L’Ingestion de Fluorescent, nanoparticules magnétiques permettant de déterminer les capacités d’absorption de liquide chez les insectes

Résumé

Fluide-insectes ont la capacité d’acquérir d’infimes quantités de liquides dans des surfaces poreuses. Ce protocole décrit une méthode pour déterminer directement la capacité des insectes d’ingérer des liquides de surfaces poreuses à l’aide de solutions d’alimentation avec des nanoparticules fluorescentes, magnétiques.

Résumé

Fluide-insectes ingèrent une variété de liquides, qui sont présents dans l’environnement comme les piscines, films, ou confinés à petits pores. Études d’acquisition liquide nécessitent évaluation des relations de structure et la fonction de pièce buccale ; Toutefois, mécanismes d’absorption fluide sont historiquement déduits des observations de l’architecture structurelle, parfois sans accompagnement avec les données expérimentales. Nous rapportons ici une nouvelle méthode pour évaluer les capacités d’absorption du liquide avec des papillons (Lepidoptera) et flies (Diptera) à l’aide de petites quantités de liquides. Insectes sont nourris avec une solution de saccharose 20 % mélangée avec des nanoparticules fluorescentes, magnétiques de papier-filtre de la taille des pores spécifique. La récolte (structure interne utilisé pour stocker des fluides) est retirée de l’insecte et placée sur un microscope confocal. Un aimant est agité par la culture pour déterminer la présence de nanoparticules, qui indiquent si les insectes sont capables d’ingérer des liquides. Cette méthodologie est utilisée pour révéler un mécanisme alimentation généralisé (action capillaire et formation de ponts liquides) qui est potentiellement partagé chez les lépidoptères et les diptères en se nourrissant de surfaces poreuses. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l’étude des mécanismes parmi une variété d’insectes fluide, y compris ceux qui sont importants dans la transmission de la maladie et biomimetics et potentiellement d’autres études qui impliquent des nano - ou micro-entreprises conduites d’alimentation où transport liquide exige la vérification.

Introduction

De nombreux groupes d’insectes ont des pièces buccales (proboscis) adaptés à l’alimentation sur les fluides, comme le nectar, pourriture des fruits, sève flux (p. ex. diptères¹, lépidoptères², hyménoptères,³), xylème (Hemiptera,⁴), larmes (Lepidoptera ( ⁵) et le sang (Phthiraptères⁶, Siphonaptera⁷, Diptera⁷, Hemiptera⁸, Lepidoptera,⁹). La capacité des insectes pour se nourrir de fluides est pertinente pour la santé de l’écosystème (par exemple la pollinisation¹⁰), la maladie transmission^4,11, biodiversification^2,12et études de l’évolution convergente¹³. Malgré la grande variété de sources de nourriture, un thème parmi certains insectes fluide est la capacité à acquérir de petites quantités de liquides, ce qui pourraient se limiter à la micro ou nano-taille des gouttelettes, films liquides ou les surfaces poreuses.

Compte tenu de la vaste diversité des insectes fluide (plus de 20 % de toutes les espèces animales^14,15) et leur capacité à se nourrir sur une variété de sources de nourriture, comprendre leur alimentation des comportements et des mécanismes d’absorption du liquide est important dans de nombreux domaines. Fonctionnalité de pièce buccale insectes, par exemple, a joué un rôle dans le développement de la technologie biomimétique, par exemple, les dispositifs microfluidiques pouvant effectuer des tâches telles que l’acquisition de petites quantités de liquides à l’aide de méthodes similaires à celles employées par insectes¹⁶. Un problème fondamental dans les études des mécanismes d’absorption fluide, cependant, est déterminant non seulement comment insectes se nourrissent des fluides, mais acquérir des preuves expérimentales qui prend en charge le mécanisme. Uniquement à l’aide de comportement (p. ex., sondant avec la trompe^12,17) comme un indicateur pour l’alimentation est insuffisant car elle ne confirme pas l’adoption réussie de fluides, et ne fournit un moyen pour déterminer l’itinéraire qui fluides de voyage pendant qu’ils traversent l’insecte. En outre, réaliser des expériences avec de petites quantités de liquides mieux représente des scénarios alimentation naturelles où les fluides sont une limitation ressource^2,12.

X-ray phase imagerie de contraste a été utilisée avec le papillon monarque (Danaus plexippus L.) afin d’évaluer comment papillons se nourrissent de petites quantités de fluides de surfaces poreuses¹². Papillons monarques utiliser capillarité via les espaces entre les projections cuticulaires (dorsale legulae) le long de la trompe pour fluides confinés à petits pores dans le canal alimentaire. Les fluides entrants forment une pellicule sur le mur de canal alimentaire qui se développe et s’effondre dans un pont liquide par Plateau instabilité^12,18, qui est ensuite transporté au tube digestif de la butterfly par action de la pompe aspirante dans la tête. Bien que l’imagerie de contraste de phase aux rayons x est un outil optimal pour visualiser l’écoulement du fluide à l’intérieur des insectes^12,19,20,21, la technique n’est pas facilement disponible et un plus pratique méthode est nécessaire pour une évaluation rapide de la capacité de l’insecte aux fluides de l’absorption et les ingérer.

Pour déterminer si le mécanisme d’alimentation pour d. plexippus s’applique aux autres lépidoptères et également à flies (Diptera) (les deux groupes se nourrir de liquides de surfaces poreuses), Lehnert et al. ¹³ appliqué une technique permettant d’évaluer la capacité de l’insecte se nourrissent de petites quantités de liquides provenant des surfaces poreuses, qui est rapportée en détail ici. Bien que le protocole décrit ici est pour les études qui utilisent humidifiés et surfaces poreuses, la méthodologie peut être modifiée pour d’autres études, comme celles traitant des mécanismes d’alimentation piscine. En outre, les applications s’étendent à d’autres domaines, y compris la technologie microfluidique et bioinspired.

Protocole

1. insecte espèce, préparation de Solutions et de configuration de la Station d’alimentation

Remarque : les papillons du chou (Pieris rapae L., Pieridae) sont sélectionnés comme les espèces de lépidoptères représentant parce qu’ils ont été utilisés dans des études antérieures des capacités d’absorption du liquide et la pièce buccale morphologie^22,23. Mouches domestiques (Musca domestica L., Muscidae) et les mouches de la bouteille bleue (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) sont utilisés parce qu’ils sont souvent observés se nourrissant de surfaces poreuses¹³.

1. Ordre de P. rapae sous forme de larves d’un insecte fournisseur et à l’arrière sur artificiel de régime (voir Table des matières) jusqu'à ce qu’ils se transforment en pupes et émergent comme des adultes dans une chambre égale à 23 ° C et une photopériode 18 L : 6. Classement M. domestica et c. vomitoria comme nymphes et leur arrière dans les mêmes conditions environnementales que P. rapae. N’alimentez pas les papillons adultes et mouches après qu’ils émergent de la pupe avant les essais d’alimentation.
2. Préparer une solution de saccharose de 20 % (contrôle) et une solution de nanoparticules de saccharose de 20 % à tester pour l’absorption du liquide. Préparer la solution de nanoparticules en ajoutant des nanoparticules magnétiques fluorescents (oxyde de fer avec un revêtement acide polyacrylique, environ 20 nm de diamètre)²⁴ à une solution de saccharose de 20 % (1 mg/mL dH₂O nanoparticules avec 20 % de sucrose solution 1:1). Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1 x (10 x dilué à 1 x dH₂O, pH 7,4), qui est utilisé pour les dissections.
3. Mettre en place une station d’alimentation qui se compose d’un manipulateur manuel avec une pince et stage alimentation séparée (une plate-forme plate) (Figure 1). Placez une lame concave sur la scène alimentaire et ont des filtres net en nylon d’un diamètre de taille de pore de 11, 20, 30, 41 ou 60 filtres µm et membrane avec des diamètres de taille de pores de 1, 5, 8 ou 10 µm à proximité pour les expériences d’alimentation.

2. protocole d’alimentation

1. Envelopper le corps de l’insecte, les pattes et les ailes dans un papier de soie plissée. Positionner l’insecte de sorte que seulement la tête et les pièces buccales sont exposés. Placer les ailes de l’insecte entre deux lames de microscope, qui sont maintenues ensemble par la pince sur le manipulateur pour que l’insecte est suspendu au-dessus de la scène d’alimentation (Figure 1).
2. Administrer une goutte de 30 µL de la solution de sucrose à 20 % ou de la solution de nanoparticules de saccharose de 20 % avec une micropipette vers le centre de la lame concave. Placer un papier filtre unique d’une taille de pores spécifique sur la lame concave afin que le centre du papier-filtre est aligné avec la goutte de la solution de nanoparticules. Le contact entre la goutte et le papier filtre entraîne la solution propagation le long du papier filtre, remplissant les pores (Figure 1).
   Remarque : Le papier filtre est placé sur le dessus de la gouttelette, plutôt que l’inverse, pour réduire au minimum la présence potentielle de nanoparticules sur le dessus du filtre en papier où les insectes se nourrissent.
3. Positionner l’insecte avec le manipulateur de sorte que seulement les régions distales des pièces buccales peuvent communiquer avec le papier filtre mouillé sur la scène d’alimentation (Figure 1). Une insecte broche permet d’étendre les pièces buccales sur le papier filtre et permettre l’insecte nourrir pendant 45 s.
4. Pour minimiser le risque d’insectes se nourrissant de films liquides qui pourraient être présentes sur la surface du papier filtre, placez les pièces buccales afin qu’ils soient en contact avec une partie du papier filtre qui est en contact avec la partie plate de la lame (i.e. pas directement au-dessus de la partie concave de la diapositive). Si l’insecte n’exprime pas un intérêt pour l’alimentation, les pièces buccales peuvent être tenus pour le papier filtre avec la goupille d’insectes pour la durée de l’alimentation.

3. dissections

1. Placer la solution de PBS dans un verre de montre de 50 mm pour qu’il y a suffisamment de solution pour couvrir le corps de l’insecte. Placez le verre de montre sous un stéréoscope et position insecte dissection équipement (printemps micro ciseaux, épingles à insectes, pointe fine pince de dissection de la dissection) à côté du stéréoscope.
2. Après l’alimentation, retirer le papier de soie de l’insecte et maintenez-le avec ailes fermées. Retirer la tête, les jambes et les ailes de l’insecte avec des ciseaux de dissection micro printemps et placer l’insecte dans la solution de PBS dans le verre de montre (Figure 2).
3. Le cas échéant, anesthésier les insectes avant la dissection. Utilisation des forceps à organiser, la cuticule de l’insecte près de la partie distale de l’abdomen. Avec la main dominante, utiliser le micro de printemps disséquant des ciseaux pour couper la cuticule en direction antérieure le long de la face latérale de l’abdomen, en commençant à l’extrémité postérieure, jusqu'à ce que le thorax est atteint. Prenez particulièrement soin de veiller à ce que seulement la cuticule est coupée et que le tube digestif à l’intérieur de l’insecte n’est pas endommagé (Figure 2).
4. Faire des réductions supplémentaires de la cuticule avec les ciseaux de dissection pour ouvrir l’abdomen pour faire apparaître le tube digestif à l’intérieur (Figure 2). Supprimer la cuticule abdominale, corps gras et autres structures avec l’aide de broches de l’insectes et les transférer à l’extérieur le verre de montre pour élimination ultérieure, laissant seulement le thorax et le tube digestif dans le verre de montre.
   Remarque : La dissection va révéler la récolte, qui est une structure de forme de sac (l’extension du tube digestif), située près de la jonction du thorax et abdomen.
5. Si la culture n’est pas exposée, faire des incisions supplémentaires dans le thorax avec les ciseaux jusqu'à ce que la culture se révèle. Une fois que la récolte n’est visible, découper les parties restantes de l’insecte, laissant seulement le tube digestif avec la récolte dans le verre de montre (Figure 2).
   Remarque : La récolte de lépidoptères est presque transparent et cellophane-comme dans la nature, qui peut être difficile de reconnaître si ce n'est pas rempli de fluides et élargi ou si elle est coupée pendant la dissection.
6. Utilisez pointe fine pince de dissection pour placer la récolte sur une lamelle couvre-objet (24 x 24 mm) pour l’imagerie ultérieur (Figure 2).

4. détermination des nanoparticules ingérées

1. Position de la récolte sur la lamelle couvre-objet à l’aide de pinces de la dissection de la pointe fine soin afin d’éviter une rupture de la récolte. Utiliser le canal de CY3 (ou le contraste de phase) sur un microscope confocal inversé pour l’imagerie à un grossissement de 20 X. Images de la récolte immédiatement après dissection pour l’empêcher de se dessécher.
2. Maintenir une agitation magnétique bar (41,3 mm de longueur et 8 mm de diamètre) dans la main qui n’est pas dans le contrôle de la phase d’exploitation du microscope.

La barre magnétique remuer en arrière près de la récolte (environ 10 mm distance de récolte) des vagues afin que chaque va-et-vient motion prend environ une seconde (Figure 2).

Alors que la barre d’agitation magnétique est agitée, inspecter la récolte pour les nanoparticules. Déplacez lentement la phase d’exploitation en arrière tout en regardant à travers la lentille oculaire du microscope pour mouvement de nanoparticules à l’intérieur de la culture presque transparente. Si les nanoparticules sont présents dans la culture, ce qui indique une alimentation positive, ils réagiront et vague à l’unisson avec le magnétique remuer bar (Figure 2).

Résultats

L’étude des patrons en capacités d’absorption du liquide chez les insectes fluide exige la détermination de la quelle se nourrissent. Le protocole décrit ici est utilisé pour tester l’hypothèse de taille de pore limitant chez les lépidoptères et les diptères¹³. L’hypothèse de taille de pore limitant affirme qu’insectes liquide ne peut pas nourrir des pores remplis de liquide, si le diamètre de taille de pore est plus petit que le diamètre des ...

Discussion

Fonctionnalité de pièce buccale insectes historiquement est déduite à partir des études de morphologie générale (p. ex.., lépidoptères trompe fonctionnalités liées à une consommation de paille^25,26) ; Toutefois, des études récentes qui intègrent les données expérimentales ont donné lieu à un changement de paradigme dans notre compréhension de la complexité des pièces buccales insectes et structure-fonction des relations

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% sucrose solution	Domino Sugar		Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5493	10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
Single depression concave slide	AmScope	BS-C6	Slide is necessary for feeding stage setup
Filter paper	EMD Millipore	NY6004700 (60 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY4104700 (41 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY3004700 (30 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY2004700 (20 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY1104700 (11 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TCTP04700 (10 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TETP04700 (8 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TMTP04700 (5 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	RTTP04700 (1 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Iris microdissecting scissors	Carolina Biological Supply Company	623555	Scissors used for dissections
Insect pins (#1)	Bioquip Products	1208B1	Pins used during dissections and feeding trials
Extra-fine point dissecting forceps	Carolina Biological Supply Company	624684	Dissecting equipment
Leica M205 C Stereoscope	Leica Microsystems	M205 C	Stereoscope used for dissections
Inverted confocal microscope	Olympus	IX81	Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar	Fisherscientific	S68067	Magnet used to detect nanoparticles
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34155	Tissues used to secure insects during feeding trials
House fly (Musca domestica) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae	Carolina Biological Supply Company	144102	insects for experiments
Finnpipette F1	ThermoFisher Scientific	4641080N	micropipette for dispensing liquids
Finntip 250 pipette tips	ThermoFisher Scientific	9400250	micropipette tips
Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)	AmScope	CS-S24-100	coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope