A ingestão de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar as capacidades de absorção de fluido em insetos

Resumo

Alimentação de fluido insetos têm a capacidade de adquirir quantidades de líquidos de superfícies porosas. Este protocolo descreve um método para determinar diretamente a capacidade para insetos de ingerir líquidos de superfícies porosas, usando soluções de alimentação com nanopartículas fluorescentes, magnéticas.

Resumo

Alimentação de fluido insetos ingerem uma variedade de líquidos que estão presentes no ambiente, como piscinas, filmes, ou confinado em pequenos poros. Estudos de aquisição líquida exigem avaliar relações de estrutura e função de mouthpart; no entanto, os mecanismos de absorção de fluido são inferidos historicamente observações da arquitetura estrutural, às vezes acompanhada com evidências experimentais. Aqui, nós relatamos um novo método para avaliar as capacidades de absorção de fluido com borboletas (Lepidoptera) e moscas (Diptera) usando pequenas quantidades de líquidos. Insetos são alimentados com uma solução de sacarose 20% misturada com nanopartículas fluorescentes, magnéticas, de papéis de filtro de tamanhos de poros específicos. A colheita (estrutura interna usada para armazenar líquidos) é removida do inseto e colocada em um microscópio confocal. Um ímã é acenou pela cultura para determinar a presença de nanopartículas, que indicam se os insetos são capazes de ingerir líquidos. Esta metodologia é utilizada para revelar um mecanismo de alimentação generalizado (ação capilar e formação de ponte líquida) que é potencialmente compartilhado entre Lepidoptera e Diptera ao se alimentar de superfícies porosas. Além disso, este método pode ser usado para estudos de mecanismos entre uma variedade de alimentação de fluido de insetos, incluindo os importantes na transmissão da doença e biomimética e potencialmente outros estudos que envolvem condutas de micro ou nano porte de alimentação onde transporte líquido requer verificação.

Introdução

Muitos grupos de insetos possuem peças bucais (proboscises) adaptado para alimentando-se de líquidos, como néctar, fruta, a apodrecer do sap fluxos (por exemplo, Diptera¹, Lepidoptera², Hymenoptera³), xilema (Hemiptera⁴), lágrimas (Lepidoptera ⁵) e sangue (Phthiraptera⁶, Siphonaptera⁷, Diptera⁷, Hemiptera⁸, Lepidoptera,⁹). A capacidade de insetos que se alimentam de fluidos é relevante para a saúde do ecossistema (ex . polinização¹⁰), doença transmissão^4,11, biodiversification^2,12e estudos de evolução convergente,¹³. Apesar da grande variedade de fontes de alimento, um tema entre alguns insetos de alimentação de fluido é a capacidade de adquirir pequenas quantidades de fluidos, o que poderiam ser confinados a gotículas de micro ou nano-porte, filmes líquidos ou superfícies porosas.

Dada a extensa diversidade de insetos de alimentação de fluido (mais de 20% de todas as espécies animais^14,15) e sua capacidade de se alimentar de uma variedade de fontes de alimentos, compreendendo sua alimentação comportamentos e mecanismos de absorção de líquido é importante em muitos campos. Funcionalidade de insetos mouthpart, por exemplo, tem desempenhado um papel no desenvolvimento da tecnologia biomimetic, por exemplo, dispositivos microfluídicos que podem executar tarefas tais como a aquisição de pequenas quantidades de líquidos usando métodos semelhantes aos utilizados por insetos¹⁶. Um problema fundamental nos estudos dos mecanismos de absorção de fluidos, no entanto, é determinar não só como os insetos se alimentam de fluidos, mas evidências experimentais que suporta o mecanismo de aquisição. Usando apenas o comportamento (por exemplo, sondando com o narigudo^12,17) como um indicador para a alimentação é insuficiente, porque isso não confirma a captação bem sucedida de fluidos, nem fornecer um meio para determinar a rota que fluidos de viagem como passam através do inseto. Além disso, realizando experiências com pequenas quantidades de líquidos melhores representa cenários alimentação naturais, onde os fluidos são uma limitação recurso^2,12.

Raio-x da fase utilizou-se imagens de contraste da borboleta monarca (Danaus plexippus L.), para avaliar como as borboletas se alimentam de pequenas quantidades de líquidos de superfícies porosas¹². Borboletas-monarca use ação capilar através de espaços entre as projeções de cuticular (dorsal legulae) junto a tromba para trazer fluidos confinados a pequenos poros no canal alimentar. Os fluidos de entrada formam um filme sobre a parede do canal alimentar que cresce e entra em colapso em uma ponte de líquido pelo planalto instabilidade^12,18, que é então transportado para intestino a borboleta pela ação da bomba de sucção na cabeça. Embora a imagem de contraste de fase raio x é uma ferramenta ideal para a visualização fluxo do fluido dentro insetos^12,19,20,21, a técnica não é prontamente disponível e um mais conveniente método é necessário para uma rápida avaliação de habilidade de um inseto de fluidos de captação e ingeri-los.

Para determinar se o mecanismo de alimentação para d. plexippus aplica-se para outros lepidópteros e também para moscas (Diptera) (ambos os grupos que se alimentam de líquidos de superfícies porosas), Lehnert et al ¹³ aplicou uma técnica para avaliar a habilidade de um inseto para se alimentar de pequenas quantidades de líquidos de superfícies porosas, que é relatada em detalhes aqui. Embora o protocolo descrito aqui é para estudos que usam humedecidos e superfícies porosas, a metodologia pode ser alterada por outros estudos, tais como aqueles abordando mecanismos de alimentação de piscina. Além disso, as aplicações se estende a outros campos, incluindo tecnologia microfluídica e Bioinspirada.

Protocolo

1. insetos espécies, preparação de soluções e instalação de estação de alimentação

Nota: borboletas da couve (Pieris rapae L., Pieridae) são selecionados como as espécies de Lepidoptera representante porque eles têm sido usados em estudos anteriores de capacidades de absorção de líquido e mouthpart morfologia^22,23. Moscas domésticas (Musca domestica L., Muscidae) e moscas garrafa azul (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) são usadas porque são frequentemente observados alimentando-se de superfícies porosas¹³.

1. Ordem p. rapae como larvas de um fornecedor de inseto e traseira-los na artificial da dieta (veja a Tabela de materiais) até eles empupar e emergem como adultos em uma câmara ambiental conjunto de 23 ° C e um fotoperíodo de 18 L: 6. Ordem M. domestica e c. vomitoria como pupas e traseiro-los às mesmas condições ambientais que p. rapae. Não alimente borboletas adultas e moscas após eles emergem as pupas antes das experiências de alimentação.
2. Prepare uma solução de sacarose 20% (controle) e uma solução de nanopartículas de sacarose 20% para testar para a absorção de fluido. Preparar a solução de nanopartículas pela adição de nanopartículas magnéticas fluorescentes (óxido de ferro com revestimento ácido poliacrílico, aproximadamente 20 nm de diâmetro)²⁴ para uma solução de sacarose 20% (1 mg/mL dH₂O nanopartículas com 20% de sacarose solução 1:1). Preparar uma solução de 1x de salina tamponada fosfato (PBS) (10 x diluído a 1 x em dH₂O, pH 7,4), que é usado para as dissecções.
3. Configurar uma estação de alimentação que consiste de um manipulação manual com uma pinça e um estágio de alimentação separado (uma plataforma plana) (Figura 1). Coloque uma lâmina côncava na fase de alimentação e tem filtros de rede de nylon com diâmetros de tamanho de poro de 11, 20, 30, 41 ou 60 µm e membrana filtros com diâmetros de tamanho de poros de 1, 5, 8 ou 10 µm nas proximidades para os experimentos de alimentação.

2. protocolo de alimentação

1. Envoltório do inseto corpos, pernas e asas em um papel de tecido dobrado. Posicione o inseto para que apenas a cabeça e peças bucais são expostos. Coloque as asas do inseto entre duas lâminas de microscópio, que são mantidos juntos pelo grampo no manipulador para que o inseto está suspenso acima do palco de alimentação (Figura 1).
2. Administre uma gotícula de 30 µ l de solução de sacarose a 20% ou a solução de nanopartículas de sacarose 20% com uma micropipeta para o centro do slide côncavo. Coloque um único papel de filtro de um tamanho de poro específico para o slide côncavo para que o centro do filtro de papel está alinhado com a gota da solução de nanopartículas. O contato entre a gota e o papel de filtro resulta na solução se espalhando ao longo do papel de filtro, preenchendo os poros (Figura 1).
   Nota: O papel de filtro é colocado no topo da gota, ao invés do contrário, para minimizar a presença potencial de nanopartículas em cima do papel de filtro, onde os insetos se alimentam.
3. Posicione o inseto com o manipulador para que apenas as regiões distais do aparelho bucal podem entrar em contato com o papel de filtro molhado na fase de alimentação (Figura 1). Usar um pino de insetos para aumentar o aparelho bucal para o papel de filtro e permitir que o inseto se alimentar por 45 s.
4. Para minimizar a chance de insetos alimentando-se de filmes líquidos que podem estar presentes na superfície do filtro de papel, posicione o aparelho bucal para que eles estão em contato com uma parte do papel de filtro que está tocando a parte plana do slide (i. e. Não diretamente sobre a parte côncava da lâmina). Se o inseto não expressa um interesse na alimentação, o aparelho bucal pode ser realizado para o papel de filtro com o pino de insetos para a duração do tempo de alimentação.

3. as dissecções

1. Coloque a solução de PBS em um vidro de relógio de 50mm, para que haja a solução suficiente para cobrir o corpo do inseto. Coloque o vidro de relógio sob um inseto estereoscópio e posição dissecando o equipamento (micro Primavera dissecando a tesoura, pinos de inseto, dissecando a pinça de ponta fina) ao lado o estereoscópio.
2. Após a alimentação, retire o papel de tecido com o inseto e segure-o com as asas fechadas. Retire a cabeça, pernas e asas do inseto com a tesoura de dissecação micro primavera e colocar o inseto na solução de PBS no vidro de relógio (Figura 2).
3. Se necessário, anestesia insetos antes de dissecações. Use a pinça para segurar o inseto por cutícula próximo a região distal do abdômen. Com a mão dominante, use o micro de primavera dissecando uma tesoura para cortar a cutícula em uma direção anterior ao longo do lado lateral do abdômen, começando pela extremidade posterior, até que seja atingido o tórax. Tome especial cuidado para garantir que apenas a cutícula é cortada e que o canal alimentar dentro o inseto não está danificada (Figura 2).
4. Fazer cortes adicionais da cutícula com a dissecação tesoura para abrir o abdome para revelar o canal alimentar dentro (Figura 2). Remova a cutícula abdominal, gordura corporal e outras estruturas com a ajuda de pinos de inseto e realocá-los fora do vidro de relógio para posterior alienação, deixando apenas o tórax e o canal alimentar do vidro de relógio.
   Nota: A dissecação revelará a colheita, que é uma estrutura do sac-like (uma extensão do canal alimentar) localizada perto da junção do tórax e abdômen.
5. Se a colheita não é exposta, faça incisões adicionais até o tórax com a tesoura até que a colheita seja revelada. Uma vez que a cultura é visível, corte as restantes partes do inseto deixando apenas o canal alimentar com a colheita do vidro de relógio (Figura 2).
   Nota: A lavoura de lepidópteros é quase transparente e celofane-como na natureza, que pode ser difícil reconhecer se não for preenchido com fluidos e expandido ou se é cortado durante a dissecção.
6. Use dissecando pinças de ponta fina para colocar a cultura no sentido uma lamela (24 x 24 mm) para a imagem latente subsequente (Figura 2).

4. determinação de nanopartículas ingeridas

1. Posição da cultura no sentido da lamela com o uso de Pinças dissecação a ponta fina cuidado para evitar a ruptura da cultura. Use o canal CY3 (ou contraste de fase) em um microscópio confocal invertido para imaging na ampliação de 20 X. Imagem da cultura imediatamente após a dissecação, para evitar sequem.
2. Segure uma agitação magnética bar (41,3 mm de comprimento e 8 mm de diâmetro) da mão que não está no controle da fase operacional do microscópio.

Wave barra de agitação magnética e volta perto da colheita (aproximadamente uma distância de 10 mm da colheita) para que cada um trás e movimento leva aproximadamente um segundo (Figura 2).

Enquanto a barra de agitação magnética é acenou, inspecione a lavoura para as nanopartículas. Mova lentamente a fase operacional e para trás ao olhar através da lente ocular do microscópio para o movimento de nanopartículas dentro da cultura quase transparente. Se as nanopartículas estão presentes na safra, indicando alimentação positiva, eles vão responder e onda em uníssono com o magnético agitar barra (Figura 2).

Resultados

O estudo dos padrões nas capacidades de absorção de fluido entre insetos fluido-alimentação requer a determinação de quando a alimentação ocorre. O protocolo descrito aqui é usado para testar a hipótese de tamanho de poro limitante entre Lepidoptera e Diptera¹³. A hipótese de tamanho de poro limitante afirma que insetos alimentação de fluido não podem alimentar dos poros cheio de líquido, se o diâmetro do tamanho dos poros for menor que o diâmetro...

Discussão

Funcionalidade de insetos mouthpart historicamente inferida a partir de estudos de morfologia bruta (EG., funcionalidade de lepidópteros narigudo relacionadas com uma bebida de palha^25,26); no entanto, estudos recentes que incorporam a evidência experimental resultaram em uma mudança de paradigma em nossa compreensão das complexidades do insetos bucais e^{13 12,2,}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% sucrose solution	Domino Sugar		Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5493	10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
Single depression concave slide	AmScope	BS-C6	Slide is necessary for feeding stage setup
Filter paper	EMD Millipore	NY6004700 (60 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY4104700 (41 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY3004700 (30 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY2004700 (20 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	NY1104700 (11 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TCTP04700 (10 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TETP04700 (8 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	TMTP04700 (5 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Filter paper	EMD Millipore	RTTP04700 (1 µm)	Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
Iris microdissecting scissors	Carolina Biological Supply Company	623555	Scissors used for dissections
Insect pins (#1)	Bioquip Products	1208B1	Pins used during dissections and feeding trials
Extra-fine point dissecting forceps	Carolina Biological Supply Company	624684	Dissecting equipment
Leica M205 C Stereoscope	Leica Microsystems	M205 C	Stereoscope used for dissections
Inverted confocal microscope	Olympus	IX81	Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar	Fisherscientific	S68067	Magnet used to detect nanoparticles
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34155	Tissues used to secure insects during feeding trials
House fly (Musca domestica) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae	Mantisplace.com		insects for experiments
Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae	Carolina Biological Supply Company	144102	insects for experiments
Finnpipette F1	ThermoFisher Scientific	4641080N	micropipette for dispensing liquids
Finntip 250 pipette tips	ThermoFisher Scientific	9400250	micropipette tips
Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)	AmScope	CS-S24-100	coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope