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Résumé

Nous présentons ici une électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée à la spectrométrie de masse (MS) pour séparer et identifier le protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine, qui présente un motif de 2DE bon et reproductible. Plusieurs protéines sont observées dans chaque endroit de 2DE lors de l’analyse complexe cancer proteome avec l’utilisation de MS de haute sensibilité.

Résumé

Adénome hypophysaire humaine (PA) est une tumeur commune qui se produit dans l’hypophyse humaine dans les systèmes d’axes orgue hypothalamus-pituitaire-ciblées et peut-être être classifiée comme PA soit cliniquement fonctionnel ou non fonctionnel (FPA et NFPA). NFPA est difficile pour le diagnostic de stade précoce et le traitement en raison de l’élévation à peine les hormones dans le sang par rapport à la FPA. Notre objectif à long terme consiste à utiliser des méthodes de la protéomique pour découvrir des biomarqueurs fiables de clarification des mécanismes moléculaires de la PA et reconnu efficaces marqueurs diagnostiques, pronostiques et cibles thérapeutiques. Efficace électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse (MS) ont été présentés ici pour analyser des protéomes PA humains, y compris la préparation d’échantillons, électrophorèse 2D, visualisation de protéines, analyse d’image, en gel la digestion trypsique, empreinte digitale masse de peptide (CMR) et tandem de masse spectrométrie (MS/MS). 2-dimensional gel électrophorèse laser assistée par matrice désorption-ionisation spectrométrie de masse PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS et MS/MS des chromatographie en 2DE (LC) procédures ont été appliquées avec succès dans une analyse du protéome de la NFPA. Avec l’utilisation d’un spectromètre de masse de haute sensibilité, plusieurs protéines ont été identifiés avec la méthode 2DE-LC-MS/MS dans chaque endroit dans une analyse du tissu complexe de PA pour maximiser la couverture de la human proteome PA de gel 2D.

Introduction

PA est une tumeur commune qui se produit dans l’hypophyse humaine dans les systèmes d’axe hypothalamus-pituitaire-ciblées orgue, qui jouent un rôle important dans le système endocrinien humain. PA comprend cliniquement fonctionnelles et non fonctionnelles PAs (FPA et NFPA)1,2. NFPA est difficile dans le diagnostic de stade précoce et le traitement en raison de niveaux d’hormones seulement légèrement élevé (p. ex., LH et FSH) dans le sang par rapport à la FPA, qui a considérablement augmenté les niveaux d’hormones correspondantes dans sang3,4 ,,5. La clarification des mécanismes moléculaires et la découverte de biomarqueurs efficaces a une importance clinique dans le diagnostic, traitement et pronostic de la NFPA. Notre objectif à long terme est de développer et utiliser des méthodes protéomiques pour étudier NFPA pour la découverte de biomarqueurs fiables pour clarifier ses mécanismes moléculaires et reconnaître des cibles thérapeutiques efficaces ainsi que des marqueurs diagnostiques et pronostiques. 2-DE couplée avec des méthodes de MS ont été largement utilisés dans notre programme de recherche à long terme au sujet humain PA proteome1,2,6,7, y compris établissement de référence du protéome cartes3,8, analyse de protéines différentiellement exprimés profils9,10,11,12,13, variantes de l’hormone14 ,15, modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation14 et la tyrosine nitration16,17,18, la variation de la protéomique des envahissantes relatif à non invasive NFPAs19et l’hétérogénéité de la protéomique de la NFPA sous-types13, qui a conduit à la découverte des multiples réseaux voie importante (dysfonctionnement mitochondrial, dérèglement du cycle cellulaire, stress oxydatif et signalisation MAPK anomalie du système) qui sont altérées dans NFPA13,19,20.

2de sépare les protéines selon leur point isoélectrique (pI) (focalisation isoélectrique, IEF) et leur poids moléculaire (via sodium dodecyl sulfate polyacrylamide électrophorèse sur gel, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. il s’agit d’une technique de séparation classique et communes dans le domaine de la protéomique, depuis l’introduction des concepts du protéome et protéomique en 1995,24. MS est la technique indispensable pour découvrir l’identité des protéines séparées 2DE, y compris les stratégies FMP et MS/MS. Le développement très rapide des instruments MS, surtout dans les aspects de la sensibilité de détection et de résolution, en combinaison avec l’amélioration du système de LC, qui améliore grandement l’identité des protéines de faible ou très faible abondance dans un proteome pour maximiser la couverture d’un proteome. Il conteste également nos concepts traditionnels qu’une seule ou deux protéines sont présents dans un gel 2D dans une analyse du protéome complexe de tissus humains et offre la possibilité d’identifier plusieurs protéines dans un gel 2D spot dans l’analyse des tissus humains complexes protéome et maximiser la couverture NFPA proteome.

Nous décrivons ici les protocoles détaillés de 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS/MS et 2DE-LC-MS/MS, qui ont été utilisées avec succès dans l’analyse du protéome humain de NFPA. Les protocoles comprennent la préparation des échantillons, tout d’abord de dimension (focalisation isoélectrique, IEF), deuxième dimension (SDS-PAGE), visualisation de protéines (coloration à l’argent et la coloration bleu de Coomassie), analyse de gel 2D, la digestion trypsique de dans-gel, d’image purification de peptides tryptiques, CMR, MS/MS et base de données, saisir3,8,25,26. De plus, ce protocole traduit facilement pour l’analyse des autres protéomes de tissus humains.

Protocole

Le présent protocole conforme aux lignes directrices du Xiangya hôpital médical éthique Comité de l’Université centrale du Sud, Chine. Une coiffe de tête et les gants doivent être portés pour l’ensemble de la procédure expérimentale éviter la contamination de la kératine de la peau et les cheveux8.

1. préparation des échantillons

  1. Recueillir des tissus PA (0,2 - 0,5 mg) auprès du service de neurochirurgie. Congeler immédiatement dans l’azote liquide et ensuite transférer à-80 ° C pour le stockage.
  2. Ajouter 2 mL de 0,9 % NaCl dans l’eau distillée désionisée (ddH2O). Cette solution permet de laver légèrement le sang de la surface du tissu (3 x).
    Remarque : FD2O avec une conductivité de 18,2 MΩ/cm est utilisé dans le protocole. Certains de la tissuemight être perdues lors du lavage de sang de la surface d’un tissu.
  3. Ajouter un volume (10 mL ; 4 ° C) de la solution d’acide acétique de 2 M et 0,1 % (v/v) β-mercaptoéthanol pour chaque 0,5 - 0,6 g de tissus, homogénéiser (1 min, 13 000 tr/min, 4 ° C, x 10) avec un homogénéisateur de tissu, laisser agir l’homogénat pour 20 s, lyophiliser et stocker à −80 ° C.
  4. Mesurer la teneur en protéines de la lyophilisées, trousse de dosage échantillons homogénéisés à l’aide de l’acide bicinchoninic (BCA).
    Remarque : Quantification de la BCA n’est pas une quantification absolue, et le résultat de mesure est modifié avec un autre technicien et l’agent expérimental. Une norme d’échantillon concentration fixe devrait être utilisée pour différentes expériences. Par conséquent, la quantité de chargement final de protéines pour chaque gel 2D sera déterminée avec l’image de bonne résolution colorés à l’argent ou teinté bleu de Coomassie dans les expériences pré-conçus.
    1. Ajouter environ 300 µg de l’échantillon homogénéisé lyophilisé à un seul volume (282 µL) d’extraction de protéine tampon (8 M urée et CHAPS de 4 %), suivie de debout pendant 2 h, sonification dans un bain d’eau pendant 5 min, en tournant pendant 1 h, sonification à nouveau dans le bain d’eau pendant 5 min , tourner à nouveau pendant 1 h et centrifugation à 15 000 x g pendant 20 min.
    2. Préparer des solutions étalons de BSA avec concentrations comme indiqué : 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1 500, 2 000 µg/mL avec la norme commerciale de BSA (2 mg/mL).
    3. Réactif de Mix BCA A et B (a : b = 50 : 1) comme la solution de travail BCA, avant de les utiliser.
    4. Ajouter 0,1 mL de l’échantillon ou la solution étalon à 2 mL de solution de travail BCA dans un tube à centrifuger, suivie de mélange et puis en incubation à 37 ° C pendant 30 min. Enfin, laisser refroidir à température ambiante pendant 10 min et mesure A562 nm O.D. valeur.
    5. Calculer la ligne linéaire standard (A562 nm vs concentration BSA) pour obtenir une équation de régression pour calculer la teneur d’une valeur de562nm en protéines échantillon.
  5. Utilisez 150 µg de l’échantillon lyophilisé équivalent de protéine pour la coloration à l’argent, ou 500 µg de protéines pour Coomassie coloration, pour un pH de bande 18 cm immobilisé pH gradient (IPG) 3-10 non linéaire (NL).
    Remarque : La bande sec IPG est 0,5 mm de large épaisseur et de 3 mm, avec des longueurs différentes, y compris les 7, 11, 13, 18 et 24 cm et gammes de pH différents y compris pH 4-5, 4-7, 6-9 et 10-3 soit un gradient de pH linéaires ou non linéaires. Utilisé le tampon IPG doit monter la bande27,28.
  6. 1.6.Add 250 µL d’extraction tampon (urée 7 M, 2 M thiourée, 4 % (p/v) CHAPS, 100 mM DTT (ajouter avant utilisation), 0,5 % v/v pharmalyte (ajouter avant utilisation) et des traces de bleu de bromophénol).
  7. Conserver la solution inférieure à 30 ° C, suivi au Vortex pendant 5 min, sonification pendant 5 min et en tournant pour 50 min.
  8. Ajouter 110 µL de tampon de réhydratation (urée 7 M, 2 M thiourée, 4 % (p/v) CHAPS, 60 mM DTT (ajouter avant utilisation), tampon de 0,5 % v/v IPG (ajouter avant utilisation) et des traces de bleu de bromophénol). Laisser agir pendant 5 min. Tournez ensuite l’échantillon pendant 50 min, Vortexer pendant 5 min et centrifuger pendant 20 min à 15 000 x g.
  9. Récupérer le surnageant (350 µL) comme la protéine de solution échantillon8.

2. électrophorèse bidimensionnelle sur Gel

  1. IEF (première dimension) : effectuer IEF sur le système de focalisation isoélectrique, tel que décrit ci-dessous.
    1. Ajouter 350 µL de la solution d’échantillon de protéine dans la fente d’un support de bandes de 18 cm IPG.
    2. Mettez un 18 cm IPG bande gel-côté-vers le bas sur la solution d’échantillon de protéine (éviter les bulles).
    3. Ajouter 3 à 4 mL d’huile minérale pour couvrir la bande IPG.
    4. Montez le support de bandes IPG dans le système de focalisation isoélectrique l’extrémité pointue sur la plaque arrière (+) et l’extrémité carrée sur la plaque avant (−).
    5. Se réhydrater pendant la nuit (~ 18 h à température ambiante).
    6. Définissez les paramètres de l’IEF : µA maximum 30 actuelle par bande, 20 ° C ; 250 V, 1 h, 125 Vh, étape et cale ; 1 000 V, gradient de 1 h, Vh 500, 8 000 V, gradient de 1 h, 4 000 Vh, 8 000 V, 4 h, 32 000 Vh, step et cale ; et 500 V, 0,5 h, 250 Vh, étape et maintenir. Laissez-le fonctionner jusqu'à une durée totale de 7,5 h et 36 875 Vh.
    7. Après IEF, retirez chaque bande IPG et enlever l’huile minérale supplémentaire avec une serviette en papier insolubles. Maintenant, enrouler la bande dans une feuille de film étirable et stocker à −80 ° C.
      Remarque : Le titulaire de la IPGstrip doit être nettoyé avec le titulaire de la IPGstrip solution de nettoyage et de l’eau distillée.
  2. SDS-PAGE (deuxième dimension) : exécuter SDS-PAGE dans un système d’électrophorèse de cellule verticale
    Remarque : Chaque taille de gel SDS-PAGE devrait être 255 x 190 x 1 mm.
    1. Utiliser un lanceur multi-gel pour effectuer un cast 12 % PAGE résolution des gels. Casting 12 % gels de PAGE, procédez comme suit.
      1. Ajouter 270 mL de ddH2O, 150 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL de solution mère de 40 % (p/v) acrylamide/bisacrylamide (29 : 1, 40 % w/v acrylamide et 1,38 % w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 150 µL de TEMED faire le gel solution dans un bécher. Mélanger doucement et éviter les bulles.
      2. Verser la solution de gel doucement dans la chambre de multidiffusion jusqu'à la hauteur prévue de gel (19 cm).
      3. Immédiatement ajouter environ 3 mL FD2O sur chaque résolution gel pour couvrir les gels. Laisser le gel se polymériser pendant environ 1 h.
    2. Préparer 20 litres d’un tampon d’électrophorèse (25 mM Tris, glycérine 192 mM et SDS 0,1 %). Remplir le réservoir tampon d’électrophorèse séparation unité avec ce tampon.
    3. Retirez les bandes IPG ciblées du congélateur et équilibrer les bandes pendant 10 min en balançant doucement dans 4 mL de tampon d’équilibre (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), urée 6 M, 2 % (p/v) SDS, 20 % (v/v) de glycérol, 2 % w/v DTT (ajouter avant utilisation) de réduire et des traces de bleu de bromophénol).
    4. Équilibrer pendant 10 min en poussant doucement les bandes IPG réduites dans 4 mL de tampon d’équilibre alkylation (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), urée 6 M, 2 % (p/v) SDS, 20 % (v/v) de glycérol, de 2,5 % w/v iodoacétamide (ajouter avant utilisation) et des traces de bleu de bromophénol).
    5. Au cours de gel équilibre, démonter la chambre de multidiffusion et sortir la cassette de gel résolution préparée. Rincer 3 x avec FD2O. enlever excès ddH2O avec une serviette en papier insoluble et mis dans un repose-pied de gel.
    6. Rincez les bandes IPG équilibrés avec le tampon d’électrophorèse et enlever l’excès de liquide sur la surface de bande IPG avec l’essuie-tout insolubles.
    7. Mettre une bande IPG sur la résolution gel SDS-PAGE et laisser latéraux en plastique de la bande de l’IPG en contact avec la plaque de verre plus longue et la pointe vers la gauche.
    8. Versez 3-4 mL de chaud agarose à 1 % dans un tampon de l’électrophorèse SDS (~ 80 ° C) rapidement à l’IPG bande de joint sur le dessus de chaque gel SDS-PAGE et mettre le haut-côté de bande IPG jusqu'à la partie supérieure de la plaque de verre plus courte sans bulles et puis polymériser pendant 10 min.
    9. Insérez la cassette de gel assemblés verticalement entre les joints d’étanchéité en plastique dans le système d’électrophorèse verticale. Mettre la partie supérieure du gel avec la bande IPG à côté de la cathode (−).
    10. Ajuster le niveau du tampon d’électrophorèse de plonger la cassette de gel.
    11. Connecter et mis le bloc d’alimentation/contrôle en mode de tension constante et courir à 200 V environ 370 min tout en surveillant le colorant.
    12. Après l’exécution, retirez la cassette de gel du système d’électrophorèse et retirer doucement le gel de la cassette de gel, éviter de déchirer le gel, suivi de la coloration des protéines séparées 2DE.
  3. La coloration des protéines séparées 2DE
    1. Coloration à l’argent
      1. Transférer doucement le gel avec les deux mains dans un bac contenant de 250 mL de solution de fixation (méthanol à 50 % (v/v) et 5 % (v/v) d’acide acétique) et agiter doucement le gel pendant 20 min.
      2. Jeter la solution et ajouter 250 mL de méthanol à 50 % (v/v) dans le bac et agitez doucement pendant 10 min.
      3. Jeter de méthanol et ajouter 250 mL de ddH2O dans la barre d’État. Agiter doucement pendant 10 min.
      4. Agiter doucement le gel pendant 1 min dans 250 mL de tampon de sensibilisation contenant du thiosulfate de sodium 0,02 % (p/v), l’et jetez le liquide.
      5. Agiter doucement le gel dans 250 mL de ddH2O pendant 1 min (répéter une fois de plus). Jeter le liquide après chaque étape.
      6. Agiter doucement le gel pendant 20 min en argent de 250 mL de solution de réaction (nitrate d’argent 0,1 % (p/v) avec 200 µL 37 % (v/v) de formaldéhyde ajouté avant utilisation).
      7. Agiter doucement le gel dans 250 mL de ddH2O pendant 1 min (répéter une fois de plus). Jeter le liquide après chaque étape.
      8. Secouez le gel doucement dans 250 mL de solution de développement (carbonate de sodium 3 % (p/v) avec 100 µL 37 % (v/v) de formaldéhyde ajouté avant utilisation) jusqu'à ce que l’intensité souhaitée de la coloration est obtenue (généralement 1-3 min), puis jeter le liquide.
      9. Agiter le gel pendant 10 min dans 250 mL de solution (acide acétique à 5 % (v/v)) d’arrêt doucement et jeter le liquide.
      10. Agiter pendant 5 min dans 250 mL de ddH2O doucement et jeter le liquide.
      11. Garder le gel en 250 mL stocker la solution de glycérol de 8,8 % à 4 ° C.
    2. Coloration bleu de Coomassie brillant
      1. Préparer la solution de coloration en dissolvant Coomassie brillant de Coomassie bleue G250 0,3 g, sulfate d’ammonium 25 g et l’acide phosphorique 25 mL en FD2O et jusqu'à un volume total de 200 mL. Avant utilisation, ajouter méthanol 50 mL.
      2. Ajouter 250 mL de solution au gel de coloration de Coomassie et agiter doucement à température ambiante jusqu'à effacer taches de protéines (~ 2-4 h). Jeter le liquide.
      3. Ajouter 250 mL de ddH2O et agiter lentement pendant 5 min, puis deux fois plus. Jeter le liquide.
      4. Ajouter 250 mL de solution de décoloration (20 % (v/v) d’éthanol) et agiter lentement jusqu'à ce que la couleur d’arrière-plan deviennent presque incolore et jeter le liquide.
      5. Remplacer par la nouvelle solution de décoloration, quand l’ancien on devient sombre et jeter le liquide.
      6. Ajouter 250 mL de ddH2O et agiter lentement pendant 5 min. jetez le liquide.
      7. Ajouter 250 mL de solution (8,8 % de glycérol) de stocker et de conserver à 4 ° C.
  4. Analyse d’image électrophorèse bidimensionnelle sur gel
    1. Numériser les gels colorés avec un scanner à plat.
    2. Intégrer l’image dans le système d’analyse de gel 2D image.
    3. Détecter et quantifier chaque tache à l’aide d’un logiciel d’analyse de gel 2D image selon le protocole du fabricant.
    4. Faire correspondre les taches entre les différents gels.

3. identification des protéines séparées 2DE avec MS

  1. Préparation du mélange de peptide trypsique
    Remarque : Tubes de mastic ou faible rétention et pointes de pipette devraient servir à éviter des pertes de protéines ou de peptides.
    1. Argent-gel de décoloration
      1. Le gel tube les taches dans un 1,5 mL siliconé et lavent à 500 µL ddH2O 6 fois de l’accise.
      2. Mettre le gel lavé dans un nouveau tube de 1,5 mL siliconé et il mâche en plusieurs petits morceaux (0,5 à 1 mm3).
      3. Décolorer les morceaux de gel dans 20 µL de la solution de décoloration qui mêle une partie du ferricyanure de potassium 30 mM et une partie du thiosulfate de sodium de 100 mM (1:1) avant utilisation de laisser la couleur brunâtre disparaissent (généralement 1-2 min). Jeter le liquide.
      4. Laver les morceaux de gel avec 20 µL de ddH2O 5 - 6 fois pour laisser la couleur jaune disparaissent. Jeter le liquide après chaque étape.
      5. Ajouter 20 µL de bicarbonate d’ammonium 200 mM pour les pièces de gel et rester pendant 20 min. Lavez les morceaux de gel avec FD2O (20 µL, 1 heure). Jeter le liquide.
      6. Déshydrater les morceaux de gel avec de l’acétonitrile 30 µL au moins deux fois pour laisser les morceaux de gel tourner un blanc opaque et vide-centrifuge sec pendant 30 min.
    2. Bleu de Coomassie brillant gel bleu de décoloration
      1. Couper les taches de gel dans un tube de 1,5 mL siliconé et laver avec 500 µL ddH2O au moins 3 fois.
      2. Mettre le gel lavé dans un nouveau tube de mastic de 1,5 mL et il mâche en plusieurs morceaux (0,5 à 1 mm3) avec un embout de la pipette.
      3. Décolorer le gel à 50-100 µL de solution décoloration (1:1 v/v mix 200 mM NH4HCO3 avec de l’acétonitrile) selon le volume de gel, incuber à 37 ° C dans un bain d’eau. Répétez et ajouter la solution de décoloration fraîche jusqu'à ce que la couleur disparaît (~ 1 h). Jeter le liquide après chaque étape.
      4. Laver les morceaux de gel une fois avec 20 µL de ddH2O.
      5. Déshydrater les morceaux de gel dans 100 µL acétonitrile (au moins deux fois) pour laisser les morceaux de gel tourner opaque blanc.
      6. Aspirateur sec pendant 30 min.
    3. Digestion trypsique de dans-gel des protéines dans les pièces sèches gel
      1. Dissoudre 20 µg (833 pmol) de poudre de trypsine lyophilisée dans 100 µL d’acide acétique 50 mM.
      2. Diluer 20 µL de solution de trypsine (200 ng/µL) à 16 ng/µL avec 230 µL de bicarbonate d’ammonium 50 mM.
      3. Ajouter 20 à 30 µL (0,32-0,48 µg) de la solution de trypsine dilué dans chaque tube contenant des morceaux de gel séchées. Incuber pendant 18 à 20 h en a 37 ° C au bain-marie. Laissez la solution reposer à 4 ° C pendant 30 min.
      4. Centrifuger la solution doucement pendant 10 s. sonicat dans un bain d’eau pendant 5-6 min à 30 ° C et puis centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min.
      5. Recueillir le liquide surnageant contenant le mélange de peptide trypsique dans un tube de mastic de 0,5 mL.
    4. Purification du mélange de peptide trypsique avec C18 microcolonne.
      1. Laver chaque colonne C18 avec de l’acétonitrile (10 µL, 5 fois), puis avec 50 % d’acétonitrile (10 µL, 5 fois).
      2. Equilibrer avec 0,1 % d’acide acétique trifluoro (TFA) (10 µL, 5 fois).
      3. Pipetter l’échantillon monte et descend à travers la colonne C18 préparée pour 15 fois.
      4. Laver l’échantillon 2 x 10 µL 0,1 % TFA.
        Remarque : Les peptides tryptiques purifiées sont conservées dans la colonne C18.
      5. Ajouter un volume (6 µL) de solution (85 % v/v acetonitrile/0.1% v/v acide formique) dans un tube de mastic propre 0,5 mL, pipette cette solution doucement et lentement vers le haut et en bas par le biais de peptide-C18 perles pour 10 x laver les peptides de liaison dans la solution, sécher à l’air et magasin (−20 ° C) pour analyse par SM.
  2. Analyse par SM
    1. Analyse de MALDI-MS PMF
      1. Ajouter 4 µL de 85 % v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA pour dissoudre le mélange de peptide trypsique purifiée. Charge 2 µL dissous peptide trypsique mélange sur une plaque de MALDI et immédiatement ajouter 2 µL de solution а-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) qui contient 10 g/L dans l’acétonitrile 500 mL/L 1 mL/L AGT, puis sécher à l’air.
      2. Charger la plaque MALDI avec mélange de peptide trypsique dans un spectromètre de masse MALDI-MS.
        Remarque : Les paramètres de l’instrument sont définis en tant que mode de réflecteur avec 20 kV, accélérant la tension, la polarité positive et 160 ns retard d’extraction. Chaque spectre MS est acquis avec 200 coups de laser avec une gamme de m/z 1 000 à 4 000 après étalonnage externe avec le peptide standard mass.
      3. Utiliser un logiciel de traitement de spectre MS pour traiter chaque spectre MS, y compris la correction de base, suppression du bruit (5 %) et PIC deisotoping.
      4. Corriger la liste massive de chaque spectre MS avec la suppression des masses contaminants de la trypsine, la matrice, kératines et autres contaminants inconnus en parallèle des expériences blanc-gel.
      5. Entrée la masse rectifiée la liste dans une protéine PMF-basé la recherche logiciel pour identifier des protéines dans la base de données de protéine Swiss-Prot avec les paramètres suivants de la recherche, y compris le type de recherche PMF, humain, clivage de la trypsine avec 1 maximum raté, fixe carbamidomethyl cystéine, méthionine variable oxydation, monoisotopique, tolérance masse de peptide 50ppm, frais de peptide d’État (1 +) et du signal/bruit (S/B) 5.0.
      6. Identifier des protéines avec des scores de protéine statistiquement significative, et où la protéine score =-10 × log(p), où p est la probabilité que le match observé est un événement aléatoire.
    2. Analyse de MALDI-MS/MS
      1. Ajouter 4 µL de 50 % v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA pour dissoudre le mélange de peptide trypsique purifiée. Chaque mélange de peptide trypsique purifiée (0,5 µL) a été repéré sur une plaque 384 puits MALDI, immédiatement repéré 0,5 µL de matrice CHCA saturée dans 50 % acetonitrile/0.1% TFA sur le dessus de l’échantillon de peptide et puis séché à l’air.
      2. Laissez la MALDI-TOF-TOF MS/MS à gérer automatiquement, à l’aide de 100 tirs lasers en vue d’acquérir un spectre MS1, et accumulant 6 répété MS1 spectres dans un spectre synthétique de MS1.
      3. Situé à 4 ions précurseurs plus intense de chaque spectre MS1 synthétique pour l’analyse MS/MS. Utilisation laser 100 coups pour chaque ion précurseur d’acquérir un spectre MS/MS et accumuler 4 répètent des spectres MS/MS dans un spectre MS/MS synthétique.
      4. Les données synthétiques de MS/MS permet de rechercher des protéines grâce à une protéine basée sur MS/MS, la recherche de logiciels avec des paramètres, y compris MS/MS Ion recherche, base de données humaine de Swiss-Prot, la trypsine avec un maximum de 1 clivage manqué, fixe carbamidomethyl (C), variable Oxydation (M), valeur de Masse monoisotopique, peptide masse tolérance ± 100 ppm et fragment de tolérance ± 0,7 masse Da.
      5. Identifier une protéine avec une probabilité statistiquement significative basée sur Mowse score et ions = -10 x Log(P), où p est la probabilité que le match observé est un événement aléatoire.
    3. Analyse LC-ESI-MS/MS
      1. Ajouter 6 µL de 5 % v/v acetonitrile/0.1% v/v formique acide pour dissoudre le mélange de peptide trypsique purifiée.
      2. Utilisation d’un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) couplé en ligne à un ionisation électrospray (ESI)-MS/MS de masse spectromètre avec un logiciel de gestion de données acquises de MS/MS pour gérer l’ensemble de l’opération.
      3. Utilisez la colonne C18 de piège (300 µm i.d. × 5 mm de longueur) et la colonne C18 à phase inverse (75 µm de diamètre intérieur x 15 cm de longueur) avec un gradient de séparation à 98 % de solvant un (0,1 % d’acide formique) et le 2 % de solvant B (0,1 % de l’acide formique dans 100 % d’acétonitrile) pendant 2 min , 2 % à 40 % de solvant B pour 45 min, 40 % à 95 % de solvant B pendant 5 min et 95 % de solvant B pendant 10 min (un total de 65 min à 300 nL/min).
      4. Définir les modes d’ions positifs et dépendant des données de sondage automatique pour acquérir des spectres MS et MS/MS et définir la dissociation induite par collision (CID) pour la fragmentation de l’ion.
      5. Affectez à chaque scan MS une gamme de masses de m/z 350-1 800 avec une résolution de 100 000 à m/z 400. Effectuer l’analyse pour les 7 ions plus intense dans le scan MS.
      6. Protéine utilisation MS/MS-basé la recherche logiciel j’ai pour rechercher la base de données pour l’identification des protéines.
        1. Sélectionnez la base de données de protéine humaine.
        2. Sélectionnez la trypsine avec un site de clivage manquées autorisé.
        3. La valeur tolérance peptide (±10 ppm), fragment de tolérance ion (±0, 8 Da), peptide carbamidomethylation de charge (2 + 3 + et 4 +), fixé à cystéine et oxydation variable à la méthionine.
        4. Définir le taux de fausse découverte (FDR) < 1 % et seulement des peptides avec grade 1 sont acceptés.
        5. Identifier des protéines avec PSM≥1 (MPS : le nombre total de séquences de peptides identifiés (MPS) pour les protéines, y compris celles de manière redondante) et au moins deux peptides uniques par protéine.
      7. En outre, utiliser MS/MS-protéine recherche logiciel II pour rechercher la base de données pour l’identification des protéines.
        1. Convertir le fichier raw de MS dans un fichier .mgf.
        2. Sélectionné à la base de données de protéine humaine (uniprothuman_20161031.fasta qui contient les 70940 séquences et 23897047 résidus).
        3. Sélectionnez la digestion trypsique avec un maximum de 2 clivages manquées.
        4. Ensemble fixé carbamidomethyl (C), la variable désamidé (NQ) et oxydation (M), la tolérance masse ion précurseur 10ppm, tolérance de masse d’ion de fille 0,8 Da et monoisotopique peak.
        5. Identifier les protéines avec un seuil de signification de 0,05 et au moins 2 peptides uniques.

Résultats

1. 2DE MALDI MS PMF : avec la procédure expérimentale décrite ci-dessus, un total de 150 µg protéines ont été extraites des tissus de la NFPA exprimés FSH (femelle ; 50 ans, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-) FSH (+) et TSH (-)) et Range sur un 18 cm Bande de l’IPG (NL pH 3-10) et un gel SDS-PAGE grand format, puis visualisées avec coloration à l’argent. Nous avons obtenu un modèle de gel 2DE reproductibles et bonne de NFPA tissu protéome...

Discussion

2de, couplées avec les méthodes MS y compris 2DE-MS PMF et 2DE-MS/MS, a été utilisé avec succès dans notre programme à long terme - l’utilisation de la protéomique pour étudier les variations de protéomiques humaines NFPA et variations de réseau moléculaire pour l’élucidation des mécanismes moléculaires et découverte de biomarqueurs efficaces pour NFPAs. Protéomique comparative basée sur 2de avec bonne reproductibilité joue un rôle important dans l’identification des normes NFPA protéomiques va...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81572278 et 81272798 à XZ), les subventions de projet de Plan de la Chine « 863 » (Grant No. 2014AA020610-1 à XZ), les fonds de l’hôpital Xiangya pour Introduction de Talent (à XZ) et le Hunan La Fondation provinciale des sciences naturelles de Chine (subvention no 14JJ7008 à XZ). Les auteurs reconnaissent également la contribution scientifique du Dr Dominic M. Desiderio dans le Health Science Center de l’Université du Tennessee. X.Z. continuellement développé et utilisé méthodes 2DE-SM pour analyser proteome Adénome hypophysaire à partir de 2001, conçu le concept pour le présent manuscrit, a écrit et révisé le manuscrit, a coordonné les travaux pertinent et était responsable de la soutien financier et les travaux correspondant. Y.L. a participé à la révision du manuscrit. Y.H a participé à la collection de références et la révision du manuscrit. Tous les auteurs approuvés le manuscrit final.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareisoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAThe vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHigh performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Insoluble paper towel
WatterMade by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizerBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gel image analysis software
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrum-processing software
Mascot softwarePMF-based protein searching software  
Mascot softwareMS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fastaHuman protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02) MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

Références

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