JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем двумерного гель-электрофорез (2DE) в сочетании с масс-спектрометрия (МС) для разделения и идентификации ткани протеома человека Аденома гипофиза, который представляет шаблон хороший и воспроизводимые 2DE. Многие белки наблюдаются в каждом месте 2DE при анализе протеома комплекс рака с использованием MS высок чувствительности.

Аннотация

Аденома гипофиза человека (ПА) является распространенной опухоли, что происходит в человеческого гипофиза в системах ось гипоталамус гипофиз ориентированных орган и могут быть классифицированы как клинически функциональных или нефункциональным ПА (FPA и NFPA). NFPA трудно для ранней стадии диагностики и терапии благодаря едва подъемные гормонов в крови, по сравнению с FPA. Нашей долгосрочной целью является использование методов протеомики для обнаружения надежных биомаркеров для уточнения ПА молекулярных механизмов и признание эффективного диагностические, прогностические маркеры и терапевтических целей. Эффективное двумерного гель-электрофорез (2DE) в сочетании с масс-спектрометрия (МС) методы были представлены здесь для анализа человеческого протеомов ПА, включая подготовку образцов, 2D электрофорез, белок визуализации, анализа изображений, в гель Пищеварение трипсина, пептид массового отпечатков пальцев (PMF) и тандем массы спектрометрия (МС/МС). 2-мерной гель электрофореза при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрия PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-жидкостная хроматография (LC) МС/МС процедуры успешно применялись в анализе NFPA протеома. С использованием высокой чувствительности масс-спектрометр многие белки были определены с помощью метода 2DE-LC-MS/MS в каждом 2D гель пятно в анализе сложных ПА ткани для максимального охвата человеческого ПА протеома.

Введение

ПА является распространенной опухолью, которая происходит в человеческого гипофиза в системах ось гипоталамус гипофиз ориентированных органа, которые играют важную роль в эндокринной системы человека. PA включает в себя клинические функциональные и нефункциональные PAs (FPA и NFPA)1,2. NFPA затруднено в ранней стадии диагностики и терапии из-за уровня только слегка повышенной гормонов (например, ЛГ и ФСГ) в крови, по сравнению с FPA, который значительно возрос уровень соответствующих гормонов в крови3,4 ,5. Уточнение молекулярных механизмов и открытие эффективных биомаркеров имеет важное клиническое значение в диагностике, терапии и прогноз NFPA. Наша долгосрочная цель заключается в том, чтобы развивать и использовать proteomic методы для изучения NFPA для открытия надежной биомаркеров для уточнения его молекулярные механизмы и признать эффективных терапевтических целей, а также диагностических и прогностических маркеров. 2-де, в сочетании с MS методы широко используются в нашей долгосрочной программы исследований относительно человека ПА протеома1,2,6,7, включая создание протеома ссылки карты в3,8, анализ дифференциально выраженным белком профили9,10,11,12,13, гормон варианты14 ,15, столб-поступательные изменения таких фосфорилирования тирозина и14 азотирования16,17,18, протеомических вариации инвазивных относительно Неинвазивный NFPAs19и протеомных неоднородность NFPA подтипы13, которое привело к открытию нескольких важных путь сетей (митохондриальной дисфункции, регуляции клеточного цикла, оксидативный стресс и MAPK сигнализации системы аномалии), изменяются в NFPA13,19,20.

2DE отделяет протеины согласно их Изоэлектрическая точка (Пи) (изоэлектрическая упором, МЭФ) и молекулярный вес (через натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. это разделение общего и классической техники в области протеомики, с момента введения концепции протеома и протеомики в 1995 году24. МС является метод решающее значение для выяснения личности отделен 2DE белков, включая стратегии PMF и МС/МС. Очень быстрое развитие инструментов MS, особенно в аспектах чувствительность обнаружения и разрешения, в сочетании с улучшением системы LC, значительно улучшает личность низкий или очень низкий изобилие белков в протеома максимизировать освещение протеома. Она также побуждает наши традиционные концепции, что только один или два белки присутствуют в 2D гель пятно в анализе сложных человеческих тканей протеома и предоставляет возможность выявить несколько белков в 2D гель пятно в анализе сложных человеческих тканей протеома и увеличить охват NFPA протеома.

Здесь мы описываем подробные протоколы 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-LC-MS/MS, которые успешно использовались в анализе человека NFPA протеома. Протоколы включают в себя подготовку образцов, первый аспект (изоэлектрическая упором, ВФВ), второе измерение (SDS-PAGE), Визуализация белков (Серебряные пятная и Окрашивание Кумасси синий), изображение анализ 2D геля, Пищеварение трипсина в гель, Очистка tryptic пептидов, PMF, МС/МС и прижигание3,8,,2526базы данных. Кроме того для анализа других тканей человека протеомов легко переводит этот протокол.

протокол

Настоящий Протокол следует принципам в Xiangya больнице медицинской этики Комитет Центральный Южный университет, Китая. Головы шапка и перчатки должны носить весь экспериментальной процедуры, чтобы избежать загрязнения кератина от кожи и волос8.

1. подготовка проб

  1. Соберите ПА тканей (0,2 - 0,5 мг) от нейрохирургическое отделение. Сразу же замораживание в жидком азоте и затем передать-80 ° C для хранения.
  2. Добавить 2 мл 0,9% NaCl в дистиллированной деионизированной воды (ddH2O). Это решение используйте слегка помыть кровь от поверхности ткани (3 x).
    Примечание: на протяжении всего протокола используется ddH2O с проводимостью 18.2 MΩ/см. Некоторые из tissuemight быть потеряны, когда смыть кровь от поверхности ткани.
  3. Добавление тома (10 mL; 4 ° C) раствора, содержащего 2 M уксусной кислоты и 0,1% (v/v) β-меркаптоэтанол за каждые 0,5 - 0,6 г ткани, однородный (1 мин, 13000 об/мин, 4 ° C, 10 x) с ткани гомогенизатор, sonicate Гомогенат трутневых 20 s, lyophilize и хранить в −80 ° C.
  4. Измерить содержание белка лиофилизированные, гомогенизированных образцов с помощью bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного комплект.
    Примечание: BCA количественная оценка не является абсолютным количественной оценки, и измеренные результат будет изменена с различных техник и экспериментальной агента. Стандартный образец фиксированной концентрации должны использоваться для различных экспериментов. Таким образом будет определяться окончательной загрузки количество белков для каждого 2D гель с изображением хорошо резолюции серебро окрашенных или Кумасси окрашенных в pre-конструированные экспериментов.
    1. Добавьте около 300 мкг лиофилизированные гомогенизированные образца для одного тома (282 мкл) извлечения белков буфера (8 M мочевины и главы 4%), затем стоя за 2 ч, sonicating в ванне с водой на 5 мин, вращающихся за 1 ч, снова sonicating на водяной бане 5 мин , снова вращается за 1 ч и центрифугирование в 15000 x g 20 мин.
    2. Подготовить BSA стандартных растворов с концентрациями как упомянуто: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1500, 2000 мкг/мл с коммерческим стандартом BSA (2 мг/мл).
    3. Mix BCA реагент A и B (: b = 50: 1) как BCA рабочий раствор до использовать.
    4. Добавьте 0,1 мл образца или стандартные решения в 2 мл BCA рабочего раствора в отцентрифугировать трубку, после смешивания и затем инкубации при 37 ° C за 30 мин. Окончательно охладить при комнатной температуре в течение 10 минут и измерить A562 Нм O.D. значение.
    5. Расчет стандартной линейной линии (A562 Нм против концентрации BSA) для получения регрессионное уравнение для расчета образца белка контента со значением562nm .
  5. Используйте 150 мкг белка эквивалент лиофилизированные образца для окрашивания серебра, или 500 мкг белка для Кумасси, окрашивание, для градиента полосы рН (IPG) 18 см иммобилизованных рН 3-10 нелинейных (NL).
    Примечание: IPG сухого газа — 0,5 мм толщиной и 3 мм шириной, с разной длины, включая 7, 11, 13, 18, 24 см и диапазоны различных рН, включая pH 4-5, 4-7, 6-9 и 3-10 в градиент линейными или нелинейными рН. Используемый буфер IPG должны соответствовать газа27,28.
  6. 1.6.Add 250 мкл извлечения буфер (мочевина 7 М, 2 М тиомочевины, главы 4% (w/v), 100 мм DTT (добавить до использования), 0,5% v/v pharmalyte (добавить до использования) и след бромфеноловый синий).
  7. Держите решение ниже 30 ° C, следуют vortexing за 5 мин, sonicating на 5 мин и вращающихся на 50 мин.
  8. 110 мкл буфера регидратации (мочевина 7 М, 2 М тиомочевины, главы 4% (w/v), 60 мм DTT (добавить до использования), 0,5% v/v IPG буфера (добавить до использования) и след бромфеноловый синий). Sonicate за 5 мин. Затем поверните образца 50 мин, вихрь на 5 мин и центрифуги для 20 мин на 15000 x g.
  9. Соберите супернатант (350 мкл) как белка образец решения8.

2. двумерного гель-электрофорез

  1. МЭФ (первый аспект): выполнить МЭФ на изоэлектрической система фокусировки, как описано ниже.
    1. 350 мкл пример решения белка, в слот стрипов IPG 18 см.
    2. Положить 18 см IPG газа гель сторона вниз на решение примера белка (избежать пузырей).
    3. Добавьте 3-4 мл минерального масла для покрытия полосы IPG.
    4. Соберите IPG стрипов изоэлектрической фокусировки системы заостренным концом на пластины обратно (+) и квадратный конец на табличке спереди (−).
    5. Увлажняет всю ночь (~ 18 ч при комнатной температуре).
    6. Установите параметры МЭФ: максимальный ток 30 МКА на полосы, 20 ° C; 250 В, ч. 1, 125 Vh, шаг и удерживайте; 1000 V, 1 ч, 500 Vh, градиент; 8000 V, 1 ч, 4000 Vh, градиент; 8000 V, 4 h, 32000 Vh, шаг и удерживайте; и 500 V, 0,5 ч, 250 Vh, шаг и удерживайте. Дайте ему поработать общее время 7,5 h и 36,875 Vh.
    7. После МЭФ вывезти каждый IPG газа и удаление дополнительных минеральное масло с неразрешимой бумажным полотенцем. Теперь оберните полосу в лист полиэтиленовой пленкой и хранить в −80 ° C.
      Примечание: IPGstrip держатель должен чиститься с держателем IPGstrip моющего раствора и дистиллированной воды.
  2. SDS-PAGE (второй аспект): выполняют SDS-PAGE в вертикальной системы электрофореза ячейки
    Примечание: Каждый размер геля SDS-страницы должны быть 255 x 190 x 1 мм.
    1. Использование нескольких гель заклинателя бросить 12% страницы разрешения гели. Для литья 12% гели страницы, выполните следующие действия.
      1. Добавьте 270 мл ddH2O, 150 мл 1,5 М трис-HCl (рН 8,8), 180 мл 40% (w/v) раствор акриламида/bisacrylamide (29: 1, 40% w/v акриламида и 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 мл Персульфат аммония 10%, а 150 мкл TEMED сделать гель решение в стакан. Осторожно перемешать и избежать пузырей.
      2. Залейте раствор геля мягко в многоадресной камеры до ожидаемого гель высоты (19 см).
      3. Сразу же добавьте около 3 мл ddH2O на каждом разрешая гель для покрытия гели. Пусть гель полимеризоваться около 1 часа.
    2. Подготовка 20 Л буфер электрофореза (25 мм трис, 192 мм глицерин и 0.1% SDS). Заполните бак буфера блока разделения электрофорез с этот буфер.
    3. Вынуть целенаправленного IPG полоски из морозильника и сбалансировать полоски для 10 мин, тряся мягко в 4 мл сокращения равновесия буфера (375 мм трис-HCl (рН 8,8), 6 M мочевины, 2% (w/v) SDS, глицерина 20% (v/v), 2% w/v DTT (добавить до использования) и след бромфеноловый синий).
    4. Сбалансировать за 10 мин, осторожно тряся уменьшение полосы IPG в 4 мл алкилирования равновесия буфера (375 мм трис-HCl (рН 8,8), 6 M мочевины, 2% (w/v) SDS, глицерина 20% (v/v), 2,5% w/v iodoacetamide (добавить до использования) и след бромфеноловый синий).
    5. Во время гель равновесия разбирать многоадресной камеры и вывезти подготовленный разрешая гель кассеты. Промойте 3 x с ddH2O. удалить избыток ddH2O нерастворимых бумажным полотенцем и положить в Стандер гель.
    6. Промойте уравновешенной IPG полоски с буфер электрофореза и удалите избыток жидкости на поверхности полосы IPG нерастворимых бумажным полотенцем.
    7. Положите IPG газа на разрешая гель SDS-PAGE и пусть IPG газа пластиковые боковой контакт больше стеклянную пластину и заостренным концом налево.
    8. Залить 3-4 мл горячего агарозы 1% в буфер электрофореза SDS (~ 80 ° C) быстро, чтобы запечатать IPG газа на вершине каждого геля SDS-PAGE и положил на топ сторону IPG полосы вниз верхней части короче стеклянную пластину без пузырей и затем полимеризоваться за 10 мин.
    9. Вставьте кассету собрал гель вертикально между пластиковые прокладки в системе вертикального электрофореза. Поместите в верхней части гель с IPG полосы рядом с катода (−).
    10. Отрегулируйте уровень буфера электрофореза погрузиться гель кассеты.
    11. Подключите и установите блок питания/управления в режиме постоянного напряжения и запустить в 200 V около 370 мин при мониторинге красителя.
    12. После запуска, вынуть кассету гель от системы электрофореза и осторожно удалить гель из геля кассеты, избегая разрывая гель, после окрашивания разделенных 2DE белков.
  3. Окрашивание 2DE-отделенный белков
    1. Серебряный пятнать
      1. Аккуратно перенести гель с двумя руками в трее, содержащий 250 мл раствора фиксации (50% метанола (v/v) и уксусная кислота 5% (v/v)) и осторожно встряхивайте гель для 20 мин.
      2. Отменить решение и добавить 250 мл 50% (v/v) метанола в трее и осторожно встряхните 10 мин.
      3. Отменить метанола и добавить 250 мл ddH2O в трее. Встряхните мягко в течение 10 мин.
      4. Осторожно встряхнуть лари за 1 мин в 250 мл сенсибилизации буфер, содержащий тиосульфата натрия 0,02% (w/v) и отказаться от жидкости.
      5. Осторожно встряхните геля в 250 мл ddH2O 1 мин (повторить еще раз). Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      6. Осторожно встряхните гель для 20 мин в 250 мл Серебряный реакции раствора (0,1% (w/v) нитрат серебра с 200 мкл формальдегида 37% (v/v) добавлены перед использованием).
      7. Осторожно встряхните геля в 250 мл ddH2O 1 мин (повторить еще раз). Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      8. Трясти геля мягко в 250 мл раствора развития (3% (w/v) карбонат натрия с 100 мкл 37% (v/v) формальдегида добавлены до использования) до получения желаемой интенсивности окрашивания (обычно 1-3 мин), затем отменить жидкости.
      9. Осторожно встряхнуть гель для 10 мин в 250 мл, останавливая решения (5% (v/v) уксусная кислота) и отказаться от жидкости.
      10. Осторожно встряхнуть за 5 мин в 250 мл ddH2O и отбросить жидкости.
      11. Держите гель 250 мл, хранение решение 8,8% глицерина при 4 ° C.
    2. Блестящий синий Окрашивание Кумасси
      1. Подготовить Кумасси, окрашивание раствора путем растворения Кумасси блестящий синий G250 0,3 г, аммония сульфат 25 g и фосфорной кислоты 25 мл в ddH2O и до общего объема 200 мл. Перед использованием, добавить метанола 50 мл.
      2. Добавить 250 мл Кумасси, окрашивание решения гелем и осторожно встряхивайте при комнатной температуре до ясно появляются пятна протеина (~ 2-4 ч). Слейте жидкость.
      3. Добавьте 250 мл ddH2O и поколебать медленно в течение 5 мин, затем два раза больше. Слейте жидкость.
      4. Добавьте 250 мл Открашивающий раствора (20% (v/v) этанола) и поколебать медленно до тех пор, пока фоновый цвет становится почти бесцветная и отбросить жидкости.
      5. Заменить свежим destaining раствором, когда старый один становится темно и отбросить жидкости.
      6. Добавьте 250 мл ddH2O и поколебать медленно в течение 5 минут удалить жидкость.
      7. Добавить 250 мл хранения раствора (8,8% глицерина) и хранить при 4 ° C.
  4. Анализ изображений электрофорез двумерного гель
    1. Оцифровывать витражные гели с планшетный сканер.
    2. Входного изображения в 2D гель системы анализа изображений.
    3. Выявлению и количественной оценке каждое пятно с помощью программного обеспечения анализа изображений 2D гель согласно протоколу производителя.
    4. Матч пятна между различными гели.

3. Определение разделенных 2DE белков с MS

  1. Подготовка смеси tryptic пептид
    Примечание: Силиконизированный или низкий удержание труб и наконечники должны использоваться во избежание любой потери белков и пептидов.
    1. Серебро гель минигелей
      1. Акцизный гель пятна в 1,5 мл силиконизированный трубки и мыть в 500 мкл ddH2O 6 раз.
      2. Промывают гель в новой 1,5 мл силиконизированный трубки и фарш на многие мелкие кусочки (0.5-1 мм3).
      3. Отмойте гель куски в 20 мкл destaining решение, которое смешивает частью 30 мм калия Гексацианоферрат и частью 100 мм тиосульфата натрия (1:1) перед использованием позволить коричневатого цвета исчезают (обычно 1-2 мин). Слейте жидкость.
      4. Промойте гель части с 20 мкл ddH2O 5 - 6 раз позволить желтого цвета исчезают. Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      5. 20 мкл бикарбонат аммония 200 мм на куски гель и остаться на 20 мин мыть части геля ddH2O (20 мкл, 1 раз). Слейте жидкость.
      6. По крайней мере дважды обезвоживает гель штук с 30 мкл Ацетонитрил позволить гель куски превратить непрозрачный белый и вакуум центрифуга сухой за 30 мин.
    2. Кумасси блестящий синий гель минигелей
      1. Вырезать пятна геля в 1,5 мл силиконизированный трубку и мыть с 500 мкл ddH2O по крайней мере 3 раза.
      2. Вставьте новый 1,5-мл силицированного промывают гель и рубить его на несколько частей (0.5-1 мм3) с кончиком пипетки.
      3. Отмойте гель в 50-100 мкл минигелей раствор (1:1 v/v микс 200 мм NH4HCO3 с ацетонитриле) в зависимости от объема геля, инкубации при 37 ° C на водяной бане. Повторить и добавить свежий раствор минигелей, до тех пор, пока цвет исчезает (~ 1 ч). Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      4. Промойте гель части раз с 20 мкл ddH2O.
      5. Обезвоживает гель штук в 100 мкл Ацетонитрил (по крайней мере дважды), чтобы куски гель белеет непрозрачного.
      6. Пылесос сухой для 30 мин.
    3. Пищеварение трипсина в гель белков в кусочки сушеных гель
      1. Растворяют 20 мкг (833 пмоль) порошка лиофилизированных трипсина в 100 мкл 50 мм уксусной кислоты.
      2. 20 мкл раствора трипсина (200 нг/мкл) разбавляют до 16 нг/мкл с 230 мкл бикарбонат аммония 50 мм.
      3. 20-30 мкл (0,32 0,48 мкг) решения разреженных трипсина в каждую пробирку, содержащих кусочки сушеных гель. Проинкубируйте 18-20 ч при 37 ° C в водяной бане. Пусть решение стоять на 4 ° С 30 мин.
      4. Центрифуга решение аккуратно для 10 s. Sonicate в ванне с водой для 5-6 минут при 30 ° C и затем центрифуги на 12000 x g на 2 мин.
      5. Соберите супернатанта, содержащие смесь tryptic пептида в 0,5 мл силицированного трубку.
    4. Очистка tryptic пептид смеси с C18 microcolumn.
      1. Мыть каждый столбец C18, Ацетонитрил (10 мкл, 5 раз), а затем с 50% Ацетонитрил (10 мкл, 5 раз).
      2. Сбалансировать с 0,1% трифтор уксусной кислоты (ТФК) (10 мкл, 5 раз).
      3. Пипетка образец вверх и вниз через подготовленный C18 колонку для 15 раз.
      4. Вымойте образца 2 x с 0.1% 10 мкл TFA.
        Примечание: Очищенный tryptic пептидов, сохраняются в столбце C18.
      5. Добавление тома (6 мкл) раствора (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v муравьиной кислоты) в трубу силицированного чистой 0,5 мл, Пипетка это решение осторожно и медленно вверх и вниз через пептид C18 Бусины для 10 x мыть Бонд пептидов в раствор, воздушно-сухой и хранилище (−20 ° C) для анализа MS.
  2. Анализ MS
    1. Анализ MALDI MS PMF
      1. 4 мкл 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA растворить смесь очищенный tryptic пептид. Нагрузки 2 мкл растворяют tryptic пептид смесь на тарелку MALDI и сразу 2 мкл раствора а-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA), который содержит 10 г/Л в ацетонитриле 500 мл/Л 1 мл/Л TFA, затем просушите.
      2. Загрузите MALDI пластины с tryptic пептид смесь в масс-спектрометр MALDI MS.
        Примечание: Задаются параметры инструмента в режиме отражателя с 20 кв, ускорения напряжения, положительной полярности и 160 ns задержку добычи. Каждый МС спектра приобретается с 200 выстрелов лазер с спектр m/z 1000 до 4000 после внешней калибровки с стандартным пептид массы.
      3. Используйте программное обеспечение MS спектра обработки для обработки каждой МС спектра, включая коррекция базовой линии, удаление шума (5%) и пик deisotoping.
      4. Исправьте массовые список из каждого МС спектра с удаления загрязняющих масс от трипсина, матрица, кератины и другие неизвестные загрязнители параллельно бланк гель экспериментов.
      5. Вход, исправлена масса список Некодирующие PMF-основе Поиск программного обеспечения для идентификации белков в базе данных Swiss-Prot белка с параметрами поиска, включая PMF тип поиска, человека, трипсина с 1 максимальная пропустил расщепления, фиксированный carbamidomethyl цистеина, переменная метионина окисление, monoisotopic, пептид массового терпимости 50 ppm, пептид заряд государство (1 +) и сигнал к шуму (S/N) 5.0.
      6. Идентифицировать белки с белка статистически значимые результаты, и где белка оценка =-10 × log(p), где p — вероятность того, что наблюдаемое матч случайное событие.
    2. Анализ MALDI-MS/MS
      1. 4 мкл 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA растворить смесь очищенный tryptic пептид. Каждый очищенный tryptic пептид смесь (0.5 мкл) заметили на 384-ну MALDI-плита, сразу заметили 0.5 мкл насыщенных CHCA матрицы в 50% acetonitrile/0.1% TFA на вершине пептида образца и затем высушить на воздухе.
      2. Пусть MALDI-TOF-TOF MS/MS управляться автоматически, с использованием 100 выстрелов лазер для приобретения одной MS1 спектра, и накапливая 6 повторил MS1 спектры в один синтетический MS1 спектра.
      3. Установите 4 наиболее интенсивным прекурсоров ионов от каждого синтетических MS1 спектра для анализа МС/МС. Использование 100 лазерный кадры для каждого прекурсора Ион приобрести один МС/МС спектра, и накапливать 4 повторяются МС/МС спектры в один синтетический МС/МС спектра.
      4. Использование синтетических данных MS/MS для поиска белков через MS/MS-основе белка Поиск программного обеспечения с параметрами, включая MS/MS Ион Поиск, человека базы данных Swiss-Prot, трипсина с максимум 1 пропущенных расщепления, фиксированной carbamidomethyl (C), переменная Окисление (М), monoisotopic значения массы, пептид массового допуск ± 100 ppm и фрагмент массового допуск ± 0,7 да.
      5. Определение белка с вероятностью статистически на основе показателя Mowse и ионы оценка = -10 x Log(P), где p — вероятность того, что наблюдаемое матч случайное событие.
    3. Анализ LC-ЭСИ-MS/MS
      1. 6 мкл 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v муравьиной кислоты растворить смесь очищенный tryptic пептид.
      2. Использование высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) системы в сочетании с электроспрей ионизации (ESI) онлайн-MS/MS Масса спектрометра с МС/МС приобретенных данных управления программным обеспечением для управления всей операции.
      3. Используйте C18 ловушку столбец (300 мкм и.д. × 5 мм длиной) и реверс фаза C18 столбец (75 мкм и.д. x 15 см длины) с градиентом разделения на 98% растворителя (0,1% муравьиной кислоты) и 2% растворителем B (0,1% муравьиной кислоты в 100% ацетонитриле) 2 мин , 2% до 40% растворителем B за 45 мин, 40% до 95% растворителем B на 5 мин и 95% растворителем B 10 мин (в общей сложности 65 мин 300 нл/мин).
      4. Установите положительный ион режим и режим данных зависимых автоматический опрос для приобретения МС и МС/МС спектры и столкновения индуцированной диссоциации (ДУР) для фрагментации ионов.
      5. Значение каждого сканирования MS массовых спектр m/z 350-1800 с разрешением 100 000 на m/z 400. Выполните проверку для 7 наиболее интенсивным ионов в MS сканирования.
      6. На основе использования MS/MS белка Поиск программного обеспечения я для поиска в базе данных для идентификации белков.
        1. Выберите базу данных, человеческий белок.
        2. Выберите трипсина с одним пропустили расщепления сайта допускается.
        3. Задать допуск пептида (±10 ppm), фрагмент Ион терпимости (±0.8 Da), carbamidomethylation пептид заряда (2 +, 3 + и 4 +), фиксированный на цистеина и переменная окисления в метионин.
        4. Набор ложных обнаружения ставок (ФДР) < 1% и только пептиды с ранга 1 принимаются.
        5. Определение белка с PSM≥1 (PSMs: общее количество выявленных пептид последовательностей (PSMs) для белков, в том числе резервно определены) и по крайней мере два уникальных пептидов на белок.
      7. Кроме того используйте MS/MS-белка поиска программного обеспечения на основе II для поиска в базе данных для идентификации белков.
        1. Конвертировать raw файл MS в файл .mgf.
        2. Выбран человеческий белок базы данных (uniprothuman_20161031.fasta, который содержит последовательности 70940 и 23897047 остатков).
        3. Выберите Пищеварение трипсина с максимум 2 пропущенных разобщенности.
        4. Набор carbamidomethyl (C), переменной deamidated (NQ) и окисления (M), прекурсор Ион массового терпимости 10 ppm, дочь ионной массы терпимости 0,8 Да и пик monoisotopic.
        5. Идентифицировать белки с пороговое значение 0,05 и по крайней мере 2 уникальных пептидов.

Результаты

1. 2DE-MALDI MS PMF: с экспериментальной процедурой, описанной выше, в общей сложности 150 мкг белка были извлечены из ФСГ выразил NFPA тканей (женщина, 50 лет, АКТГ (-), GH (-), ПРЛ (-), LH (-), ФСГ (+) и ТТГ (-)) и выстроились с 18 см IPG полосы (рН 3-10 NL) и геля SDS-PAGE большого формата, з...

Обсуждение

2DE, в сочетании с MS методы, включая 2DE-MS PMF и 2DE-MS/MS, успешно используется в нашей долгосрочной программе - использование протеомики для изучения человеческого NFPA proteomic вариации и молекулярных сети вариации для разяснения молекулярных механизмов и Открытие эффективных биомаркеров для NFPAs. ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана национального фонда естественных наук Китая (Грант № 81572278 и 81272798 XZ), субсидий из Китая «863» план проекта (Грант № 2014AA020610-1-XZ), Xiangya больница фондов для введения талант (к XZ) и Хунань Фонд провинциального естественных наук Китая (Грант № 14JJ7008 к XZ). Авторы также признают научный вклад д-р Доминик м. Desiderio в центра науки здоровья университета штата Теннесси. X.Z. постоянно разработаны и используются методы 2DE-MS для анализа протеома Аденома гипофиза, начиная с 2001 года, задуманная концепция для настоящей рукописи, написал и пересмотренный рукописи, координировал работу соответствующих и отвечал за финансовая поддержка и соответствующую работу. Ю.л. приняла участие в пересмотре рукописи. Y.H участие в коллекцию ссылок и Редакция рукописи. Все авторы одобрил окончательный вариант рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareisoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAThe vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHigh performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Insoluble paper towel
WatterMade by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizerBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gel image analysis software
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrum-processing software
Mascot softwarePMF-based protein searching software  
Mascot softwareMS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fastaHuman protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02) MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

Ссылки

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
  28. Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134PMF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены