При приеме внутрь люминесцентные, магнитные наночастицы для определения способности поглощения жидкости в насекомых

Резюме

Жидкости кормление насекомые имеют возможность приобретать мельчайшие количества жидкостей из пористых поверхностей. Этот протокол описывает метод для непосредственно определяют способность для насекомых глотать жидкостей из пористых поверхностей с использованием кормления решения с флуоресцентные, магнитные наночастицы.

Аннотация

Жидкости кормления насекомых глотать различные жидкости, которые присутствуют в окружающей среде, как бассейны, фильмы, или ограничивается мелкие поры. Исследования жидких приобретения требуют оценки mouthpart структуры и функции отношения; Однако исторически механизмов поглощения жидкости выводятся из наблюдений структурных архитектуры, иногда без сопровождения с экспериментальными данными. Здесь мы приводим новый метод для оценки способности поглощения жидкости с бабочек (Lepidoptera) и мух (Diptera), используя небольшое количество жидкости. Насекомых питаются с 20% раствор сахарозы, смешанного с флуоресцентные, магнитные наночастицы от фильтра документов размеров конкретных поры. Урожай (внутренняя структура, используемая для хранения жидкости) удаляется из насекомых и размещены на конфокального микроскопа. Магнит помахал посадки для определения присутствия наночастицы, которые указывают, если насекомые способны глотать жидкости. Эта методология используется выявить широко механизм кормления (капиллярность и жидких моста формирования), который потенциально распределяется между Lepidoptera и двукрылых, при кормлении из пористых поверхностей. Кроме того, этот метод может использоваться для исследования кормления механизмов среди различных жидкости кормления насекомых, включая важное значение передачи болезни и биомиметики и потенциально другие исследования, которые включают нано - или микро размера трубы где жидкого транспорт требует проверки.

Введение

Многие группы насекомых имеют ротовые органы (proboscises) адаптирована для кормления на жидкости, такие как нектар, гниение фрукты, sap потоков (например двукрылых¹, Lepidoptera², перепончатокрылые³), ксилема (⁴полужесткокрылые), слезы (Lepidoptera ⁵) и кровь (Phthiraptera⁶, Siphonaptera⁷, двукрылых⁷, Полужесткокрылые⁸, Lepidoptera⁹). Способность насекомых питаются жидкости имеет отношение к здоровья экосистемы (например , опыление¹⁰), болезнь передачи^4,11, biodiversification^2,12и исследования ¹³конвергентной эволюции. Несмотря на большое разнообразие источников продовольствия тема среди некоторых жидкости кормления насекомых — возможность приобрести небольшое количество жидкости, которые могут ограничиваться микро - или нано размера капель, жидких пленок или пористых поверхностей.

Учитывая широкое разнообразие жидкости кормления насекомых (более 20% всех видов животных^14,15) и их способности прокормить на различных источников питания, понимание их кормления поведения и механизмов поглощения жидкости важное значение во многих областях. Насекомое mouthpart функциональность, например, сыграла определенную роль в развитии биомиметических технологии, например, microfluidic приборы, которые могут выполнять задачи, такие как приобретение небольшого количества жидкости, с использованием методов, аналогичных тем, которые работают ¹⁶насекомых. Основная проблема в изучении механизмов поглощения жидкости, однако, определение не только как насекомые питаются жидкости, но приобретения экспериментальных доказательств того, что поддерживает механизм. Исключительно с помощью поведения (например, зондирование с Хоботок^12,17) как индикатор для кормления недостаточно, потому что это не подтверждение успешного поглощения жидкости, и не предоставляет средства для определения маршрута, жидкости поездки, как они проходят через насекомых. Кроме того проведения экспериментов с небольшим количеством жидкости лучше представляет естественный кормления сценарии, где жидкости являются ограничения ресурсов^2,12.

Рентген фазы контраст изображения была использована с бабочка монарх (Данай Плексипп L.) для оценки как бабочки питаются небольшое количество жидкости из пористых поверхностей¹². Бабочки Монарх использовать капиллярность через пробелы между кутикулярного прогнозы (спинной legulae) вдоль Хоботок довести жидкости ограничивается мелкие поры в пищевой канал. Входящие жидкости образуют пленку на стене канала продовольственной, которая растет и падает в жидком мост на плато нестабильности^12,18, который затем транспортируется в кишечнике бабочка действий всасывания насоса в голову. Хотя этап контраст рентгенография является оптимальный инструмент для визуализации потока жидкости внутри насекомых^12,19,20,21, технология не является легкодоступной и более удобным метод необходим для быстрой оценки насекомого способность поглощения жидкости и глотать их.

Чтобы определить, если питание механизм для D. Северной относится к другим Lepidoptera и также мух (Diptera) (обе группы питаются жидкости из пористых поверхностей), Леннерт и др. ¹³ применяется техника для оценки способности насекомых кормить на небольшое количество жидкости из пористых поверхностей, который сообщается здесь подробно. Хотя протокол, изложенные здесь для исследований, которые используют смачивается и пористых поверхностей, методологии могут быть изменены для других исследованиях, например касающиеся кормления бассейн механизмов. Кроме того приложения распространяется на другие поля, включая микрофлюидика и bioinspired технологии.

протокол

1. насекомых видов, подготовку решений и кормления станции настройки

Примечание: капустницы (Pieris rapae л, белянок) выбираются в качестве видов чешуекрылых представитель потому, что они были использованы в предыдущих исследованиях способности поглощения жидкости и mouthpart морфология^22,23. Потому что они часто наблюдаются кормления на пористых поверхностях¹³используются дома мух (Муха domestica L., настоящие мухи) и синей бутылкой мух (Красноголовая синяя vomitoria л, Каллифориды).

1. P. Крыма порядок как личинки насекомых поставщика и задние их на искусственные диеты (см. Таблицу материалы) до тех пор, пока они окукливаются и возникают как взрослых в камеру окружающей среды 23 ° C и 18 Л: 6 d фотопериода. Порядок М. domestica и C. vomitoria как куколок и задние их на тех же условиях окружающей среды, как P. Крыма. Не кормить взрослых бабочек и мух, после того, как они выходят из куколок до кормления экспериментов.
2. Подготовка 20% раствора сахарозы (контроль) и 20% сахарозы наночастиц решение для тестирования для поглощения жидкости. Приготовляют раствор наночастиц, добавив флуоресцентные магнитные наночастицы (оксид железа с полиакриловой кислоты покрытием, около 20 Нм в диаметре)²⁴ -20% раствора сахарозы (1 мг/мл dH₂O наночастиц с 20%-ая сахароза решение 1:1). Подготовить раствор 1 x-фосфатный буфер (PBS) (10 x разбавляют до 1 x в dH₂O, рН 7,4), который используется для вскрытия.
3. Питание станции, которая состоит из ручного манипулятора с зажимом и отдельный этап питания (платформа) (рис. 1). Место вогнутой слайд на стадии подачи и нейлон чистые фильтры диаметром пор размер 11, 20, 30, 41 или 60 мкм и мембранные фильтры с размер поры диаметром 1, 5, 8 или 10 мкм для кормления экспериментов поблизости.

2. питание протокол

1. Обертывание тела, ноги и Крылья насекомых в сложенный папиросной бумаги. Положение насекомых, так что только головы и ротовые органы подвергаются. Место Крылья насекомых между двумя слайдами в Микроскоп, которые проводятся вместе зажим на манипуляторе так, что насекомое подвешенный над кормления стадии (рис. 1).
2. Применять капли 30 мкл раствора сахарозы 20% или 20% раствор сахарозы наночастиц с микропипеткой в центре вогнутой слайда. Место одного фильтра бумаги конкретных поры на вогнутой слайд, так что центр фильтровальная бумага выровнена капли раствора наночастиц. Контакт между капли и фильтровальную бумагу приводит решение распространяется вдоль фильтровальной бумаги, заполняя поры (рис. 1).
   Примечание: Фильтровальная бумага помещен na górze капли, а не другой путь вокруг, чтобы свести к минимуму возможное присутствие наночастиц на вершине фильтровальной бумаги, где кормить насекомых.
3. Положение насекомое с манипулятором, так что только дистальной регионах ротовые можно связаться увлажненный фильтровальная бумага на стадии подачи (рис. 1). Использовать насекомых ПИН-код для расширения ротовые на фильтровальную бумагу и позволить насекомое кормить 45 s.
4. Чтобы свести к минимуму вероятность насекомые, питающиеся жидких пленок, которые могут присутствовать на поверхности бумаги фильтра, положение ротовые так, что они находятся в контакте с частью фильтровальной бумаги, которая соприкасается равнинная часть слайда (т.е. не непосредственно над вогнутой части слайда). Если насекомое не выразить интерес в кормлении, ротовые могут проводиться на бумаге фильтр с насекомых pin для продолжительности время кормления.

3. вскрытия

1. Поместите решение PBS в 50 мм стекла смотреть, так что есть достаточно решение для покрытия тела насекомых. Поместите часы стекло под Стереоскоп и позиции насекомых, рассекает оборудование (Весна микро рассекает ножницы, насекомое булавки, тонкой точке рассекает щипцы) рядом с стереоскоп.
2. После кормления, удалите насекомых из папиросной бумаги и держать его с крыльями, закрыт. Удалить голову, ноги и Крылья насекомых с весны микро рассечения ножницы и насекомых в PBS раствор в часы стекло (рис. 2).
3. При необходимости, анестезировать насекомых до вскрытия. Используйте корнцанг держать насекомых кутикулы вблизи дистальной области живота. С доминирующей рукой используйте микро весной, рассекает ножницы для резки кутикулы в передней направлении вдоль боковой стороны живота, начиная с заднего конца, пока не будет достигнуто грудной клетки. Особая осторожность чтобы вырезать только кутикулы и что желудочно-кишечного тракта внутри насекомое не поврежден (рис. 2).
4. Сделайте дополнительные разрезы кутикулы с рассечения ножницы, чтобы открыть живота выявить желудочно-кишечного тракта внутри (рис. 2). Удаление брюшной кутикулы, жир тела и другие структуры с помощью насекомых булавки и передислоцировать их вне часы стекло для последующей утилизации, оставляя только грудной клетки и желудочно-кишечного тракта в часы стекло.
   Примечание: Вскрытие покажет урожая, который является sac как структура (расширение желудочно-кишечного тракта), расположенный вблизи стыке грудной клетки и живота.
5. Если урожай не подвергается, сделайте дополнительные разрезы в грудной клетки с ножницами до тех пор, пока урожай раскрывается. После того, как урожай является видимым, Отрежьте оставшиеся части насекомых, оставив только желудочно-кишечного тракта с урожая в часы стекло (рис. 2).
   Примечание: Спаривающиеся культур является почти прозрачной и целлофан как в характера, которые могут быть трудно распознать, если это не заполнены с жидкостями и расширена или если это обрезается в ходе вскрытия.
6. Используйте тонкой точке рассекает щипцы культур на coverslip (24 x 24 мм) для последующей обработки изображений (рис. 2).

4. Определение попадает наночастиц

1. Позиция, урожай на coverslip с использованием рассечения щипцы тонкой точке уход для предотвращения разрыва урожая. Используйте на Перевернутый Конфокальный микроскоп для изображений при 20-кратном CY3 канал (или фазового контраста). Изображение урожая сразу после вскрытия, чтобы предотвратить его от высыхания.
2. Держите сенсацию магнитный бар (41,3 мм в длину и 8 мм в диаметре) в руке, которая находится вне контроля операционных Этап микроскопа.

Волны магнитные перемешать бар взад и вперед вблизи сельскохозяйственных культур (приблизительно 10 мм расстояние от урожая), так что каждый взад и вперед движения занимает примерно одну секунду (рис. 2).

В то время как бар магнитные перемешать махнул, осмотрите урожая на наночастиц. Медленно перемещайте стадии эксплуатации взад и вперед, глядя через окуляр объектив микроскопа для наночастиц движения внутри почти прозрачной урожая. Если наночастиц присутствуют в урожае, указывающее позитивные кормление, они будут отвечать и волны в унисон с магнитным перемешать бар (рис. 2).

Результаты

Изучение шаблонов в жидкость поглощение способности среди жидкости кормления насекомых требует определения когда кормления происходит. Для проверки ограничения гипотезы размер порового среди бабочек и двукрылых¹³используется протокол, изложенные здес...

Обсуждение

Насекомое mouthpart функциональность исторически выводится из исследований валового морфологии (например., спаривающиеся Хоботок функции, относящиеся к выпивая сторновки^25,26); Однако недавние исследования, которые включают экспериментальные свидетель...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% sucrose solution	Domino Sugar		Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5493	10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
Single depression concave slide	AmScope	BS-C6	Slide is necessary for feeding stage setup
Filter paper	EMD Millipore	NY6004700 (60 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY4104700 (41 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY3004700 (30 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY2004700 (20 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY1104700 (11 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TCTP04700 (10 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TETP04700 (8 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TMTP04700 (5 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	RTTP04700 (1 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Iris microdissecting scissors	Carolina Biological Supply Company	623555	Scissors used for dissections
Insect pins (#1)	Bioquip Products	1208B1	Pins used during dissections and feeding trials
Extra-fine point dissecting forceps	Carolina Biological Supply Company	624684	Dissecting equipment
Leica M205 C Stereoscope	Leica Microsystems	M205 C	Stereoscope used for dissections
Inverted confocal microscope	Olympus	IX81	Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar	Fisherscientific	S68067	Magnet used to detect nanoparticles
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34155	Tissues used to secure insects during feeding trials
House fly (Musca domestica) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae	Carolina Biological Supply Company	144102	insects for experiments
Finnpipette F1	ThermoFisher Scientific	4641080N	micropipette for dispensing liquids
Finntip 250 pipette tips	ThermoFisher Scientific	9400250	micropipette tips
Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)	AmScope	CS-S24-100	coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope