JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sıvı besleme böcekler dakika miktarlarda sıvı gözenekli yüzeyler elde etmek için yeteneği var. Bu iletişim kuralı doğrudan sıvılar gözenekli yüzeyler Floresan, manyetik nano tanecikleri ile besleme çözümleri kullanarak yemek böcek için yetenek belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Özet

Sıvı besleme böcekler havuzları, Filmler, ortamda mevcut olan veya küçük gözenekleri için sınırlı sıvılar, çeşitli yemek. Sıvı Alım çalışmaları mouthpart yapısı ve fonksiyonu ilişkileri değerlendirme gerektirir; Ancak, sıvı alımını mekanizmaları tarihsel olarak yapısal mimarisi, deneysel kanıtlar ile bazen refakatsiz gözlemleri değişkenden. Burada, kelebekler (Lepidoptera) ve az miktarda sıvı kullanarak sinekler (Diptera) ile sıvı alımını yeteneklerini değerlendirmek için bir roman yöntemi raporu. Böcekler belirli gözenek boyutları filtre kağıtları üzerinden Floresan, manyetik nano tanecikleri ile karışık bir % 20 Sükroz çözüm ile beslenir. Kırpma (sıvılar depolamak için kullanılan iç yapısı) böcek kaldırılır ve üzerinde confocal mikroskop yer. Bir mıknatıs böcekler sıvıları yemek mümkün olup olmadığını gösteren nano tanecikleri, varlığını belirlemek için ürün tarafından el salladı. Bu yöntem, Lepidoptera ve solucanlar arasında gözenekli yüzeyler arasında beslenirken paylaşılan potansiyel bir yaygın besleme mekanizması (kılcal eylem ve sıvı köprü oluşumu) ortaya çıkarmak için kullanılır. Buna ek olarak, bu yöntem mekanizmaları arasında sıvı besleme böcekler önemli hastalık iletim ve Biyomimetik ve nano veya mikro ölçekli kanalları dahil olabilecek diğer çalışmalarda da dahil olmak üzere çeşitli beslenme çalışmaları için kullanılabilir nerede sıvı taşıma doğrulama gerektirir.

Giriş

Birçok böcek ağız (proboscises) gruplarınız sıvılar üzerinde beslenmesi için uyarlanmış, meyve, çürüyen nektar gibi su akar (örneğin Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), xylem (Hemiptera4), gözyaşları (Lepidoptera 5) ve kan (Phthiraptera6, sinek7, yani7, Hemiptera8, Lepidoptera9). Böcekler üzerinde sıvı besleme yeteneği ekosistem Sağlığı (örneğin tozlaşma10), hastalık iletim4,11, biodiversification2,12ve çalışmalar için uygundur yakınsak evrim13. Çeşitli gıda kaynaklarına rağmen bazı sıvı besleme böcekler arasında bir tema mikro veya nano boyutlu damlacıkları, sıvı Filmler veya gözenekli yüzeyler için sınırlı sıvı az miktarda elde etmek için yeteneğidir.

Böcekler (% 20 tüm hayvan türlerinin14,15) sıvı beslenme ve gıda kaynakları çeşitli üzerinde beslemek için yeteneklerini geniş çeşitliliği göz önüne alındığında, onların beslenme anlama davranışları ve sıvı alımını mekanizmaları çok alanda önemli. Böcek mouthpart işlevi, örneğin, biomimetic teknoloji, örneğin, küçük miktarlarda sıvı istihdam benzer yöntemlerle kazanılması gibi görevleri gerçekleştirebilirsiniz mikrosıvısal cihazlar gelişiminde bir rol oynamıştır böcekler tarafından16. Sıvı alımını mekanizmaları, ancak, çalışmalarda temel bir sorun sadece nasıl böcekler üzerinde sıvı besleme belirleme ama mekanizmasını destekler deneysel kanıt alınıyor. Sadece davranış kullanarak (örneğin, hortum12,17ile sondalama) beslenme için bir gösterge çünkü başarılı sıvı alımını onaylamak değil, ne de rota belirlemek için bir yol sağlamaz yetersiz olduğu gibi bu Onlar böcek geçerken sıvıları seyahat. Buna ek olarak, deneyler ile az miktarda sıvı daha iyi performans sıvı bir sınırlayıcı kaynak2,12nerede doğal beslenme senaryoları temsil eder.

Faz kontrast görüntüleme Monarch kelebek (Danaus plexippus L.) ile nasıl kelebekler gözenekli yüzeyler12den küçük miktarlarda sıvı besleme değerlendirmek için kullanılan x-ışını. Monarch kelebek için küçük gözenekleri yemek kanalı içine sınırlı sıvıları getirmek için hortum cuticular projeksiyonlar (dorsal legulae) arasında boşluk üzerinden kılcal eylemini kullanın. Gelen sıvı büyür ve sonra kelebeğin gut için eylem başından emme pompası tarafından taşınır Yaylası istikrarsızlık12,18tarafından sıvı bir köprü çöker gıda kanal duvarda bir film oluşturur. X-ışını faz kontrast görüntüleme böcekler12,19,20,21içinde sıvı akış görüntülenmesi için en uygun bir araç olsa da, teknik hazır değil ve daha kolay yöntemi hızlı alımı sıvıları yeteneği bir böceğin değerlendirilmesi için gerekli değildir ve onları yemek.

D. plexippus için besleme mekanizması diğer Lepidoptera ve sinekler (Diptera) (her iki grup sıvılar üzerinde gözenekli yüzeyler arasında besleme) için geçerli olup olmadığını belirlemek için anıldı vd. 13 burada ayrıntılı rapor gözenekli yüzeyler arasında küçük miktarlarda sıvı beslemeye bir böceğin yeteneği değerlendirmek için bir teknik uygulanır. Burada özetlenen protokolü kullanan çalışmalar ıslak ve gözenekli yüzeyler için olsa da, bu havuzu besleme mekanizmaları adresleme gibi diğer çalışmalar için yöntemler değiştirilebilir. Buna ek olarak, uygulamaları havacilik ve bioinspired teknolojisi de dahil olmak üzere diğer alanlarına genişletmek.

Protokol

1. böcek türleri, çözümleri ve istasyonu kurulumu besleme hazırlanması

Not: Bunlar sıvı alımını yetenekleri ve mouthpart Morfoloji22,23önceki çalışmalarda kullanılmıştır çünkü lahana kelebekler (Pieris rapae L., Pieridae) temsilcisi Lepidoptera tür olarak seçilir. Çünkü onlar sık sık gözenekli yüzeyler13tarihinde besleme gözlenir evi sinekler (sinek domestica L., Muscidae) ve mavi şişe sinekler (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) kullanılır.

  1. Sipariş P. rapae larva bir böcek tedarikçi ve arka YavruIar ve çevre odasında bir yetişkin olarak ortaya kadar üzerlerine yapay ( Tablo malzemelerigörmek) diyet olarak 23 ° C ve 18 L: 6D photoperiod için ayarlayın. Sipariş M. domestica ve C. vomitoria olarak pupa ve onları P. rapaeolarak aynı çevre koşulları, arka. Onlar önce besleme deneyler pupa ortaya sonra Yetişkin kelebekler ve sinekler yem yok.
  2. Bir % 20 Sükroz çözüm (kontrol) ve sıvı alımı için test etmek için % 20 Sükroz nanopartikül çözüm hazırlamak. Floresan manyetik nano tanecikleri ekleyerek nanopartikül çözüm hazırlamak (demir oksit polyacrylic asit kaplama, yaklaşık 20 nm çapında)24 -% 20 Sükroz çözüm (1 mg/mL dH2O nano tanecikleri ile % 20 sükroz Çözüm 1:1). Fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 x çözeltisi hazırlamak (10 x 1 x dH2O, pH 7.4 seyreltilmiş), hangi gruptakiler için kullanılır.
  3. Bir kelepçe ve ayrı bir beslenme sahne (düz platformu) el ile bir manipülatör oluşan bir beslenme merkezi kurmak (şekil 1). İçbükey bir slayt besleme sahnesinde yerini ve naylon net filtreleri gözenekleri boyutu çapı 1, 5, 8, 11, 20, 30, 41 veya 60 µm ve membran filtreleri gözenek boyutu çapı veya besleme deneyler için yakın 10 µm.

2. besleme protokolü

  1. Böceğin organları, bacaklar ve kanatları katlanmış bir kağıt mendil sarın. Sadece baş ve ağız maruz böcek konumlandırın. Böcek böcek besleme sahne (şekil 1) bekletilir hangi birlikte manipülatör üzerinde kelepçe tarafından tutulan iki slayda mikroskop, wings yerleştirin.
  2. % 20 Sükroz çözüm veya % 20 Sükroz nanopartikül çözüm bir micropipette ile 30 µL damlacık içbükey slayt merkezi için yönetmek. Filtre kağıdı ortasına nanopartikül çözüm damlacık ile hizalanır içbükey slayda belirli gözenek boyutu tek bir filtre kağıt yerleştirin. (Şekil 1) gözenekleri doldurarak filtre kağıdı yayılan çözüm damlacığı ve filtre kağıdı arasındaki temas sonuçlanır.
    Not: Filtre kağıdı nano tanecikleri nerede yem böcekler filtre kağıdı üzerine olası varlığı en aza indirmek için tam tersi, yerine damlacığı üstüne yerleştirilir.
  3. Ağız sadece distal bölgelerinde ıslak filtre kağıt besleme Sahne Alanı'nda (şekil 1) iletişim kurabilirsiniz manipülatör ile böcek konumlandırın. Ağız filtre kağıdı üzerine genişletmek ve böcek için 45 beslemek izin vermek için bir böcek PIN kullanmak s.
  4. Pozisyon ağız filtre kağıdı yüzeyinde mevcut olabilecek sıvı filmlerde besleme böcekler olasılığını en aza indirmek için böylece slayt (i.e. düz parçası dokunmadan filtre kağıdı, bir parçası ile temas doğrudan slayt içbükey parçası yukarıda). Böcek besleme bir ilgi ifade değil Eğer, ağız için filtre kağıdı böcek iğne ile besleme saat süresince tutulamaz.

3. diseksiyonlar

  1. Böylece böceğin beden karşılamak için yeterli bir çözüm PBS çözüm bir 50 mm izle cam yer. İzle cam ekipman (makas, böcek pimleri, para cezası nokta forseps anatomi anatomi bahar mikro) stereoscope yanında anatomi bir stereoscope ve pozisyon böcek altında yerleştirin.
  2. Besleme sonra böcek doku kağıt kaldır ve kanatları kapalı tutun. Baş, bacaklar ve böcek kanatları bahar mikro diseksiyon makası ile kaldırmak ve izle cam (Şekil 2) PBS çözümde böcek yer.
  3. Gerekirse, böcekler diseksiyonlarının önce anestezi. Forseps karın distal bölge yakınındaki kütikül tarafından böcek tutmak için kullanın. Dominant el ile manikür bir anterior yönde Toraks ulaşılana kadar arka sonunda başlayan karın yan tarafındaki kesmek için makas dissekan bahar mikro kullanın. Sadece manikür kesilir ve kurbanın kanal böcek içinde değil zarar (Şekil 2) sağlamak için özel dikkat.
  4. Kurbanın kanal (Şekil 2) içinde ortaya çıkarmak için karın açmak için diseksiyon makası ile manikür ek kesim yapmak. Böcek iğneler yardımı ile karın kütikül, yağ vücut ve diğer yapıları kaldırmak ve onları sadece göğüs ve kurbanın kanal izle cam bırakarak sonraki bertarafı için İzle cam dışında yerini değiştirin.
    Not: Göğüs ve karın dönemde bulunan bir kese benzeri yapı (kurbanın kanalı'nın bir uzantısı) kırpma, diseksiyon ortaya çıkaracaktır.
  5. Kırpma maruz kalmaz, ürün ortaya kadar Toraks içine ek kesiler makasla olun. Ürün görünür olduğunda, sadece kurbanın kanal izle cam (Şekil 2) kırpma bırakarak böcek kalan bölümlerini Kes gitsin.
    Not: Lepidoptera kırpma neredeyse şeffaf ve selofan benzeri bu değil sıvı ile dolu ve genişletilmiş Eğer tanımak zor olabilir doğa veya bu diseksiyon sırasında kesilir.
  6. İyi noktası forseps dissekan sonraki görüntüleme (Şekil 2) bir coverslip (24 x 24 mm) üzerine kırpma eklemenizi sağlar.

4. alınan nano tanecikleri tespiti

  1. Ürün üzerinde para cezası nokta diseksiyon forseps kullanarak coverslip bakım ürün parçalanma önlemek pozisyon. CY3 kanal (veya faz kontrast) bir ters confocal mikroskop düşsel vasıl 20 X büyütme için kullanın. Sonra hemen diseksiyon kurumasını önlemek için kırpma görüntü.
  2. Bar (41,3 mm uzunluğunda ve 8 mm çapında) manyetik bir heyecan mikroskop çalışma aşamasında kontrolünü kaybediyor elinde tut.
Böylece her ileri geri hareket yaklaşık bir saniye (Şekil 2) alır ve geriye kırpma (yaklaşık 10 mm mesafe kırpma) yanında manyetik heyecan bar el salla.
  • Manyetik heyecan bar el salladı iken, nano tanecikleri için ürün bakarak kontrol edin. Yavaş yavaş çalışma sahne nanopartikül hareketi içinde hemen hemen saydam kırpma için mikroskop oküler lens aracılığıyla bakarken ileri geri hareket. Nano tanecikleri ürün varsa, pozitif besleme, belirten onlar cevap verecektir ve hep bir ağızdan ile manyetik dalga çubuk (Şekil 2) ilave edin.

    • Sonuçlar

    Desen sıvı alımını yeteneklerine sıvı besleme böcekler arasında çalışma oluştuğunda besleme belirlenmesi gerekir. Burada özetlenen protokolü13Lepidoptera ve solucanlar arasında sınırlayıcı gözenek boyutu varsayımını sınamak için kullanılır. Sınırlayıcı gözenek boyutu hipotez gözenek boyutu çapı besleme kanallarını12çapı daha küçükse, sıvı besleme böcekler sıvı dolu gözenekleri yem olamaz devl...

    Tartışmalar

    Böcek mouthpart işlevselliği tarihsel olarak brüt Morfoloji çalışmalardan anlaşılmaktadır (örn., Lepidoptera hortum işlevi ilgili bir içme saman25,-26); Ancak, deneysel kanıt dahil son yıllarda yapılan çalışmalarda bir paradigma kayması böcek ağız ve yapı-fonksiyon ilişkileri2,12,13 karmaşıklığı anlayışımız içinde sonuçlandı ...

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (NSF) tarafından desteklenen hayır vermek. IOS 1354956. Dr Andrew D. Warren (Lepidoptera ve biyolojik çeşitlilik, Florida doğa tarihi Müzesi ', University of Florida merkezi McGuire) kelebek resimleri kullanmak için izin için teşekkür ederiz.

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    20% sucrose solutionDomino SugarSugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
    Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichP549310X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
    Single depression concave slideAmScopeBS-C6Slide is necessary for feeding stage setup
    Filter paperEMD MilliporeNY6004700 (60 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeNY4104700 (41 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeNY3004700 (30 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeNY2004700 (20 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeNY1104700 (11 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeTCTP04700 (10 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeTETP04700 (8 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeTMTP04700 (5 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paperEMD MilliporeRTTP04700 (1 µm)Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Iris microdissecting scissorsCarolina Biological Supply Company623555Scissors used for dissections
    Insect pins (#1)Bioquip Products1208B1Pins used during dissections and feeding trials
    Extra-fine point dissecting forcepsCarolina Biological Supply Company624684Dissecting equipment
    Leica M205 C StereoscopeLeica MicrosystemsM205 CStereoscope used for dissections
    Inverted confocal microscopeOlympusIX81Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
    Fisherbrand PTFE Disposable Stir BarFisherscientificS68067Magnet used to detect nanoparticles
    Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34155Tissues used to secure insects during feeding trials
    House fly (Musca domestica) pupaeMantisplace.cominsects for experiments
    Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupaeMantisplace.cominsects for experiments
    Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvaeCarolina Biological Supply Company144102insects for experiments
    Finnpipette F1 ThermoFisher Scientific4641080Nmicropipette for dispensing liquids
    Finntip 250 pipette tipsThermoFisher Scientific9400250micropipette tips
    Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)AmScopeCS-S24-100coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope

    Referanslar

    1. Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
    2. Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
    3. Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
    4. Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F., Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
    5. Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
    6. Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
    7. Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
    8. Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
    9. Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
    10. Barth, F. G. . Insects and flowers: the biology of a partnership. , (1991).
    11. Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
    12. Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
    13. Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
    14. Grimaldi, D., Engel, M. S. . Evolution of the insects. , (2005).
    15. Adler, P. H., Foottit, R. G. . Insect biodiversity: science and society. , (2009).
    16. Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
    17. Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
    18. Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , 207-285 (1863).
    19. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6 (2007).
    20. Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -. K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
    21. Lee, W. -. K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2 (2009).
    22. Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
    23. Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
    24. Yan, H., Sung, B., Kim, M. -. H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032 (2014).
    25. Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
    26. Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
    27. Tsai, C. -. C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
    28. Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    H cresel biyolojisay 130s v al mLepidopterapompaemme Dipteras v K pr shortum

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır