などの薬に絶妙に敏感です。さまざまな固形腫瘍、卵巣、精巣、ヘッドなどの治療に広く使用されている抗癌剤は、シスプラチンと頸部の癌。この薬の使用を経験した難聴は線量制限と¹を扱う患者の 75-100% に影響を与える非常に一般的。カルボプラチン オキサリプラチンなどの他の薬をシスプラチン^2,3,4、5、選択肢として浮上しているが、その有用性は、いくつかの癌に限られています。

初期の研究では、シスプラチン、アミノグリコシド系抗生物質による難聴を媒介に活性酸素種 (ROS) の重要な役割を示しています。その後の研究を示し、NADPH オキシダーゼの NOX3 アイソ フォーム、蝸牛の ROS のプライマリ ソースであるシスプラチン^6,7をアクティブに。ROS 妥協の世代抗酸化につながる細胞の緩衝能力は⁸細胞膜の脂質過酸化反応を増加しました。また、シスプラチンは非常に有毒アルデヒド 4-ヒドロキシノネナール (4 HNE)、細胞死^9,10のイニシエーターを生成するヒドロキシルラジカルの生産を増加します。これらの調査結果に基づいて、いくつかの抗酸化物質はシスプラチン難聴の治療のために検討されています。N - アセチルシステイン (NAC)、チオ硫酸ナトリウム (STS) や amifostine、D-メチオニンが含まれます。しかし、抗酸化療法の主要な心配はこれらの抗酸化物質がシスプラチンの抗酸化剤分子のチオール基との相互作用を通じて¹¹を全身投与した場合シスプラチン化学療法有効性を減らすことができます。

抗酸化療法とこれらの問題の観点から本研究の目的は聴力損失を減らすために蝸牛に酸化防止剤と他の薬を提供するトランス鼓膜のルートを検討しました。特に有望な薬物と短い干渉 (si)、RNA、後述のトランス鼓膜のルートが表示されます。

プロトコル

雄 Wistar ラットは、国立衛生研究所動物に従って処理されたガイドラインおよび南イリノイ大学学校の医学研究所動物ケアおよび使用委員会承認プロトコルを使用します。トランス鼓膜薬物送達の効果を検証する中薬管理および後 72 時間前に麻酔下でラットの聴性脳幹反応 (ABR) を行った

1. 聴性脳幹反応 (ABR)

注:ABR の測定は、聴覚テスト装置とソフトウェアを使用して収集されました。ABR 誘発電位または第 8 脳神経高周波波を表します (I および II を波) および他の高い聴性脳幹構造提案蝸牛神経核 (波 III)、横帯 (波 IV) 劣っているなど丘 (V 波)。これらの波は、レーテンシーによって区別されます。ABR の測定は¹²を前述のように行った。

1. 混合物 90 mg/kg 17 mg/kg とケタミン キシラジンを介して腹腔内投与のラットを麻酔します。つま先ピンチ反射を介して麻酔の深さを確認します。目の乾燥を防ぐ、麻酔中に潰瘍を避けるために両方の目に点眼潤滑 (または鉱物油滴) を適用されます。
2. 腹臥位制御音響ブース内部加熱パッド (37 ° C) でラットを配置します。聴覚検査機器は外、ブースの横にあります。
3. それに応じてステンレスの電極を挿入: リアの接地電極の側面、頭蓋骨の上に直接 2 つの耳とそれぞれの耳の耳介の下否定的な電極の間肯定的な電極。
4. 8、16、32 kHz で 5 ms トーン バーストとして高周波数探触子を用いた音響刺激を適用します。デシベル音圧レベル (dB SPL) として刺激強度を決定します。これは 10 dB SPL で始まり、10 dB ステップ サイズの 90 dB SPL に達する。インパルス精密サウンド レベル メーターを使用して 90 dB SPL の最大出力に音の強度を調整します。
   注:テスト結果は、末梢聴覚器官、蝸牛、および前述の聴覚の構造の整合性の指示を与えます。波形は入力された刺激の 15 ms 以内で生成され、波の遅延時間依存伝導時間を順番に 3 つの重要な要因によって規制されている: 脳と、強度と音の周波数のボリューム。聴覚誘発電位は、製造元によって提供されるソフトウェアを使用して記録しました。
5. 目立つようにしきい値として 0.5 μ V の振幅の 2 つの異なる波形 (II、III) を呼び起こすことができる最低の強度を検討します。
   注:しきい値シフトは、治療前に得られた閾値と比較して治療後の測定閾値の差を表します。

2. トランス鼓膜注射

1. トランス tympanically 薬を管理するには、左側臥位でラットを配置します。
   1. 2.5 mm 使い捨て耳アジマスを外耳道に挿入します。
   2. 手術範囲を使って、鼓膜が表示されるよう、鏡を位置します。
   3. 29 X *、0.5 mL インスリン注射器を使用して [R] - N - フェニル イソプロピル アデノシンの 50 μ L を描画 (R-PIA) ソリューション (1 μ M)、8-シクロペンチルホモログ-1, 3-dipropylxanthine (みた) ソリューション (3 μ M)、または siRNA ソリューション (0.9 μ g) (5 単位) を注入します。
   4. 鼓膜の下前歯に針を直接に、鏡を使用します。
   5. 針で細胞膜に穴を開けないし、1.2.3 に記載されている薬の管理します。15 分のこの位置に残りの部分にラットを許可します。
      注: 50 μ L は、鼓膜の後ろに合わせて十分な量をする必要があります。投与後、耳の三半規管の流体必要がないです。
   6. 右側臥位置し、手順 1.2.5 を通じて 1.2.1 他耳の管理のためにラットを配置します。
2. シスプラチンの腹腔内受信、ラットのラットを 37 ° C で加熱パッドの仰臥位にします。
   1. 21 X 3/4 を使用して蝶の針 (12"長さチューブ)、シスプラチン (11 mg/kg ・ 1 mg/mL 滅菌リン酸バッファー生理食塩水 [PBS] ソリューション) を描画します。
   2. シリンジ ポンプを使用して、シスプラチン (1 mg/mL)を介して腹腔内投与 30 分以上を管理します。
      注:250 g ラット ボリュームは 1 分あたり約 0.1 mL の割合で 2.75 mL になります。
3. これらの手順の中で麻酔の深さを監視し続けます。シスプラチン投与が完了すると、その呼吸を妨害することはないことを確かめて、腹臥位でケージに戻ってラットを配置します。
4. 完全に回復するまでのラットを監視します。

3. 蝸牛郭清と脱灰

1. 次の (72 h) 後最終的な ABR、混合物 90 mg/kg 17 mg/kg とケタミン キシラジンを介して腹腔内投与のラットを麻酔します。つま先ピンチ反射と麻酔を確認します。斬首を介してラットを安楽死させます。
2. ¹³を前述のように側頭骨を分析します。
3. (完全に覆う蝸牛) 7 mL ガラス シンチレーション バイアル PBS 溶液 × 1 で 4% パラホルムアルデヒドに蝸牛を配置します。4 ° C で一晩冷蔵庫で冷やしますパラホルムアルデヒドを削除し、室温で 1 x PBS で洗浄します。
4. PBS を取り外して、EDTA (pH 7.3) の 120 ミリメートルのソリューションで完全に管を埋めます。室温で回転子に置き、EDTA 溶液を毎日変更する 2 〜 3 週間の脱灰処理を許可します。

4. セクショニング

1. 脱灰処理の完了時に完全に 4 ° c: 10% ショ糖溶液、20% ショ糖 20% ショ糖と最適の切削温度 (OCT) 化合物の埋め込みの 1:1 混合物で 24 時間以下のソリューション (7 mL) に蝸牛を浸します。
2. 新鮮な 10 月場所を埋めるし、15 mm x 15 mm x 5 mm 使い捨て型の埋め込みの蝸牛を完全にカバーする化合物。Whitlonらによる記述で埋め込み型の下に平行になるので、その側に蝸牛を向けます。¹⁴
3. すぐに OCT を固めるし、一晩-80 ° C で保存にドライアイスの型を置きます。
4. 0.01% の顕微鏡スライドを浸し室温 30 分削除でポリ L リジンのスライド、すすぎ、していない一晩乾燥することができます。凍結切片のこれらのスライドを使用します。
5. -80 ° C のフリーザーから 10 月に蝸牛を削除し、ドライアイスの上に置きます。シャープのミクロトーム刃 (L x w: 80 mm × 8 mm、厚さ 0.25 mm、34 ° のカット角) を使用してセクション-30 ° C でクライオスタットを用いた 10 μ m で 10 月のブロックスライドごとの 2 つのセクションを配置します。
6. スライド 4 ° c が終わったら冷蔵庫で冷やします。

5. 免疫組織化学

1. スライド ラックの上に料理を染色ガラス顕微鏡スライドにスライドを配置します。350 mL の 1x PBS で皿を満たし、室温で 5 分間スライドを 3 回洗浄します。
2. お皿からスライドを削除し、周辺組織の組織オフに乾燥しないように確認して、乾燥のワイプを使用してオフに乾燥します。
   1. 液体ブロックのペンを使用して、組織切片周囲円を描画します。
3. ブロッキング溶液 10% 通常 (ロバ) 血清, 1% 非イオン性洗剤および 1x PBS で 1% BSA 150 μ L を追加することによって部屋の温度で 1 時間のための組織をブロックします。
4. ブロッキング液の過剰をオフにタップし、一晩で 4 ° C (ロバ) 10% 正常血清、0.1% 非イオン性洗剤、一次抗体 (下のメモを参照) の 150 μ L で加湿チャンバー組織をインキュベート 1x PBS で。
   注:次抗体これらの希釈液は使用された:図 2および3、p STAT1 Ser⁷²⁷ 1: 300 のため。図 4、p STAT1 Ser⁷²⁷、1: 100、1: 100 TRPV1 の
5. スライド ラックの上に料理を染色ガラス顕微鏡スライドにスライドを配置します。350 mL の 1x PBS で皿を満たし、室温で 5 分間スライドを 3 回洗浄します。
6. 0.01% 非イオン性洗剤と暗闇の中で加湿チャンバーに室温で 2 に 3 h の 1x PBS で 10% 正常 (ロバ) 血清を含む溶液で希釈した二次抗体とインキュベートします。
   注:次の二次抗体これらの希釈液は使用された: の図 2と3ロバ抗うさぎ IgG 1:600。図 4ローダミン (TRITC) ロバ抗うさぎ IgG 1: 500 とロバの反やぎ IgG 1: 500。
7. スライド ラックの上に料理を染色ガラス顕微鏡スライドにスライドを配置します。350 mL の 1x PBS で皿を満たし、室温で 5 分間スライドを 3 回洗浄します。
8. スライドの外の余分な液体をタップし、周囲の組織の乾燥のワイプを使用してスライドを乾燥します。組織に直接 DAPI で取り付けのエージェントの 1 つのドロップを追加することによって、スライドをマウントします。ゆっくり下に気泡を形成しないことを確保する上、coverslip の場所し、暗闇の中で室温で一晩治すためスライドを許可します。4 ° C でスライドを保存します。
9. 共焦点の顕微鏡を使用してスライドをイメージします。レーザーを使用して、次のように画像の: ロバ抗うさぎ IgG、488 nm レーザー DAPI ・ ローダミン TRITC 543 nm レーザー紫外線レーザー。

結果

ABR 反応閾値の有意な上昇を示した次のシスプラチン投与 3 日間ラットを用いて測定します。トランス鼓膜 [R] - N - phenylisopropyladenosine 投与ラットにおけるこれらのしきい値の上昇を有意に減少した (R-ぴあ)、アデノシン₁受容体アゴニスト¹⁵シスプラチンの前に。Rの作用の特異性-₁受容体は、それが 8-シクロペンチル...

ディスカッション

トランス鼓膜投与経路重要な全身性副作用全身投与する場合それ以外の場合になる蝸牛に薬や他のエージェントのローカライズされた配信できます。この投与法は、全身の経路を通じて達成されるとより有意に高い用量でアクションのサイトに薬の迅速なアクセスをできます。結果ここまで提示して公開以前ことを示したトランス鼓膜 [R] - N - フェニル イソプロピル アデノシン (R

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120