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Resumen

Aquí, presentamos una electroforesis en gel bidimensional (2DE) acoplada con espectrometría de masas (MS) para separar e identificar adenoma pituitario humano tejido proteoma, que presenta un patrón de 2DE buena y reproducible. Muchas proteínas se observan en cada punto de 2DE al analizar el proteoma del complejo del cáncer con el uso de MS de alta sensibilidad.

Resumen

Adenoma pituitario humano (PA) es un tumor común que se produce en la glándula pituitaria humana en los sistemas de eje hipotálamo-pituitaria-dirigido del órgano y puede ser clasificado como PA clínica funcional o no funcional (FPA y NFPA). NFPA es difícil para diagnóstico temprano de la etapa y la terapia debido a la elevación apenas de las hormonas en la sangre en comparación con el FPA. Nuestro objetivo a largo plazo es utilizar métodos de proteómica para descubrir biomarcadores fiables para aclaración de los mecanismos moleculares de la PA y el reconocimiento de marcadores eficaces de diagnóstico, pronósticos y dianas terapéuticas. Electroforesis en gel bidimensional efectiva (2DE) junto con métodos de espectrometría de masas (MS) fueron presentados aquí para analizar proteomas humanos de PA, incluyendo la preparación de muestras, electroforesis 2D, visualización de proteínas, análisis de imagen, en gel digestión de la tripsina, péptido masiva de huellas dactilares (PMF) y tándem masa espectrometría (MS/MS). 2-dimensional gel electroforesis láser asistida por matriz desorción/ionización espectrometría de PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS y MS/MS procedimientos de cromatografía de líquidos de 2DE (LC) se han aplicado con éxito en el análisis del proteoma de la NFPA. Con el uso de un espectrómetro de masas de alta sensibilidad, muchas proteínas se identificaron con el método de 2DE-LC-MS/MS en cada gel 2D en un análisis del complejo tejido de PA para maximizar la cobertura de proteoma humano de PA.

Introducción

PA es un tumor común que se produce en la glándula pituitaria humana en los sistemas de eje hipotálamo-pituitaria-dirigido del órgano, que desempeñan un papel importante en el sistema endocrino humano. PA incluye clínicamente funcionales y no funcionales PAs (FPA y NFPA)1,2. NFPA es difícil en terapia y diagnóstico temprano de la etapa debido a niveles de la hormona sólo ligeramente elevada (p. ej., LH y FSH) en sangre en comparación con el FPA, que se ha incrementado significativamente los niveles de hormonas correspondientes en sangre3,4 ,5. La clarificación de los mecanismos moleculares y el descubrimiento de biomarcadores eficaces tienen importante significado clínico en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la NFPA. Nuestro objetivo a largo plazo es desarrollar y utilizar métodos de proteómica para el estudio de NFPA para el descubrimiento de biomarcadores fiables para aclarar sus mecanismos moleculares y reconocer dianas terapéuticas eficaces así como marcadores diagnósticos y pronósticos. 2-DE junto con métodos de MS se han utilizado en nuestro programa de investigación a largo plazo humano PA proteoma1,2,6,7, incluido el establecimiento de referencia de proteoma los mapas3,8, análisis de proteínas expresadas diferencialmente los perfiles9,10,11,12,13, variantes de hormona14 ,15, modificaciones post-traduccionales como fosforilación14 y tirosina nitración16,17,18, la variación de Proteómica del invasor relativos al no invasiva NFPAs19y la heterogeneidad de Proteómica de NFPA subtipos13, que condujo al descubrimiento de múltiples redes de camino importante (disfunción mitocondrial, disregulación del ciclo celular, estrés oxidativo y señalización MAPK anormalidad del sistema) que se alteran en NFPA13,19,20.

2de separa las proteínas según su punto isoeléctrico (pI) (isoeléctrica, IEF) y peso molecular (a través de sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. se trata de una técnica de separación común y clásica en el campo de la proteómica, desde la introducción de los conceptos del proteoma y proteómica en 199524. MS es la técnica fundamental para la búsqueda de la identidad de proteínas separadas por 2DE, incluyendo estrategias de PMF y MS/MS. El muy rápido desarrollo de los instrumentos MS, especialmente en los aspectos de la sensibilidad de la detección y resolución en combinación con la mejora del sistema de LC, mejora en gran medida la identidad de las proteínas de baja o muy baja abundancia en un proteoma para maximizar la cobertura de un proteoma. También desafía los conceptos tradicionales que sólo uno o dos proteínas están presentes en un punto en el análisis del proteoma de tejido humano complejo de gel 2D y ofrece una oportunidad para identificar múltiples proteínas en un gel 2D en un análisis de tejido humano complejo proteoma y maximizar la cobertura de proteoma NFPA.

Aquí describimos protocolos detallados de 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS/MS y 2DE-LC-MS/MS que se han utilizado con éxito en el análisis del proteoma humano de NFPA. Los protocolos incluyen la preparación de muestras, la primera dimensión (isoeléctrica, IEF), segunda dimensión (SDS-PAGE), visualización de las proteínas (plata y tinción azul de Coomassie), análisis de gel 2D, digestión de la tripsina en gel, de imagen purificación de péptidos trípticos, PMF, MS/MS y abrasador3,8,25,26la base de datos. Por otra parte, este protocolo se traduce fácilmente para el análisis de otros proteomas de tejidos humanos.

Protocolo

El presente Protocolo sigue las pautas del Xiangya Hospital médica ética Comité de Central South University, China. Una gorra de la cabeza y guantes se deben usar durante todo el procedimiento experimental evitar la contaminación de la queratina de la piel y el cabello8.

1. preparación de muestras

  1. Recoger los tejidos PA (0,2 - 0,5 mg) del Departamento de Neurocirugía. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se transfieren a-80 ° C para el almacenamiento.
  2. Añadir 2 mL de 0.9% NaCl en agua destilada desionizada (ddH2O). Use esta solución para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido (3 x).
    Nota: ddH2O con una conductividad de MΩ/cm 18.2 se utiliza en el protocolo. Algunos de lo tissuemight se perderán cuando lavado de la sangre de la superficie del tejido.
  3. Añadir un volumen (10 mL; 4 ° C) de la solución ácido acético de 2 M y 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol para cada 0,5 - 0,6 g de tejido, homogeneizar (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10 x) con un homogenizador de tejidos, someter a ultrasonidos el homogeneizado por 20 s, liofilizar y conservarlo a −80 ° C.
  4. Medir el contenido proteínico de la liofilizada, kit de ensayo de muestras homogeneizadas utilizando ácido bicinchoninic (BCA).
    Nota: Cuantificación de BCA no es una cuantificación absoluta, y el resultado de medición se verá alterado con un técnico diferente y el agente experimental. Un estándar de la muestra de concentración fija puede usarse para diversos experimentos. Por lo tanto, se determinará la cantidad de carga final de proteínas para cada gel 2D con la imagen a buena resolución Coomassie lacado o plateado en los experimentos pre-diseñados.
    1. Añadir alrededor de 300 μg de la muestra homogeneizada liofilizadora a un volumen (μL 282) de extracción de proteína tampón (urea de 8 M y grietas del 4%), seguido de pie por 2 h, sonicando en un baño de agua durante 5 minutos, girando para 1 h, sonicando otra vez en el baño de agua durante 5 minutos , girar otra vez para 1 h y centrifugación a 15.000 x g por 20 min.
    2. Preparar soluciones estándar de BSA con concentraciones como se ha mencionado: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 μg/mL con el comercial estándar de BSA (2 mg/mL).
    3. Reactivo de mezcla BCA A y B (a: b = 50: 1) como solución de trabajo BCA antes de usarlo.
    4. Añadir 0,1 mL de la muestra o la solución a 2 mL de solución de trabajo de la BCA en un tubo de microcentrífuga, seguido por la mezcla y luego incubar a 37 ° C durante 30 minutos. Finalmente enfriar a temperatura ambiente durante 10 min y medida A562 nm valor D.E..
    5. Calcular la línea estándar de la linear (A562 nm vs concentración de BSA) para obtener una ecuación de regresión para el cálculo de la proteína de la muestra con un valor de562nm .
  5. Use 150 μg de la muestra liofilizada equivalente de proteína para la tinción de plata, o 500 μg de proteína de Coomassie de tinción, para un pH de tira (IPG) gradiente de pH inmovilizado 18 cm no lineal de 3-10 (NL).
    Nota: La tira seca de IPG es 0.5 mm espesor y 3 mm ancho, con longitudes entre 7, 11, 13, 18 y 24 cm y gamas de diferentes pH entre pH 4-5, 4-7, 6-9 y 3-10 en un gradiente de pH lineal o no lineal. El búfer IPG utilizado debe ajuste la tira27,28.
  6. 1.6.Add 250 μl de tampón de extracción (urea de 7 M, 2 M tiourea, grietas del 4% (p/v), 100 mM DTT (agregar antes de usar), 0.5% v/v pharmalyte (agregar antes de usar) y un rastro de azul de bromofenol).
  7. Mantener la solución por debajo de 30 ° C, seguido de Vortex por 5 min., sonicando durante 5 minutos y de rotación de 50 min.
  8. Agregar 110 μl de tampón de rehidratación (urea de 7 M, 2 M tiourea, grietas del 4% (w/v), 60 mM DTT (agregar antes de usar), tampón de IPG 0.5% v/v (agregar antes de usar) y un rastro de azul de bromofenol). Someter a ultrasonidos durante 5 minutos. Luego gire la muestra de 50 min, vortex durante 5 minutos y centrifugar durante 20 min a 15.000 x g.
  9. Recoger el sobrenadante (350 μL) como la proteína muestra solución8.

2. dos dimensiones del Gel electroforesis

  1. IEF (primera dimensión): realizar IEF en el sistema de enfoque isoeléctrico como se describe a continuación.
    1. Añadir 350 μl de la solución de la muestra de proteína en la ranura de un poseedor de tira IPG 18 cm.
    2. Poner un 18 cm IPG tira gel hacia abajo en la solución de la muestra de proteína (evitar las burbujas).
    3. Añadir 3-4 mL de aceite mineral para cubrir la tira IPG.
    4. Montar el soporte de la tira IPG en el systemwith enfoque isoeléctrico el extremo puntiagudo en la placa posterior (+) y el extremo cuadrado de la placa frontal (−).
    5. Rehidratar durante la noche (~ 18 h a temperatura ambiente).
    6. Configurar los parámetros IEF: máximo actual 30 μA por tira, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, paso y bodega; 1.000 V, gradiente de 1 h, 500 Vh, 8.000 V, gradiente de 1 h, 4.000 Vh, 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, paso y bodega; y 500 V, 0,5 h, 250 Vh, paso y sostenga. Que acumular un tiempo total de 7,5 h y 36.875 Vh.
    7. Después de IEF, saca cada tira IPG y saque el aceite mineral extra con una toalla de papel insoluble. Ahora Envuelva la tira en una hoja de envoltura de plástico y almacenar en −80 ° C.
      Nota: El titular de la IPGstrip debe limpiarse con el titular de IPGstrip solución de limpieza y agua destilada.
  2. SDS-PAGE (segunda dimensión): realizar SDS-PAGE en un sistema de electroforesis Vertical de la célula
    Nota: Cada tamaño del gel de SDS-PAGE debe ser 255 x 190 x 1 mm.
    1. Utilizar un multi-gel echador a 12% resolución de geles de la página. Casting 12% geles de página, realice los pasos siguientes.
      1. Añadir 270 mL de ddH2O, 150 mL de 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 180 mL de solución stock de acrilamida/bisacrilamida 40% (p/v) (29: 1, 40% w/v acrilamida y 1.38% w/v N, N'-Metilenbisacrilamida), 3 mL de persulfato de amonio 10% y 150 μL de TEMED a hacer el gel solución en un vaso de precipitados. Mezclar suavemente y evitar burbujas.
      2. Vierta la solución en gel suavemente la cámara multidifusión hasta la altura de gel esperada (19 cm).
      3. Añadir unos 3 mL ddH2O en cada gel de resolución para cubrir los geles. Deje que el gel polimerice durante 1 h aproximadamente.
    2. Preparar 20 L de tampón de electroforesis (25 mM Tris glicerina de 192 mM y 0.1% SDS). Llene el tanque del almacenador intermediario unidad electroforesis separación con este tampón.
    3. Sacar las tiras IPG centradas del congelador y equilibre las tiras durante 10 min, meciendo suavemente en 4 mL de tampón de equilibrio (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), urea de 6 M, 2% (p/v) de SDS, 20% (v/v) de glicerol, 2% w/v TDT (agregar antes de usar) de reducir y un rastro de azul de bromofenol).
    4. Equilibre durante 10 min, meciendo suavemente las tiras IPG reducidas en 4 mL del tampón de equilibrio alquilación (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), urea de 6 M, 2% (p/v) de SDS, 20% (v/v) de glicerol, 2.5% w/v Yodoacetamida (agregar antes de usar) y un rastro de azul de bromofenol).
    5. Gel de equilibrio, desmontar la cámara de multidifusión y saque el cartucho de gel de resolución preparados. Lavar 3 x con ddH2o quitar exceso ddH2O con una toalla de papel insolubles y poner en un bipedestador de gel.
    6. Enjuague las tiras IPG equilibradas con el tampón de electroforesis y eliminar exceso de líquido en la superficie de la tira IPG con la toalla de papel insoluble.
    7. Una tira IPG en el resolución gel de SDS-PAGE y laterales de plástico de la tira IPG póngase en contacto con la placa de vidrio más largo y la punta hacia la izquierda.
    8. Verter 3-4 mL de caliente agarosa al 1% en buffer de electroforesis de SDS (~ 80 ° C) rápidamente para sellar la tira IPG en la parte superior de cada gel de SDS-PAGE y poner la parte de arriba de IPG hasta la parte superior de la placa más corta sin burbujas y luego polimerizar durante 10 minutos.
    9. Inserte el cartucho de gel montado verticalmente entre juntas de plástico en el sistema de electroforesis vertical. Poner la parte superior del gel con la tira IPG al lado del cátodo (−).
    10. Ajustar el nivel de buffer de electroforesis, sumerja el cartucho de gel.
    11. Conectar y configurar a la unidad de Control de la fuente de energía en modo de voltaje constante y corren 200 V para unos 370 minutos vigilando el tinte.
    12. Después de funcionar, sacar el cartucho de gel del sistema de electroforesis y retirar suavemente el gel del cassette de gel, evitando rasgar el gel, seguido de tinción de proteínas separadas por 2DE.
  3. Tinción de proteínas separadas por 2DE
    1. Tinción de plata
      1. Transferir suavemente el gel con las dos manos en una bandeja que contenga 250 mL de solución de fijación (metanol 50% (v/v) y ácido acético al 5% (v/v)) y agite suavemente el gel durante 20 minutos.
      2. Deseche la solución y añadir 250 mL de metanol al 50% (v/v) en la bandeja y agite suavemente durante 10 minutos.
      3. Descarte de metanol y agregar 250 mL de ddH2O en la bandeja. Agitar suavemente durante 10 minutos.
      4. Suavemente agite el gel durante 1 minuto en 250 mL de tampón de sensibilización que contiene tiosulfato de sodio 0,02% (p/v) y deseche el líquido.
      5. Agitar suavemente el gel de 250 mL de ddH2O por 1 min (repetir una vez más). Deseche el líquido después de cada paso.
      6. Sacuda suavemente el gel por 20 min en la solución de reacción de 250 mL de plata (nitrato de plata 0.1% (p/v) con 200 formaldehído al 37% (v/v) μl añadido antes de su uso).
      7. Agitar suavemente el gel de 250 mL de ddH2O por 1 min (repetir una vez más). Deseche el líquido después de cada paso.
      8. Agite el gel suavemente en 250 mL de solución de desarrollo (carbonato de sodio 3% (p/v) con formaldehído al 37% (v/v) μl 100 añadido antes de su uso) hasta obtener la intensidad deseada de la coloración (normalmente 1-3 min), luego elimine el líquido.
      9. Suavemente agite el gel durante 10 minutos en 250 mL de solución (ácido acético al 5% (v/v)) de detener y deseche el líquido.
      10. Suavemente agite por 5 min en 250 mL de ddH2O y deseche el líquido.
      11. Mantener el gel 250 mL almacenar solución de glicerol al 8.8% a 4 ° C.
    2. Coloración azul brillante de Coomassie
      1. Preparar solución de tinción disolviendo Coomassie brillante de Coomassie blue G250 0,3 g, sulfato de amonio 25 g y ácido fosfórico 25 mL en ddH2O y hasta un volumen total de 200 mL. Antes de su uso, agregar metanol 50 mL.
      2. Añadir 250 mL de Coomassie solución el gel de la coloración y agitar suavemente a temperatura ambiente hasta borrar manchas de proteínas (~ 2-4 h). Elimine el líquido.
      3. Añadir 250 mL de ddH2O y agitar lentamente durante 5 minutos, luego dos veces más. Elimine el líquido.
      4. Añadir 250 mL de solución de extracción (20% (v/v) de etanol) y agitar lentamente hasta que el color de fondo ser casi incoloro y elimine el líquido.
      5. Cambie la solución fresca de extracción cuando el viejo se está oscureciendo y deseche el líquido.
      6. Añadir 250 mL de ddH2O y agitar lentamente durante 5 minutos, desechar el líquido.
      7. Añadir 250 mL de solución (8,8% glicerol) de almacenar y guardar a 4 ° C.
  4. Análisis de imagen de electroforesis gel bidimensional
    1. Digitalizar los geles teñidos con un escáner plano.
    2. La imagen de entrada en el sistema de análisis de imagen de gel 2D.
    3. Detectar y cuantificar cada punto usando un software de análisis de imagen de gel 2D según protocolo del fabricante.
    4. Coincidir con los puntos entre distintos geles.

3. identificación de las proteínas separadas de 2DE con MS

  1. Preparación de mezcla de péptidos trípticos
    Nota: Puntas de pipeta y tubos siliconados o de baja retención puede usarse para evitar cualquier pérdida de proteínas o péptidos.
    1. Extracción de gel plata
      1. Suprimir el gel manchas en un 1,5 mL siliconado del tubo y lávela en 500 μl ddH2O 6 veces.
      2. Poner el gel de lavado en un tubo nuevo de 1,5 mL siliconado y pique en muchos pedazos pequeños (0.5-1 mm3).
      3. Desmanchar las piezas de gel en 20 μl de la solución de extracción que mezcla una parte de Ferricianuro de potasio de 30 mM y una parte de tiosulfato de sodio 100 mM (1:1) antes de utilizar dejar que el color marrón desaparecen (comúnmente 1-2 min). Elimine el líquido.
      4. Lave las piezas de gel con 20 μl de ddH2O 5 - 6 veces para dejar que el color amarillo desaparezca. Deseche el líquido después de cada paso.
      5. Añadir 20 μl 200 mM de bicarbonato de amonio para las piezas de gel y permanecer por 20 minutos lavar las piezas de gel con ddH2O (20 μl, 1 vez). Elimine el líquido.
      6. Deshidrate las piezas de gel con 30 μl de acetonitrilo al menos dos veces para dejar que las piezas de gel gire un blanco opaco y centrífuga de vacío seco durante 30 minutos.
    2. Extracción de gel azul brillante de Coomassie
      1. Corte puntos de gel en un tubo de 1,5 mL siliconado y lavar con 500 μl de ddH2O por lo menos 3 veces.
      2. Poner el gel de lavado en un tubo siliconado nuevo de 1,5 mL y pique en varios pedazos (0.5-1 mm3) con una punta de pipeta.
      3. Desteñir el gel en 50-100 μl extracción solución (1:1 v/v mix 200 mM NH4HCO3 con acetonitrilo) según el volumen de gel, incubar a 37 ° C en un baño de agua. Repetir y agregar solución de extracción fresca hasta que el color desaparezca (~ 1 h). Deseche el líquido después de cada paso.
      4. Lave las piezas de gel una vez con 20 μl de ddH2O.
      5. Deshidrate las piezas de gel de 100 μl acetonitrilo (por lo menos dos veces) para dejar las piezas de gel vuelta opaco blanco.
      6. Aspiradora seco durante 30 minutos.
    3. Digestión de la tripsina en el gel de las proteínas en las piezas de gel seco
      1. Disolver 20 μg (833 pmol) de polvo de la tripsina liofilizada en 100 μl de ácido acético de 50 mM.
      2. Diluir 20 μl de solución de tripsina (200 ng/μL) a 16 ng/μl con 230 μl 50 mM de bicarbonato de amonio.
      3. Agregar 20-30 μl (0.48 0.32 μg) de la solución de tripsina diluido a cada tubo que contiene gel seco de pedazos. Incubar durante 18-20 h a 37 ° C en baño de agua. Deje la solución reposar a 4 ° C durante 30 minutos.
      4. Centrifugue la solución suavemente durante 10 s. someter a ultrasonido en un baño de agua durante 5-6 minutos a 30 ° C y luego centrifugar a 12.000 x g durante 2 minutos.
      5. Recoger el sobrenadante que contiene la mezcla de péptidos trípticos en un tubo de siliconado de 0,5 mL.
    4. Purificación de mezcla de péptidos trípticos con microcolumna de C18.
      1. Lavar cada columna C18 con acetonitrilo (10 μl, 5 veces) y luego con 50% acetonitrilo (10 μl, 5 veces).
      2. Equilibrar con 0.1% trifluoro acético (TFA) (10 μl, 5 veces).
      3. Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo por la columna C18 preparada por 15 veces.
      4. Lavar la muestra 2 x con 10 μl 0.1% TFA.
        Nota: Los péptidos trípticos purificados son retenidos en la columna de C18.
      5. Añadir un volumen (6 μl) de solución (85% acetonitrile/0.1% de v/v v/v ácido fórmico) en un tubo siliconado limpio 0.5 mL, pipeta esta solución suavemente y lentamente hacia arriba y hacia abajo a través de cuentas de péptido-C18 x 10 lavar los péptidos de enlace en la solución, secar al aire y tienda (−20 ° C) para el análisis de MS.
  2. Análisis por MS
    1. Análisis de PMF de MALDI-MS
      1. Añadir 4 μL de 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA para disolver la mezcla de péptidos trípticos purificada. Carga 2 μl disueltas péptido tríptico mezcla sobre una placa MALDI e inmediatamente añadir 2 μl de solución de ácido а-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) que contiene 10 g/L de 500 mL/L acetonitrilo 1 mL/L TFA, luego deje secar al aire.
      2. Cargue la placa MALDI con mezcla de péptidos trípticos en un espectrómetro de masas MALDI-MS.
        Nota: Los parámetros del instrumento se definen como modo de reflector con 20 kV acelerando 160 ns retraso de extracción, voltaje y polaridad positiva. Cada espectro de MS se adquiere con 200 disparos de láser con un rango de 1.000 a 4.000 de m/z después de la calibración externa con el péptido estándar masa.
      3. Utilizar un software de procesamiento de espectro de MS para procesar cada espectro de MS, incluyendo corrección de línea base, eliminación de ruido (5%) y pico deisotoping.
      4. Corregir la lista masiva de cada espectro de MS con la eliminación de las masas contaminantes de tripsina, matriz, queratinas y otros contaminantes desconocidos en el paralelo de los experimentos de gel blanco.
      5. Entrada la Masa corregida la lista en una PMF-proteína buscando software para identificar proteínas en la base de datos de proteínas Swiss-Prot con los siguientes parámetros de búsqueda, incluyendo el tipo de búsqueda PMF, humano, escote de tripsina con 1 máximo perdido, fijo carbamidomethyl cisteína, metionina variable oxidación, monoisotopic, tolerancia de masa de péptido 50 ppm, carga de péptido del estado (1 +) y de señal a ruido (S/N) 5.0.
      6. Identificar proteínas con puntuaciones estadísticamente significativas de la proteína, y donde la proteína =-10 × log(p), donde p es la probabilidad de que la coincidencia observada es un evento al azar.
    2. Análisis por MALDI-MS/MS
      1. Añadir 4 μL del 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA para disolver la mezcla de péptidos trípticos purificada. Cada mezcla purificada péptido tríptico (0,5 μl) fue descubierto en una MALDI-placa de 384 pozos, vio inmediatamente 0,5 μl de matriz saturada de CHCA en 50% acetonitrile/0.1% TFA en la parte superior de la muestra de péptido y luego secado en el aire.
      2. Que el MALDI-TOF-TOF MS/MS para ser gestionados automáticamente, utilizando 100 disparos de láser para la adquisición de un espectro MS1, y acumular 6 había repetido MS1 espectros en un espectro sintético de MS1.
      3. Situado a 4 iones precursores más intensa de cada espectro MS1 sintético para el análisis por MS/MS. Uso laser 100 tiros para cada ion precursor adquirir un espectro MS/MS y acumular 4 repiten espectros MS/MS en un espectro de MS/MS sintético.
      4. Utilice los datos sintéticos de la MS/MS para buscar proteínas a través de una proteína basada en MS/MS que buscar software con parámetros incluyendo MS/MS Ion búsqueda, base de datos humana de Swiss-Prot, tripsina con un máximo de 1 frustrada escote, carbamidomethyl fijo (C), variable Oxidación (M), valor masa monoisotopic, péptido masa tolerancia ± 100 ppm y fragmento de masa tolerancia ± 0,7 Da.
      5. Identificar una proteína con una probabilidad estadísticamente significativa basada en Mowse score y la puntuación de iones = -10 x Log(P), donde p es la probabilidad de que la coincidencia observada es un evento al azar.
    3. Análisis LC-ESI-MS/MS
      1. Añadir 6 μl de 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v de ácido fórmico para disolver la mezcla de péptidos trípticos purificada.
      2. Uso de un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplado en línea con una ionización por electrospray (ESI)-MS/MS masa espectrómetro con un software de gestión de datos adquiridos de MS/MS para administrar toda la operación.
      3. Utilice la columna de la trampa de C18 (300 μm i.d. x 5 mm de longitud) y columna C18 de fase reversa (75 μm i.d. x 15 cm de longitud) con un gradiente de separación en el 98% de disolvente A (0,1% ácido fórmico) y 2% de disolvente B (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo 100%) durante 2 min. , el 2% a 40% solvente B 45 min, 40% a 95% solvente B durante 5 minutos y 95% solvente B durante 10 minutos (un total de 65 min a 300 nL/min).
      4. Establecer de modo positivo-ion y dependientes de datos encuesta automática adquirir espectros MS y MS/MS, y disociación colisión-inducida (CID) para fragmentación de iones.
      5. Establezca cada escaneo de la MS a una gama masiva de m/z 350 1.800 con resolución de 100.000 en m/z 400. Realizar el análisis para los 7 iones más intensa en la exploración de MS.
      6. Uso MS/MS-proteína buscar software que para buscar la base de datos para la identificación de proteínas.
        1. Seleccione la base de datos de la proteína humana.
        2. Seleccione tripsina con uno sitio hendidura perdidas permitido.
        3. Establecer tolerancia péptido (±10 ppm), fragmento de la tolerancia de ion (±0.8 Da), péptido carbamidomethylation de carga (2 +, 3 + y 4 +), fija en cisteína y oxidación variable en metionina.
        4. Establecer tasas de falsa del descubrimiento (FDR) < 1% y sólo péptidos con rango 1 se aceptan.
        5. Identificar la proteína con PSM≥1 (PSMs: el número total de secuencias de péptidos identificados (PSMs) para la proteína, incluyendo aquellas que estén identificadas de forma redundante) y al menos dos péptidos únicos por proteína.
      7. También, utilice MS/MS-software basado en proteína buscando II buscar la base de datos para la identificación de proteínas.
        1. Convertir el archivo de MS crudo a un archivo de .mgf.
        2. Selecciona la base de datos de proteínas humanas (uniprothuman_20161031.fasta que contiene 70940 secuencias y 23897047 residuos).
        3. Seleccione la digestión de la tripsina con un máximo de 2 divisiones perdidas.
        4. Conjunto fijada carbamidomethyl (C), deamidated variable (NQ) y oxidación (M), masa 10 ppm, tolerancia de masa de ion de hija 0.8 de la tolerancia del ion precursor Da y pico monoisotopic.
        5. Identificar las proteínas con un umbral de significación de 0,05 y por lo menos 2 péptidos únicos.

Resultados

1. 2DE MALDI MS PMF: con el procedimiento experimental descrito anteriormente, se extrajeron un total de 150 μg proteínas de tejidos expresan FSH NFPA (mujer, 50 años de edad, las hormonas ADRENOCORTICOTRÓFICAS (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) y TSH (-)) y vestida con un 18 cm La tira IPG (pH 3-10 NL) y un gel de SDS-PAGE de gran formato, entonces visualizado con tinción de plata. Se obtuvo un patrón de gel 2DE reproducibles y buena de NFPA tej...

Discusión

2de, juntada con MS métodos incluyendo 2DE MS PMF y 2DE-MS/MS, se ha utilizado con éxito en nuestro programa a largo plazo - el uso de la proteómica al estudio humano NFPA proteómicos variaciones y las variaciones de la red molecular para la elucidación de mecanismos moleculares y descubrimiento de biomarcadores eficaces para NFPAs. Proteómica comparativa basada en 2de con buena reproducibilidad desempeña un papel importante en la identificación de NFPA proteómicos variaciones9,

Divulgaciones

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 81572278 y 81272798 a XZ), las subvenciones del proyecto de Plan "863" de China (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), los fondos del Hospital de Xiangya de talento introducción (XZ) y el Hunan Fundación Provincial de Ciencias naturales de China (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Los autores también reconocen la contribución científica de Dr. Dominic M. Desiderio en el Health Science Center de la Universidad de Tennessee. X.Z. continuamente desarrollado utiliza métodos 2DE-MS para analizar el proteoma del adenoma pituitario a partir de 2001, concibió el concepto para el presente manuscrito, escribió y revisó el manuscrito, coordinó el trabajo pertinente y fue responsable de la apoyo financiero y trabajo correspondiente. Y.L. participó en la revisión del manuscrito. Y.H participó en la colección de referencias y la revisión del manuscrito. Todos los autores aprobaron el manuscrito final.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareisoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAThe vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHigh performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Insoluble paper towel
WatterMade by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizerBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gel image analysis software
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrum-processing software
Mascot softwarePMF-based protein searching software  
Mascot softwareMS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fastaHuman protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02) MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

Referencias

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