משלוח סמים טרנס-Tympanic לטיפול Ototoxicity

Summary

אנו מציגים טכניקה לניהול מקומי של תרופות דרך המסלול טרנס-tympanic לתוך שבלול. משלוח סמים דרך מסלול זה לא להפריע נגד סרטן היעילות של תרופות כימותרפיות כגון ציספלטין.

Abstract

המינהל מערכתית של סוכנים מגן לטיפול ototoxicity תחת השפעת סמים מוגבל על ידי האפשרות כי אלה סוכני המגן עלולה להפריע היעילות כימותרפיות של הסמים העיקרי. זה נכון במיוחד עבור ציספלטין סמים, הקלוש הם שפעולותיהם נגד סרטן על ידי נוגדי חמצון אשר מספקים הגנה נאותה מפני אובדן שמיעה. סוכנים otoprotective הנוכחי או פוטנציאליים אחרים יכול להוות בעיה דומה, אם מנוהל מערכתית. היישום של ביולוגים או מגן סוכנים שונים ישירות אל שבלול תאפשר לקבלת רמות גבוהות של סוכנים אלה באופן מקומי עם תופעות מערכתיות מוגבלת. בדו ח זה, נדגים שיטה טרנס-tympanic משלוח של סמים או ריאגנטים ביולוגיים שונים כדי שבלול, צריך לשפר את מדע בסיסי מחקר על שבלול ומספקות בצורה פשוטה לכוון את השימוש של סוכנים otoprotective המרפאות. דו ח זה מפרט את שיטת משלוח סמים טרנס-tympanic ומספק דוגמאות איך טכניקה זו שימש בהצלחה בחיות ניסיוני לטיפול ototoxicity ציספלטין.

Introduction

מערכת השמיעה היקפיים רגיש להפליא תרופות כמו אנטיביוטיקה ציספלטין ו- aminoglycoside. ציספלטין הוא סוכן כימותרפיות בשימוש נרחב לטיפול של מגוון רחב של גידולים מוצקים, כגון השחלות, האשכים, ראש צוואר סרטן. Ototoxicity מנוסה עם השימוש של תרופה זו במינון-מגבילה, די נפוץ, המשפיעים על 75-100% מהחולים שטופלו¹. סמים אחרים, כגון carboplatin oxaliplatin, הופיעו חלופות ציספלטין^2,3,4,5כמו, אבל התועלת שלהם היא מוגבלת מספר סוגי סרטן.

לימודי הראו את תפקיד קריטי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתיווכן של ototoxicity המיוצר על ידי ציספלטין ו- aminoglycosides. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי איזופורם NOX3 אוקסידאז nadph ל הוא המקור העיקרי של ROS ב שבלול, מופעל על-ידי ציספלטין^6,7. הדור של ROS פשרות נוגד חמצון אגירה קיבולת של תאים, המוביל גדל השומנים peroxidation של ממברנות הסלולר⁸. יתר על כן, ציספלטין מגביר הייצור של רדיקלים הידרוקסיל המניבות אלדהיד רעיל מאוד 4-hydroxynonenal (4-HNE), יזם של התא מות^9,10. על סמך ממצאים אלה, מספר חמצון נבדקו לטיפול של ציספלטין ototoxicity. אלה כוללים N-אצטיל-ציסטאין (NAC), נתרן תיוסולפט (STS), amifostine ו- D-מתיונין. עם זאת, הדאגה העיקרית של טיפול נוגד חמצון היא כי נוגדי חמצון אלה יכול להפחית את היעילות כימותרפיות ציספלטין כאשר ניתנת מערכתית¹¹ דרך האינטראקציה של ציספלטין עם קבוצות תיול מולקולות נוגדות חמצון.

על רקע בעיות אלה בטיפול נוגד חמצון, מטרתו של מחקר זה הייתה לבחון את תוואי חוצה-tympanic אספקת חומרים נוגדי חמצון וסמים אחרים שבלול כדי לצמצם את אובדן שמיעה. תוואי חוצה-tympanic סמים ומפריעים קצר (si) RNA, המתוארים להלן, נראה מבטיח במיוחד.

Protocol

Wistar זכר חולדות שטופלו על פי החיה מכוני הבריאות הלאומיים להשתמש הנחיות פרוטוקול אושרה על ידי מינהל דרום אילינוי אוניברסיטת בית הספר של רפואה מעבדה חיה טיפול הוועדה להשתמש. תגובת גזע המוח (ABR) בוצעה על חולדות בזמן תחת הרדמה לפני והתרופות האמריקני ו- 72 h לאחר כדי לאמת את ההשפעה של משלוח סמים טרנס-tympanic.

1. תגובה גזע המוח (ABR)

הערה: ABR מדידות נאספו באמצעות השמיעה ציוד בדיקות תוכנה. ABR מייצג לפוטנציאלים או גלים בתדירות גבוהה שנוצרו על-ידי עצב הגולגולת השמיני (גל I ו- II) ומבנים אחרים גבוהה יותר גזע המוח השמיעתית כולל anteroventral שבלול גרעין (הגל השלישי), lemniscus הלטראלי (הגל הרביעי) נחות רקתי (גל V). הגלים האלה מובחנים בהתאם ההשהיה. ABR מדידות בוצעו כפי שתואר לעיל¹².

1. עזים ומתנגד חולדות בתערובת של 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 17 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים באמצעות בקרום הבטן הזרקה. לאשר את עומק ההרדמה באמצעות הבוהן-קמצוץ רפלקס. חלות שתי העיניים כדי למנוע ייבוש העיניים ולהימנע כיבת במהלך הרדמה שימון אופטלמולוגי (או טיפות שמן מינרלי).
2. מקם את החולדה במצב שכיבה על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס) בתוך תא אקוסטי מבוקרת. ציוד בדיקות audiology ממוקם בחוץ, ליד הביתן.
3. הכנס פלדת אל-חלד אלקטרודות בהתאם: לאגף האלקטרודה הקרקע בחלק האחורי, את האלקטרודה החיובית בין שתי האוזניים ישירות על גבי הגולגולת, האלקטרודות שלילי מתחת פינה בכל אוזן.
4. החל אקוסטית גירויים באמצעות מתמרים בתדירות גבוהה כמו פרץ הטון 5 ms-8, 16 ו- 32 קילו-הרץ. לקבוע עוצמות הגירוי כמו רמת לחץ קול דציבלים (dB SPL). זה מתחיל ב 10 dB SPL ומגיעה SPL 90-dB עם גודל שלב 10-dB. כיילו את עוצמות הקול הפלט המרבית של SPL 90-dB באמצעות של הדחף דיוק קול מד-רמה.
   הערה: תוצאת הבדיקה נותנת אינדיקציה השלמות של האיבר שמיעה היקפית, שבלול, המבנים השמיעה הנ. ואת נוצרים בתוך 15 ms של גירוי קלט ותלוי ההשהיה של הגלים בזמן הולכה, אשר בתורו מוסדר על ידי שלושה גורמים קריטיים: נפח המוח, את העוצמה, וגם את התדירות של הצליל. רופא בכיר נרשמו באמצעות תוכנה המסופקת על ידי היצרן.
5. שקול את עוצמת מינימום אשר שעלול לעורר שני ואת שונים (II ו- III) של 0.5 µV משרעת כמו הסף באופן בולט.
   הערה: המשמרת סף מייצגת את ההבדל בין הסף נמדד לאחר הטיפול לעומת הסף שהושגו לפני הטיפול.

2. טרנס-Tympanic זריקות

1. כדי להזריק את הסם טרנס-tympanically, מקם את החולדה במצב חימום הלטראלי השמאלי.
   1. הכנס specula האוזן חד פעמיות 2.5 מ מ לתוך תעלת האוזן.
   2. עם השימוש של תחום כירורגי, מקם את specula כך התוף הוא גלוי.
   3. באמצעות 29 G X ½, מזרק אינסולין 0.5 mL, צייר את µL 50 של האדנוזין איזופרופיל phenyl [R] - N-(R-PIA) פתרון (1 מיקרומטר), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) פתרון (3 מיקרומטר) או פתרון siRNA (0.9 µg) כדי להזריק (5 יחידות).
   4. השתמש את specula לכוון את המחט לאזור נחות הקדמי התוף.
   5. דקרו דרך הקרום עם המחט ולפקח על הסמים מוזכרת 1.2.3. לאפשר את החולדה לנוח בתנוחה זו למשך 15 דקות.
      הערה: 50 µL צריך להיות לאמצעי הולם להיכנס מאחורי התוף. אין נוזלים צריך להיות בתעלת האוזן לאחר ניהול.
   6. למקם את החולדה הזכות חמצן לרוחב למקם וחזור על שלבים 1.2.1 דרך 1.2.5 עבור ניהול באוזן השנייה.
2. עבור עכברים שקיבלו ציספלטין intraperitoneally, למקם את החולדה במצב פרקדן על כרית החימום ב 37 º C.
   1. שימוש 21 G X 3/4 פרפר המחט (אורך צינורות-12), צייר את ציספלטין (11 מ"ג/ק"ג, 1 מ"ג/מ"ל פתרון סטרילי פוספט תמיסת מלח מאגר [PBS]).
   2. באמצעות מזרק משאבה, לנהל ציספלטין (1 מ"ג/מ"ל) באמצעות בקרום הבטן הזרקת מעל 30 דקות.
      הערה: עכברוש 250-g, אמצעי האחסון יהיה 2.75 מ ל שיעור של-0.1 מ"ל לכל מין.
3. נמשיך לעקוב העומק של הרדמה במהלך הליכים אלה. לאחר סיום הממשל ציספלטין, למקם את החולדה חזרה לכלוב במצב שכיבה, מוודא. הכל הולך להכשיל את הנשימה שלה.
4. נטר את החולדה עד החלים לחלוטין.

3. שבלול לנתיחה, Decalcification

1. בעקבות ABR הסופית (לאחר 72 h), עזים ומתנגד העכברוש בתערובת של 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 17 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים באמצעות בקרום הבטן הזרקה. לאשר הרדמה עם רפלקס הבוהן-קורט. המתת חסד עכברים באמצעות עריפת ראש.
2. שווייץ העצם הטמפורלית כפי שתואר לעיל¹³.
3. מקום שבלול 4% paraformaldehyde 1 x פתרון PBS ב בקבוקון נצנוץ 7-מ"עמ (מכסה לחלוטין שבלול). להכניס למקרר למשך הלילה ב 4 º C. להסיר paraformaldehyde, לשטוף עם PBS x 1 בטמפרטורת החדר.
4. הסר PBS ולמלא את הצינור לחלוטין עם פתרון 120 מ של EDTA (pH 7.3). מניחים על מסובב בטמפרטורת החדר ולאפשר decalcification במשך 2-3 שבועות, שינוי הפתרון EDTA מדי יום.

4. Cryosectioning

1. עם הסיום של decalcification, המהירה שבלול ב הפתרונות הבאים (7 מ ל כל אחד) במשך 24 שעות ביממה ב 4 ° c: 10% סוכרוז, 20% סוכרוז, 1:1 תערובת של 20% סוכרוז, טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) הטמעה מורכבים.
2. במקום OCT טריים תרכובת. כדי למלא ומכסים לחלוטין שבלול ב 15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ מ חד פעמיות הטבעה עובש. אוריינט שבלול על הצד כך שהוא מקביל לשורש להטבעה, כפי שתואר על ידי Whitlon et al. ¹⁴
3. מיד במקום העובש על קרח יבש כדי לחזק את ה-OCT ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. לטבול שקופיות מיקרוסקופ ב- 0.01% פולי-L ליזין בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות להסיר השקופיות, לא לשטוף, וגם תאפשר לילה יבש. השתמש שקופיות אלה עבור cryosections.
5. להסיר שבלול ב אוקטובר מהמקפיא-80 מעלות ומניחים אותו על קרח יבש. בעזרת סכין חדה מיקרוטום (L x w: 80 מ מ x 8 מ מ, עובי 0.25 מ מ, חיתוך בזווית של 34 °), סעיף הבלוקים OCT-10 מיקרומטר באמצעות cryostat ב-30 מעלות צלזיוס. מקום שני מקטעים לכל שקופית.
6. להכניס למקרר שקופיות ב 4 ° C בסיום.

5. אימונוהיסטוכימיה

1. מקם את השקופיות זכוכית מיקרוסקופ שקופית מכתים מאכל על מתלה שקופיות. למלא את הצלחת עם 350 מ של 1 x PBS ולשטוף את השקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
2. הסר את השקופיות של המנה, לייבש את האזור סביב הרקמה באמצעות מחיקה יבשה, להיות בטוח שלא לייבש את הרקמה.
   1. באמצעות עט חסימה נוזלי, צייר עיגול מסביב סעיף הרקמה.
3. לחסום את הרקמה לשעה בטמפרטורת החדר על-ידי הוספת µL 150 של פתרון חסימה המכיל 10% רגילה (חמור) סרום דטרגנט nonionic 1%, 1% BSA ב- 1 x PBS.
4. הקש את עודף פתרון חסימה, דגירה הרקמה בין לילה ב 4 ° C בתוך תא humidified עם 150 µL של 10% רגילה (חמור) בסרום, דטרגנט nonionic 0.1% נוגדן ראשוני (ראה להלן בהערה) ב 1 x PBS.
   הערה: עבור הבאים נוגדנים, שימשו דילולים אלה: עבור איור 2 ו- 3, p-STAT1 Ser⁷²⁷ 1:300. איור 4, p-STAT1 Ser⁷²⁷, בטחונות, TRPV1 מטריים.
5. מקם את השקופיות זכוכית מיקרוסקופ בשקופית מכתים מאכל על מתלה שקופיות. למלא את הצלחת עם 350 מ של 1 x PBS ולשטוף שקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
6. דגירה עם נוגדנים משניים מדולל בתמיסה המכילה אבקת nonionic 0.01%, 10% רגילה (חמור) בסרום ב- PBS 1 x עבור 2 עד 3 שעות בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified בחושך.
   הערה: עבור הנוגדנים משני הבאים, שימשו דילולים אלה: עבור איור 2 ו- 3, 1:600 חמור נגד הארנב אג. איור 4, Rhodamine (TRITC) חמור נגד הארנב אג שבערך, החמור נגד עז אג שבערך.
7. מקם את השקופיות זכוכית מיקרוסקופ בשקופית מכתים מאכל על מתלה שקופיות. למלא את הצלחת עם 350 מ של 1 x PBS ולשטוף שקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
8. הקש על עודף נוזל מחוץ לשקופית ולאחר יבש השקופית עם מגבון יבש סביב הרקמה. הר השקופיות על-ידי הוספת טיפה אחת של הסוכן הרכבה עם דאפי ישירות על גבי הרקמה. לאט לאט למקם את coverslip עליון, המבטיח כי אין בועות נוצרות מתחת, ולאפשר את השקופיות לרפא ללילה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחסן שקופיות ב 4 º C.
9. תמונות שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. משתמשים בלייזר הדמיה כדלקמן: UV לייזר דאפי, 488 ננומטר לייזר עבור החמור נגד הארנב אג של 543 ננומטר לייזר עבור rhodamine TRITC.

תוצאות

תגובות ABR שנמדד בחולדות-שלושה ימים הבאים ציספלטין המינהל הראו הגברה משמעותית של ספי. העלאת סף אלו פחתו משמעותית בחולדות עם טרנס-tympanic [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), אדנוזין₁ קולטן אגוניסט¹⁵, לפני ציספלטין. ייחודה של הפעולה של R-פיא-האדנוזין קולטן

Discussion

המסלול המינהל טרנס-tympanic מאפשר למסירה המותאמות לשפות אחרות של סמים, סוכנים אחרים שבלול אשר יכול לייצר אחרת מערכתית תופעות לוואי משמעותיות אם מנוהל מערכתית. שיטה זו של והתרופות האמריקני מאפשר גישה מהירה של סמים לאתר של פעולה במינון גבוה משמעותית מאשר תושג באמצעות תוואי מערכתי. התוצאות המוב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml	Henry Schein	56344	Controlled substance
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml	Henry Schein	33197
2.5 mm disposable ear specula	Welch Allyn	52432
Surgical Scope	Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe	Fisher Scientific	14-841-32	Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride	Sigma Aldrich	P4394	TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus	Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle	Fisher	14-840-34	Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump	Brain Tree Sci, Inc	BSP-99
Pulse Sound Measurement System	Bruel & Kjaer	Pulse 13 software
High-Frequency Module	Bruel & Kjaer	3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138	Bruel & Kjaer	bp2030
High Frequency Transducer	Intelligent Hearing System	M014600
Opti-Amp Power Transmitter	Intelligent Hearing System	M013010P
SmartEP ABR System	Intelligent Hearing System	M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes	CareFusion	019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free	Fisher Scientific	28908	TOXIC - wear proper PPE
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-26	Can be purchased through other vendors
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500	Can be purchased through other vendors
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500	Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound	Fisher Scientific	4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm)	Fisher Scientific	22-363-553	Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm)	MidSci	1354W	Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1)	Fisher Scientific	12-542-B	Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%)	EMD Millipore	A-005-C	Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat	Thermo Fischer Scientific	956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades	Thermo Fischer Scientific	3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack	Fisher Scientific	08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker	Ted Pella, Inc.	22309
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121	Can be purchased through other vendors
TritonX-100	Acros	21568	Can be purchased through other vendors
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody	Cell Signaling	9177
VR1 Antibody (C-15)	Santa Cruz	sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-485-152	Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat	Jackson Immuno Research	705-485-003	Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit	Jackson Immuno Research	711-025-152	Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI	Thermo Fisher	P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine	Sigma Aldrich	P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine	Sigma Aldrich	C101
siRNA pSTAT1	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
siRNA NOX3	Qiagen	Custome Made	Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Kaur et al. 201120