La ingestión de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar capacidades de absorción de fluidos en insectos

Resumen

Líquido de alimentación insectos tienen la capacidad de adquirir cantidades diminutas de líquido de superficies porosas. Este protocolo describe un método para determinar directamente la capacidad de los insectos a ingerir líquidos de superficies porosas utilizando soluciones de alimentación con nanopartículas magnéticas, fluorescentes.

Resumen

Líquido de alimentación insectos ingieren una gran variedad de líquidos, que están presentes en el ambiente como piscinas, películas, o confinados a pequeños poros. Estudios de adquisición líquido requieren evaluar las relaciones estructura y función del mouthpart; sin embargo, mecanismos de absorción de líquido históricamente se infieren de las observaciones de la arquitectura estructural, a veces acompañado con evidencia experimental. Aquí, Divulgamos un nuevo método para evaluar la capacidad de absorción de líquido con mariposas (Lepidoptera) y moscas (Diptera) con pequeñas cantidades de líquidos. Insectos se alimentan con una solución de sacarosa 20% mezclada con nanopartículas magnéticas, fluorescentes de papeles de filtro de tamaño de poro determinado. El cultivo (estructura interna para guardar líquidos) se extrae del insecto y colocado en un microscopio confocal. Un imán es agitado por el cultivo para determinar la presencia de nanopartículas, que indican si los insectos son capaces de ingerir líquidos. Esta metodología se utiliza para revelar un mecanismo alimentación generalizado (acción capilar y formación de puente líquido) que es potencialmente compartido entre Lepidoptera y Diptera cuando alimentación de superficies porosas. Además, este método puede utilizarse para estudios de mecanismos de entre una variedad de insectos de alimentación de líquido, los importantes incluidos en la transmisión de la enfermedad y biomimética y potencialmente otros estudios que implican tamaño nano o micro conductos de alimentación donde transporte líquido requiere verificación.

Introducción

Muchos grupos de insectos tienen piezas bucales (probóscide) adaptado para alimentarse de líquidos, tales como néctar, frutas, la descomposición de sap flujos (por ejemplo ¹de Diptera, Lepidoptera², Hymenoptera³), xilema (Hemiptera⁴), lágrimas (Lepidoptera ⁵) y sangre (Phthiraptera⁶, Siphonaptera⁷, Diptera⁷,⁸de Hemiptera, Lepidoptera⁹). La capacidad de los insectos se alimentan de fluidos es relevante para la salud del ecosistema (por ejemplo, polinización,¹⁰), enfermedad transmisión^4,11, biodiversification^2,12y estudios de evolución convergente¹³. A pesar de la amplia variedad de fuentes de alimentos, un tema entre algunos insectos de alimentación de fluido es la capacidad de adquirir pequeñas cantidades de líquidos, que podrían limitarse a gotitas de tamaño micro o nano, películas líquidas o superficies porosas.

Dada la amplia diversidad de insectos de alimentación de líquido (más del 20% de las especies animales^14,15) y su capacidad para alimentarse de una variedad de fuentes de alimentos, entendiendo su alimentación comportamientos y mecanismos de absorción de líquido es importante en muchos campos. Funcionalidad del mouthpart insectos, por ejemplo, ha desempeñado un papel en el desarrollo de tecnología biomimética, p. ej., dispositivos de microfluidos que pueden realizar tareas como la adquisición de pequeñas cantidades de líquidos utilizando métodos similares a los empleados por insectos¹⁶. Un problema fundamental en los estudios de los mecanismos de absorción de líquido, sin embargo, es determinar no sólo cómo insectos se alimentan de líquidos, pero adquirir evidencia experimental que apoya el mecanismo. Únicamente mediante el comportamiento (por ejemplo, sondeando con la probóscide^12,17) como un indicador de alimentación es insuficiente porque no confirma la exitosa absorción de líquidos, ni provee un medio para determinar la ruta que fluidos de viaje su paso a través de los insectos. Además, realizar experimentos con pequeñas cantidades de líquidos mejor representa escenarios naturales de alimentación donde los fluidos son un recurso limitante^2,12.

Fase de proyección de imagen de contraste se utilizó con la mariposa monarca (Danaus plexippus L.) para evaluar cómo las mariposas se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas¹²de rayos x. Mariposas monarca usa acción capilar a través de espacios entre proyecciones cuticulares (legulae dorsal) a lo largo de la probóscide para hacer fluidos confinados a pequeños poros en el canal de alimentación. Los fluidos entrantes forman una película en la pared del canal de alimentos que crece y se derrumba en un puente líquido por meseta inestabilidad^12,18, que luego es transportada al intestino de la mariposa por la acción de la bomba de succión en la cabeza. Aunque la proyección de imagen contraste fase de rayos x es una herramienta óptima para la visualización de flujo de fluidos en insectos^12,19,20,21, la técnica no es fácilmente disponible y más conveniente el método es necesario para la evaluación rápida de la capacidad de un insecto para líquidos de absorción e ingerirlos.

Para determinar si el mecanismo de alimentación de D. plexippus se aplica a otros lepidópteros y también a las moscas (Diptera) (ambos grupos se alimentan de líquidos de superficies porosas), Lehnert et al. ¹³ aplica una técnica para evaluar la capacidad de un insecto que se alimentan de pequeñas cantidades de líquidos de superficies porosas, que se divulga en detalle aquí. Aunque el protocolo descrito aquí es para estudios que utilizan húmedos y superficies porosas, la metodología puede modificarse para otros estudios, tales como abordar mecanismos de alimentación de piscina. Además, las aplicaciones se extienden a otros campos, incluyendo la tecnología microfluídica y Bioinspirados.

Protocolo

1. insectos especies, preparación de soluciones y la configuración de la estación de alimentación

Nota: las mariposas de la col (Pieris rapae L., Pieridae) son seleccionados como la especie de Lepidoptera representante porque se han utilizado en estudios previos de capacidades de absorción de líquido y mouthpart morfología^22,23. Moscas domésticas (Musca domestica L., Muscidae) y las moscas de botella azul (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) se usan porque se observan a menudo alimentándose de superficies porosas¹³.

1. Orden p. rapae como larvas de un insecto proveedor y posterior en artificiales de la dieta (véase Tabla de materiales) hasta que pupan y emergen como adultos en una cámara ambiental de 23 ° C y un fotoperiodo de 18 L: 6. Orden M. domestica y C. vomitoria como pupas y posterior en las mismas condiciones ambientales que p. rapae. No alimentar moscas y mariposas adulto después de que emergen de las pupas antes de los experimentos de alimentación.
2. Preparar una solución de sacarosa al 20% (control) y una solución de nanopartículas de sacarosa 20% para comprobar la absorción de líquido. Preparar la solución de nanopartículas mediante la adición de nanopartículas magnéticas fluorescentes (óxido de hierro con una capa de ácido poliacrílico, aproximadamente 20 nm de diámetro)²⁴ a una solución de sacarosa 20% (1 mg/mL dH₂O nanopartículas con 20% de sacarosa solución 1:1). Preparar una solución de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) (10 x diluido a 1 x en dH₂O, pH 7.4), que se utiliza para disecciones.
3. Configurar una estación de alimentación que consiste en un manipulador manual con una abrazadera y una etapa de alimentación separada (una plataforma plana) (figura 1). Colocar un portaobjetos cóncavo en la etapa de alimentación y filtros de red de nylon con un diámetro de tamaño de poro de 11, 20, 30, 41 y 60 μm y membrana filtros con diámetros de tamaño de poros de 1, 5, 8 o 10 μm cerca de los experimentos de alimentación.

2. Protocolo de alimentación

1. Envolver los cuerpos, piernas y alas de los insectos en un papel doblado. Coloque el insecto de modo que sólo la cabeza y partes bucales están expuestos. Coloque las alas de los insectos entre dos portaobjetos, que se mantienen unidas por la pinza en el manipulador para que el insecto está suspendido por encima de la etapa de alimentación (figura 1).
2. Administrar una gota de 30 μl de la solución de sacarosa al 20% o la solución al 20% sacarosa nanopartículas con una micropipeta en el centro de la diapositiva cóncava. Coloque un solo papel de filtro de un tamaño específico de poro portaobjetos cóncavo para que el centro del papel de filtro se alinea con la gota de la solución de nanopartículas. El contacto entre la gota y el papel de filtro da como resultado la solución que se separa a lo largo el papel de filtro, llenar los poros (figura 1).
   Nota: El papel de filtro se coloca sobre la gota, en lugar de al revés, para reducir al mínimo la presencia potencial de las nanopartículas sobre el papel de filtro donde se alimentan los insectos.
3. Coloque el insecto con el manipulador de modo que sólo las regiones distales de las piezas bucales pueden contactar con el papel de filtro impregnado en la etapa de alimentación (figura 1). Utilice un pasador de insectos para extender las piezas bucales en el papel de filtro y permitir que el insecto para alimentarse de 45 s.
4. Para minimizar la posibilidad de insectos alimentándose de películas líquidas que pueden estar presentes en la superficie del papel filtro, coloque las piezas bucales para que estén en contacto con una parte del papel de filtro que está tocando la parte plana de la diapositiva (es decir. no directamente sobre la parte cóncava de la diapositiva). Si el insecto no expresa un interés en la alimentación, las piezas bucales pueden guardarse para el papel de filtro con el pasador de insectos el tiempo de la alimentación.

3. disecciones

1. Poner la solución de PBS en un vidrio de reloj de 50 mm que hay suficiente solución para cubrir el cuerpo de los insectos. Colocar el vidrio de reloj bajo un estereoscopio y posición insecto disección equipo (resorte micro disección, tijeras, alfileres insectos, pinzas de disección de punta fina) al lado del estereoscopio.
2. Después de alimentar, retirar el insecto desde el papel de tejido y manténgalo con alas cerradas. Quitar la cabeza, las patas y las alas del insecto con las tijeras de disección micro muelle y coloque el insecto en la solución de PBS en el vidrio de reloj (figura 2).
3. Si es necesario, anestesiar insectos antes de disecciones. Utilice pinzas para sujetar el insecto por la cutícula cerca de la región distal del abdomen. Con la mano dominante, utilizar el micro de primavera tijeras de disección para cortar la cutícula en sentido anterior a lo largo de la parte lateral del abdomen, comenzando en el extremo posterior, hasta el tórax. Tenga especial cuidado para asegurar que se corta sólo la cutícula y que el tubo digestivo en los insectos no está dañado (figura 2).
4. Hacer recortes adicionales de la cutícula con las tijeras de disección para abrir el abdomen para revelar el tubo digestivo interior (figura 2). Quitar la cutícula abdominal, grasa corporal y otras estructuras con la ayuda de insectos pasadores y reubicarlas fuera el vidrio de reloj para la posterior eliminación, dejando sólo el tórax y el tubo digestivo en el vidrio de reloj.
   Nota: La disección revelará el cultivo, que es una estructura de forma de saco (una extensión del canal alimenticio) situada cerca de la confluencia del tórax y el abdomen.
5. Si el cultivo no está expuesto, hacer incisiones adicionales en el tórax con las tijeras hasta que quede expuesto el cultivo. Una vez que el cultivo es visible, corte las partes restantes del insecto, dejando sólo el tubo digestivo con el cultivo en el vidrio de reloj (figura 2).
   Nota: El cultivo de lepidópteros es casi transparente y celofán-como en la naturaleza, que puede ser difícil de reconocer si no se llena de fluidos y ampliado o si se corta durante la disección.
6. Utilice fórceps de disección de punta fina para colocar la cosecha en un cubreobjetos de (24 x 24 mm) para posterior proyección de imagen (figura 2).

4. determinación de nanopartículas ingeridas

1. Posición del cultivo sobre el cubreobjetos con la pinza disección punta fina usando cuidado para evitar la ruptura de la cosecha. Utilice el canal CY3 (o contraste de fases) en un microscopio confocal invertido para obtener imágenes de 20 aumentos. El cultivo de la imagen inmediatamente después de la disección para evitar que se resequen.
2. Mantenga una agitación magnética (41,3 mm de longitud y 8 mm de diámetro) en la mano que no está en control de la etapa de funcionamiento del microscopio.

La barra de agitación magnética y hacia atrás cerca de la cosecha (aproximadamente 10 mm distancia cultivo) de la onda para que cada uno de un lado a otro movimiento tarda aproximadamente un segundo (figura 2).

Mientras que la barra de agitación magnética es agitada, inspeccione el cultivo de las nanopartículas. Mueva lentamente la etapa de funcionamiento hacia adelante y hacia atrás mientras mira a través de la lente ocular del microscopio para el movimiento de nanopartículas dentro el cultivo casi transparente. Si las nanopartículas están presentes en el cultivo, lo que indica la alimentación positiva, van a responder y onda al unísono con la magnética revuelva la barra (figura 2).

Resultados

El estudio de patrones en la capacidad de absorción de líquido entre insectos de alimentación de líquido requiere determinación de alimentación cuando se produce. El protocolo aquí descrito se utiliza para probar la hipótesis limitación de tamaño de poro entre Lepidoptera y Diptera¹³. La hipótesis limitación de tamaño de poro afirma que insectos de alimentación de líquido no pueden alimentar de poros llenos de líquido, si el diámetro de tamaño de ...

Discusión

Funcionalidad de insectos mouthpart históricamente se infiere de los estudios de morfología gruesa (e.g., funcionalidad de lepidópteros probóscide relacionadas con un consumo de paja de^25,26); sin embargo, estudios recientes que incorporan evidencias experimentales han dado como resultado un cambio de paradigma en nuestra comprensión de la complejidad de partes bucales de insectos y las relaciones de estructura y función²

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% sucrose solution	Domino Sugar		Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5493	10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
Single depression concave slide	AmScope	BS-C6	Slide is necessary for feeding stage setup
Filter paper	EMD Millipore	NY6004700 (60 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY4104700 (41 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY3004700 (30 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY2004700 (20 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY1104700 (11 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TCTP04700 (10 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TETP04700 (8 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TMTP04700 (5 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	RTTP04700 (1 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Iris microdissecting scissors	Carolina Biological Supply Company	623555	Scissors used for dissections
Insect pins (#1)	Bioquip Products	1208B1	Pins used during dissections and feeding trials
Extra-fine point dissecting forceps	Carolina Biological Supply Company	624684	Dissecting equipment
Leica M205 C Stereoscope	Leica Microsystems	M205 C	Stereoscope used for dissections
Inverted confocal microscope	Olympus	IX81	Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar	Fisherscientific	S68067	Magnet used to detect nanoparticles
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34155	Tissues used to secure insects during feeding trials
House fly (Musca domestica) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae	Carolina Biological Supply Company	144102	insects for experiments
Finnpipette F1	ThermoFisher Scientific	4641080N	micropipette for dispensing liquids
Finntip 250 pipette tips	ThermoFisher Scientific	9400250	micropipette tips
Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)	AmScope	CS-S24-100	coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope