L'ingestione di fluorescente, nanoparticelle magnetiche per determinare la capacità di assorbimento di liquido negli insetti

Riepilogo

Fluido di alimentazione gli insetti hanno la capacità di acquistare piccole quantità di liquidi da superfici porose. Questo protocollo descrive un metodo per determinare direttamente la capacità per gli insetti di ingerire liquidi da superfici porose utilizzando soluzioni d'alimentazione con nanoparticelle fluorescenti, magnetiche.

Abstract

Fluido di alimentazione insetti ingeriscono una varietà di liquidi, che sono presenti nell'ambiente come piscine, pellicole, o confinati a piccoli pori. Gli studi del liquido acquisizione richiedono valutazione relazioni di struttura e funzione di parte della bocca; Tuttavia, meccanismi di assorbimento fluido storicamente vengono dedotti dalle osservazioni di architettura strutturale, a volte non accompagnato con prove sperimentali. Qui, segnaliamo un nuovo metodo per la valutazione della capacità di assorbimento di liquido con farfalle (Lepidoptera) e mosche (Diptera) utilizzando piccole quantità di liquidi. Gli insetti sono alimentati con una soluzione di saccarosio 20% mescolata con nanoparticelle fluorescenti, magnetiche da filtri di carta delle dimensioni dei pori specifici. Il raccolto (struttura interna utilizzata per la conservazione dei liquidi) è rimosso dall'insetto e collocato su un microscopio confocale. Un magnete è sventolato la coltura per determinare la presenza di nanoparticelle, che indicano se gli insetti sono in grado di ingerire liquidi. Questa metodologia viene utilizzata per rivelare un diffuso meccanismo di alimentazione (azione capillare e la formazione di liquido ponte) che è potenzialmente condivisa tra lepidotteri e Ditteri quando si alimentano da superfici porose. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per studi di meccanismi tra una varietà di insetti d'alimentazione fluido, compresi quelli di importante nella trasmissione della malattia e biomimetica e potenzialmente altri studi che coinvolgono un nano o micro-imprese condotti di alimentazione dove trasporto liquido richiede la verifica.

Introduzione

Molti gruppi degli insetti hanno apparato boccale (proboscide) adattato per cibarsi di fluidi, ad esempio nettare, frutta, di decomposizione sap flussi (ad es. Ditteri¹, Lepidoptera², imenotteri³), xilema (Hemiptera⁴), lacrime (Lepidoptera ⁵) e il sangue (Phthiraptera⁶, Siphonaptera⁷, Ditteri⁷, Hemiptera⁸, Lepidoptera⁹). La capacità degli insetti di nutrirsi di fluidi è rilevante per la salute dell'ecosistema (per esempio l'impollinazione¹⁰), malattia trasmissione^4,11, morfofunzionale^2,12e studi di evoluzione convergente¹³. Nonostante l'ampia varietà di fonti di cibo, un tema fra alcuni insetti d'alimentazione fluido è la possibilità di acquistare piccole quantità di liquidi, che potrebbero essere limitati alle goccioline micro o nano-dimensioni, pellicole liquide o superfici porose.

Data la vasta diversità di insetti d'alimentazione fluido (oltre il 20% di tutte le specie animali^14,15) e la loro capacità di alimentazione su una varietà di fonti dell'alimento, comprendere la loro alimentazione comportamenti e meccanismi di assorbimento di liquido è importante in molti campi. Funzionalità di parte della bocca dell'insetto, per esempio, ha giocato un ruolo nello sviluppo della tecnologia biomimetici, ad esempio, dispositivi microfluidici che possono eseguire attività quali l'acquisizione di piccole quantità di liquidi utilizzando metodi simili a quelli impiegati da insetti¹⁶. Un problema fondamentale negli studi dei meccanismi di assorbimento fluido, tuttavia, è determinare non solo come gli insetti si nutrono di fluidi, ma l'evidenza sperimentale che supporta il meccanismo di acquisizione. Utilizzando esclusivamente il comportamento (ad es., sondando con la proboscide^12,17) come un indicatore per l'alimentazione è insufficiente perché non confermare il successo assorbimento dei liquidi, né fornisce un mezzo per determinare la route che fluidi di viaggio che passano attraverso l'insetto. Inoltre, effettuando esperimenti con piccole quantità di fluidi meglio rappresenta gli scenari d'alimentazione naturali dove i fluidi sono una limitazione delle risorse^2,12.

X-ray imaging contrasto è stato utilizzato con la farfalla monarca (Danaus plexippus L.) per valutare come le farfalle si nutrono di piccole quantità di liquidi da superfici porose¹²fase. Farfalle monarca utilizzare azione capillare tramite spazi tra proiezioni cuticolari (dorsale legulae) lungo la proboscide per portare fluidi confinati a piccoli pori nel canale alimentare. I fluidi in ingresso formano una pellicola sulla parete del canale alimentare che cresce e collassa in un ponte liquido da Plateau instabilità^12,18, che viene quindi trasportato all'intestino della farfalla di azione della pompa succhia in testa. Anche se imaging di contrasto di fase a raggi x è uno strumento ottimo per la visualizzazione di flusso del fluido all'interno di insetti^12,19,20,21, la tecnica non è prontamente disponibile e un più conveniente Metodo è necessario per la rapida valutazione della capacità di un insetto di fluidi di assorbimento e li ingeriscono.

Per determinare se il meccanismo di alimentazione per d. plexippus vale per altri lepidotteri e anche per mosche (Diptera) (entrambi i gruppi si nutrono di liquidi da superfici porose), Lehnert et al. ¹³ applicata una tecnica per la valutazione della capacità di un insetto di piccole quantità di liquidi si nutrono da superfici porose, che è segnalata dettagliatamente qui. Sebbene il protocollo descritto qui è per gli studi che utilizzano bagnati e superfici porose, la metodologia può essere alterata per altri studi, come quelli d'alimentazione piscina meccanismi di indirizzamento. Inoltre, le applicazioni di estendono ad altri campi, compresa la tecnologia microfluidica e ispirati.

Protocollo

1. insetto specie, preparazione di soluzioni e di alimentazione stazione Setup

Nota: le farfalle di cavolo (Pieris rapae L., Pieridae) sono selezionati come le specie di lepidotteri rappresentante perché sono stati utilizzati in studi precedenti di capacità di assorbimento di liquido e parte della bocca morfologia^22,23. Casa mosche (Musca domestica L., Muscidae) e mosche blu bottiglia (vomitoria di Calliphora L., Calliphoridae) vengono utilizzati perché si osservano spesso alimentazione su superfici porose¹³.

1. Ordine p. rapae come larve da un fornitore di insetto e posteriore li su artificiale dieta (Vedi Tabella materiali) finché si impupano ed emergere come adulti in una camera climatica impostato a 23 ° C ed un fotoperiodo di 18 L: 6. Ordine M. domestica e c. vomitoria come pupe e allevarli alle stesse condizioni ambientali p. rapae. Non mangiare mosche e farfalle adulte dopo che emergono dalle pupe prima le prove di alimentazione.
2. Preparare una soluzione di saccarosio 20% (controllo) e una soluzione di nanoparticelle 20% saccarosio per verificare l'assorbimento fluido. Preparare la soluzione di nanoparticelle con l'aggiunta di nanoparticelle magnetiche fluorescente (ossido di ferro con un rivestimento acido poliacrilico, circa 20 nm di diametro)²⁴ a una soluzione di saccarosio (1 mg/mL dH₂O nanoparticelle con saccarosio al 20% di 20% soluzione 1:1). Preparare una soluzione di 1 x di tampone fosfato salino (PBS) (10x diluito a 1 x in dH₂O, pH 7.4), che viene utilizzato per le dissezioni.
3. Impostare una stazione di alimentazione che consiste di un manipolatore manuale con una pinza e una fase di alimentazione separata (una pedana piatta) (Figura 1). Disporre un vetrino concavo sulla fase d'alimentazione e hanno filtri rete in nylon con diametri di dimensione del poro di 11, 20, 30, 41 o 60 µm e membrana filtri con pori diametri di dimensione di 1, 5, 8, o 10 µm nelle vicinanze per le prove di alimentazione.

2. protocollo di alimentazione

1. Avvolgere il corpo dell'insetto, zampe e ali in una velina piegata. Posizionare l'insetto in modo che solo la testa e l'apparato boccale sono esposti. Mettere le ali dell'insetto tra due vetrini da microscopio, che sono tenuti insieme mediante il morsetto sul manipolatore affinché l'insetto viene sospesa sopra la fase di alimentazione (Figura 1).
2. Somministrare una goccia di 30 µ l di soluzione di saccarosio al 20% o la soluzione di nanoparticelle di saccarosio 20% con una micropipetta al centro del vetrino concavo. Posizionare una singola carta da filtro di dimensioni specifiche poro il vetrino concavo in modo che il centro della carta da filtro è allineato con la goccia della soluzione di nanoparticelle. Il contatto tra la goccia e la carta da filtro risultati nella soluzione diffondendo lungo la carta da filtro, riempimento dei pori (Figura 1).
   Nota: La carta da filtro è posizionata sopra la goccia, piuttosto che l'altro senso intorno, per ridurre al minimo la potenziale presenza di nanoparticelle in cima alla carta filtro dove gli insetti da mangiare.
3. Posizionare l'insetto con il manipolatore in modo che solo le regioni distali dell'apparato boccale possono contattare la carta da filtro bagnata sulla fase di alimentazione (Figura 1). Utilizzare un pin di insetto per estendere l'apparato boccale sulla carta da filtro e consentire l'insetto sfamare per 45 s.
4. Per ridurre al minimo la possibilità di insetti che si alimenta sul pellicole liquide che potrebbero essere presenti sulla superficie della carta da filtro, posizionare l'apparato boccale in modo che essi sono in contatto con una parte della carta da filtro che sta toccando la parte piatta della diapositiva (vale a dire. non direttamente sopra la parte concava della diapositiva). Se l'insetto non esprime un interesse per l'alimentazione, l'apparato boccale possono terrà per il filtro di carta con il pin dell'insetto per tutta la durata del tempo d'alimentazione.

3. le dissezioni

1. Posizionare la soluzione PBS in un vetro da orologio 50 millimetri in modo che c'è una soluzione abbastanza per coprire il corpo dell'insetto. Posizionare il vetro d'orologio sotto un insetto stereoscopio e posizione dissezione attrezzature (primavera micro dissezione Forbici, spilli entomologici, punta fine forcipe di dissezione) accanto allo stereoscopio.
2. Dopo l'alimentazione, rimuovere l'insetto dalla carta velina e tenere con le ali chiuse. Rimuovere la testa, le gambe e le ali dell'insetto con le forbici per dissezione micro di primavera e l'insetto nella soluzione PBS nel vetro d'orologio (Figura 2).
3. Se necessario, anestetizzare gli insetti prima di dissezioni. Utilizzare pinze per tenere l'insetto per la cuticola nei pressi della regione distale dell'addome. Con la mano dominante, uso il micro di primavera per dissezione Forbici per tagliare le cuticole in un senso anteriore lungo il lato laterale dell'addome, a partire all'estremità posteriore, fino a raggiunta il torace. Faccia particolare attenzione per garantire che solo la cuticola è tagliata e che il tubo digerente all'interno l'insetto non è danneggiato (Figura 2).
4. Effettuare ulteriori tagli della cuticola con le forbici per dissezione per aprire l'addome per rivelare il canale alimentare all'interno (Figura 2). Rimuovere la cuticola addominale, corpo grasso e altre strutture con l'aiuto di spilli entomologici e spostarli fuori il vetro d'orologio per successivo smaltimento, lasciando solo il torace e il canale alimentare nel vetro d'orologio.
   Nota: La dissezione rivelerà il raccolto, che è una struttura di sac-like (un'estensione del canale alimentare) situata vicino all'intersezione del torace e dell'addome.
5. Se il raccolto non è esposto, fare ulteriori incisioni nel torace con le forbici, fino a quando il raccolto è rivelato. Quando il raccolto è visibile, tagliare via le parti restanti dell'insetto lasciando solo il canale alimentare con la coltura nel vetro d'orologio (Figura 2).
   Nota: Il ritaglio di lepidotteri è quasi trasparente e cellophane-come in natura, che potrebbe essere difficile da riconoscere se non è stato riempito con liquidi e ampliato o se è tagliato durante la dissezione.
6. Utilizzare forcipe di dissezione a punta fine per posizionare il raccolto su un vetrino coprioggetti (24 x 24 mm) per formazione immagine successiva (Figura 2).

4. la determinazione delle nanoparticelle ingerite

1. Posizione il raccolto il coprivetrino con punta fine per dissezione forcipe usando cura prevenire la rottura del raccolto. È possibile utilizzare il canale di CY3 (o contrasto di fase) su un microscopio confocale invertito per l'imaging a 20 ingrandimenti. Immagine il raccolto immediatamente dopo la dissezione per evitare che si secchino.
2. Tenere un ancoretta magnetica (41,3 mm di lunghezza e 8 mm di diametro) con la mano che non è nel controllo della fase operativa del microscopio.

Onde l'ancoretta magnetica e indietro vicino il raccolto (circa 10 millimetri di distanza dal raccolto) affinché ogni avanti e indietro il movimento prende circa un secondo (Figura 2).

Mentre l'ancoretta magnetica è sventolato, ispezionare la coltura per le nanoparticelle. Muovere lentamente avanti e indietro la fase operativa mentre guardando attraverso la lente oculare del microscopio per il movimento di nanoparticelle all'interno il raccolto quasi trasparente. Se le nanoparticelle sono presenti nel foraggio, che indica alimentazione positiva, risponderanno e onda all'unisono con il magnetico mescolare bar (Figura 2).

Risultati

Lo studio di modelli nelle capacità di assorbimento di liquido fra insetti d'alimentazione fluido richiede determinazione di quando l'alimentazione si verifica. Il protocollo descritto qui è utilizzato per verificare l'ipotesi di dimensione dei pori limitante tra lepidotteri e Ditteri¹³. L'ipotesi di dimensione dei pori limitante afferma che fluido di alimentazione gli insetti non possono nutrire da pori pieni di liquido, se il diametro di dimensione dei pori è ...

Discussione

Funzionalità di parte della bocca dell'insetto storicamente viene dedotto dagli studi della morfologia lordo (ad es., lepidotteri proboscide funzionalità relative a un bere di paglia^25,26); Tuttavia, recenti studi che incorporano la prova sperimentale hanno provocato un cambiamento di paradigma nella nostra comprensione della complessità dell'apparato boccale degli insetti e struttura-funzione relazioni^2,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% sucrose solution	Domino Sugar		Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5493	10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
Single depression concave slide	AmScope	BS-C6	Slide is necessary for feeding stage setup
Filter paper	EMD Millipore	NY6004700 (60 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY4104700 (41 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY3004700 (30 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY2004700 (20 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY1104700 (11 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TCTP04700 (10 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TETP04700 (8 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TMTP04700 (5 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	RTTP04700 (1 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Iris microdissecting scissors	Carolina Biological Supply Company	623555	Scissors used for dissections
Insect pins (#1)	Bioquip Products	1208B1	Pins used during dissections and feeding trials
Extra-fine point dissecting forceps	Carolina Biological Supply Company	624684	Dissecting equipment
Leica M205 C Stereoscope	Leica Microsystems	M205 C	Stereoscope used for dissections
Inverted confocal microscope	Olympus	IX81	Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar	Fisherscientific	S68067	Magnet used to detect nanoparticles
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34155	Tissues used to secure insects during feeding trials
House fly (Musca domestica) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae	Carolina Biological Supply Company	144102	insects for experiments
Finnpipette F1	ThermoFisher Scientific	4641080N	micropipette for dispensing liquids
Finntip 250 pipette tips	ThermoFisher Scientific	9400250	micropipette tips
Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)	AmScope	CS-S24-100	coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope