JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

Özet

İnsan hipofiz adenom (PA) insan hipofiz bezi hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sisteminde oluşur ve klinik olarak işlev veya işlevsiz PA (odak ve NFPA) sınıflandırılabilir ortak bir tümördür. NFPA erken aşamada tanı ve tedavi ancak odak için karşılaştırıldığında kan hormon yükselen nedeniyle zordur. Uzun vadeli hedefimiz güvenilir biyolojik açıklama PA moleküler mekanizmaları ve etkili tanı, prognostik işaretleri ve tedavi hedefleri tanınması için keşfetmek için proteomik yöntemleri kullanmaktır. Kütle spektrometresi (MS) yöntemlerle birleştiğinde etkili iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) buraya örnekleri, 2D Jel Elektroforez, protein görselleştirme, görüntü analizi, jel hazırlanması da dahil olmak üzere insan PA proteomes analiz sunuldu Tripsin sindirim, peptid kitle parmak izi (PMF) ve tandem spektrometresi (MS/MS) kitle. 2-boyutlu Jel Elektroforez matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi PMF (2DE-maldı MS PMF), 2DE-maldı MS/MS ve 2DE-sıvı Kromatografi (LC) MS/MS yordamları başarıyla uygulanan NFPA Proteom analizinde bir. Bir yüksek-duyarlı Kütle Spektrometre kullanımıyla, birçok protein ile her 2D jel insan PA Proteom kapsamını maksimize etmek için karmaşık PA doku analizinde bir spot 2DE-LC-MS/MS yönteminde tespit edilmiştir.

Giriş

PA insan endokrin sisteminde önemli roller oynar hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sistemleri insan hipofiz bezinde oluşan ortak bir tümördür. PA klinik olarak fonksiyonel ve işlevsiz PAs (odak ve NFPA)1,2içerir. NFPA erken aşamada tanı ve tedavisi nedeniyle sadece biraz yüksek hormon düzeyleri (örneğin, LH ve FSH) kan kan3,4 karşılık gelen hormon düzeyleri önemli ölçüde artmıştır odak göre zordur ,5. Moleküler mekanizmalar açıklama ve etkili biyolojik keşfi tanı, tedavi ve NFPA Prognozunda önemli klinik öneme sahip. Uzun vadeli hedefimiz geliştirmek ve NFPA onun moleküler mekanizmaları netleştirmek için güvenilir biyolojik keşfi için çalışmaya proteomik yöntemleri kullanın ve tanılama ve prognostik işaretleri yanı sıra etkili tedavi hedefleri tanımak olduğunu. 2-DE MS yöntemleri ile birleştiğinde kapsamlı bir şekilde kullanıldığını Proteom başvuru kurulması da dahil olmak üzere insan PA Proteom1,2,6,7, ilgili uzun vadeli araştırma programımızda 3,8, analiz differentially ifade protein profilleri9,10,11,12,13, hormon türevleri14 haritalar ,15, fosforilasyon14 ve tirozin nitration16,17,18gibi translasyonel modifikasyon, göreli olarak invazif proteomik varyasyonu invaziv olmayan NFPAs19ve birden çok önemli yolu (mitokondrial disfonksiyon, hücre döngüsü bozukluk, oksidatif stres ve ağları MAPK sinyal keşfi yol açan NFPA alt türlerinden13, proteomik heterojen Sistem anormallik) NFPA13,19,20dakikaya değişmiş.

2DE ayıran proteinler isoelectric noktası (PI) (isoelectric odaklanarak, IEF) ve molekül ağırlığı (yolu ile Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez, SDS-sayfa) göre1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. bu ortak ve klasik ayırma proteomik, alanında Proteom ve proteomik içinde 199524kavramlarını giriş beri bir tekniktir. MS 2DE ayrılmış proteinlerin PMF ve MS/MS stratejileri de dahil olmak üzere kimlik bulmak için çok önemli bir tekniktir. MS aletleri, özellikle de algılama hassasiyeti ve çözünürlük, LC sistemi, geliştirilmesi ile birlikte yönleri çok hızlı gelişimi büyük ölçüde düşük veya çok düşük bereket proteinler arasında en üst düzeye çıkarmak için bir Proteom kimlik geliştirir bir Proteom kapsama. Bu da bizim geleneksel kavramları yalnızca bir meydan okuyor veya iki protein 2B jel karmaşık insan dokusu Proteom analizinde bir nokta mevcut ve birden çok protein 2B jel karmaşık insan dokusu analizinde bir nokta belirlemek için bir fırsat sağlar Proteom ve NFPA Proteom kapsama en üst düzeye çıkarmak.

Burada 2DE-maldı MS PMF, 2DE-maldı MS detaylı protokolleri açıklamak/MS ve 2DE-LC-MS/başarıyla insan NFPA Proteom analizinde kullanılan MS. İletişim kuralları hazırlık içerir örnekleri, ilk ikinci boyut (isoelectric odaklanarak, IEF), (SDS-sayfa), görselleştirme (Gümüş boyama ve Coomassie mavi boyama) proteinlerin boyut, görüntü analiz 2D jel, jel tripsin sindirim, Arıtma tryptic peptidler, PMF, MS/MS ve3,8,25,26yakıcı veritabanı. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer insan dokusu proteomes analiz için çevirir.

Protokol

Mevcut iletişim kuralı Xiangya Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi merkez Güney Üniversitesi, Çin kuralları izler. Cilt ve saç8keratin kirlenmesini önlemek tüm deneysel işlemin için baş bir kap ve eldiven giyilmelidir.

1. hazırlanması örnekleri

  1. PA dokuları (0.2 - 0.5 mg) Nöroşirürji bölümünden toplamak. Hemen sıvı azot donma ve sonra-80 ° C depolama için transfer.
  2. Ekle 2 mL % 0,9 NaCl deiyonize distile su (GKD2O). Bu çözüm kan doku yüzey (3 x) hafifçe yıkamak için kullanın.
    Not: GKD2O 18,2 MΩ/cm iletkenliği ile boyunca protokolünün kullanılır. Bazı tissuemight zaman kan mendil'ın yüzey yıkama kaybolur.
  3. Bir birim (10 mL; 4 ° C'de) 2 M Asetik asit ve % 0.1 (v/v) β-mercaptoethanol her 0,5 - 0,6 g doku için içeren çözüm eklemek, (1 dk, 13000 rpm, 4 ° C, 10 x) ile bir doku homogenizer homojenize, homogenate 20 için solüsyon içeren temizleyicide s, lyophilize ve −80 ° C.
  4. Lyophilized protein içeriğini ölçmek, bicinchoninic asit (BCA) kullanarak homojenize örnekleri kiti tahlil.
    Not: BCA miktar mutlak bir miktar değildir ve ölçülen sonuç farklı bir teknisyen ve deneysel ajan ile değiştirilecek. Bir sabit konsantrasyon örnek standart farklı deneyler için kullanılmalıdır. Bu nedenle, protein 2B her jel için son yükleme miktarı önceden tasarlanmış deneylerde gümüş lekeli veya Coomassie lekeli iyi çözünürlüklü görüntü ile belirlenecektir.
    1. Yaklaşık 300 µg lyophilized homojenize örnek protein ayıklama bir birime (282 µL) eklemek arabellek (8 M üre ve % 4 çocuklar), ardından 2s için ayakta, 1 h, tekrar 5 min için su banyosunda sonicating için dönüşümlü 5 min için bir su banyosunda sonicating , tekrar 1 h için döndürme ve 15.000 x g 20 dk için de centrifuging.
    2. BSA standart çözümler konsantrasyonları ile belirtildiği gibi hazırlamak: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µg/mL ticari BSA standart (2 mg/mL) ile.
    3. Mix BCA Reaktif A ve B (A:B 50: 1 =) BCA çalışma çözüm kullanmak için önceden olarak.
    4. BCA çalışma çözüm karıştırma ve 30 dk 37 ° C'de kuluçka ardından bir microfuge tüp 2 mL 0.1 mL numune veya standart çözüm ekleyin. Son olarak, oda sıcaklığında 10 dakika serin ve A ölçmek562 nm od değer.
    5. Standart doğrusal hat hesaplamak (A562 nm BSA konsantrasyon vs) örnek protein562nm değeri ile içerik hesaplamak için regresyon denklemi elde edilir.
  5. Protein eşdeğer lyophilized örneği gümüş boyama için 150 µg veya 500 µg boyama, bir 18-cm immobilize pH degrade (IPG) şerit pH için 3-10 doğrusal olmayan (NL) Coomassie için protein kullanın.
    Not: IPG kuru 0,5 mm kalınlığında ve 3 mm çapında, 7, 11, 13, 18 ve 24 cm ve pH 4-5, 4-7, 6-9 ve 3-10 ya da doğrusal veya doğrusal olmayan pH Gradyanda dahil olmak üzere farklı pH aralığı da dahil olmak üzere farklı uzunlukları ile bandıdır. IPG arabelleği şerit27,28sığması gerekir.
  6. Arabellek ayıklama 1.6.Add 250 µL (7 M üre, 2 M Tioüre, %4 (w/v) arkadaşlar, 100 mM DTT (eklemek kullanılmadan önce), % 0,5 v/v pharmalyte (kullanılmadan önce eklemek) ve bromophenol mavi iz).
  7. Çözüm vortexing 5 dk, 5 dk sonicating ve 50 min için döndürme için ardından 30 ° C'den tutun.
  8. Rehidrasyon arabelleği 110 µL eklemek (7 M üre, 2 M Tioüre, %4 (w/v) arkadaşlar, 60 mM DTT (eklemek kullanılmadan önce), % 0,5 v/v IPG arabellek (kullanılmadan önce eklemek) ve bromophenol mavi iz). 5 min için solüsyon içeren temizleyicide. Sonra örnek 50 dk, 5 dk için girdap ve 15.000 x g de 20 dk santrifüj döndürün.
  9. Süpernatant (350 µL) protein örnek çözüm8olarak toplamak.

2. iki boyutlu Jel Elektroforez

  1. IEF (ilk boyut): IEF aşağıda açıklandığı gibi isoelectric odak sistem üzerinde gerçekleştir.
    1. Protein örnek çözüm 350 µL 18 cm IPG şerit tutucu yuvasında ekleyin.
    2. Bir 18 cm IPG şerit jel-yan-protein örnek çözümü bırak (kabarcıklar önlemek).
    3. Mineral yağ IPG şerit kapsayacak şekilde 3-4 mL ekleyin.
    4. IPG şerit sahibi isoelectric odaklama systemwith sivri uç geri (+) plaka ve kare sonu açık (−) plaka üzerinde topla.
    5. Gecede (oda sıcaklığında ~ 18 h) suyla temasa.
    6. IEF parametrelerini ayarlamak: maksimum geçerli 30 µA başına şerit, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, adım ve tutun; 1000 V, 1 h, 500 Vh, degrade; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, degrade; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, adım ve tutun; ve 500 V, 0,5 h, 250 Vh, adım ve tutun. Bir toplam süresi 7,5 h ve 36.875 Vh çalışmasına izin.
    7. Yardımcı sonra her IPG şerit ve ilave mineral yağ bir çözünmez kağıt havlu ile sökün. Şimdi şerit plastik wrap bir yaprak sarma ve saklamak −80 ° C.
      Not: IPGstrip tutucu temizleme solüsyonu IPGstrip sahibi ile temizlenmelidir ve distile su.
  2. SDS-sayfa (ikinci boyut): gerçekleştirmek SDS-sayfa dikey hücre Elektroforez Sistemi
    Not: Her SDS-sayfa jel boyutu 255 x 190 x 1 mm olmalıdır.
    1. % 12 oyuncular için bir çok jel pudra kullanın sayfa jelleri çözme. Döküm için % 12 sayfa jelleri, aşağıdaki adımları uygulayın.
      1. GKD2O, 1.5 150 mL 270 mL ekleyin M Tris-HCl (pH 8.8), 180 mL % 40 (w/v) Akrilamid/bisacrylamide stok çözeltisi (29:1, % 40 w/v Akrilamid ve %1.38 w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL % 10 amonyum persülfat ve jel yapmak için TEMED 150 µL çözüm bir ölçek. Karışımı yavaşça ve kabarcıklar kaçının.
      2. Jel çözüm yavaşça beklenen jel Yükseklik (19 cm) kadar çok noktaya yayın odası içine dökün.
      3. Hemen yaklaşık 3 mL GKD2O jelleri kapsayacak şekilde çözme her jel ekleyin. 1 h için polimerize jel izin.
    2. Elektroforez arabelleği (25 mM Tris, 192 mM gliserin ve % 0.1 SDS) 20 L hazırlayın. Elektroforez ayırma birimi arabellek tank bu arabellek ile doldurun.
    3. Dondurucu odaklı IPG şeritler çıkar ve denge arabellek (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M üre, %2 (w/v) SDS, %20 (v/v) gliserol, % 2 w/v DTT (önce Ekle) azaltmak 4 mL yavaşça içinde rock yaparak şeritler için 10 dk equilibrate ve bromophenol mavi iz).
    4. 10 dakikadır yavaşça azaltılmış IPG şeritler 4 mL alkillenme denge arabelleği rock yaparak equilibrate (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M üre, %2 (w/v) SDS, %20 (v/v) gliserol, % 2,5 w/v iodoacetamide (kullanılmadan önce eklemek) ve bromophenol mavi iz).
    5. Jel denge sırasında çok noktaya yayın odası sökmeye ve hazırlanan çözme jel kaset al. GKD ile2O. Kaldır aşırı GKD2O bir çözünmez kağıt havlu ile 3 x durulama ve bir jel stander koymak.
    6. Denge IPG şeritler Elektroforez arabellek ile durulayın ve çözünmez kağıt havlu ile IPG şerit yüzeyindeki aşırı sıvı kaldırın.
    7. Bir IPG şerit çözme SDS-sayfa jel koyun ve IPG Şerit'ın plastik yan uzun cam levha ve sol sivri ucunu başvurun verelim.
    8. 3-4 mL sıcak % 1'özel SDS Elektroforez arabelleği (~ 80 ° C) hızlı bir şekilde IPG şerit imzalamaya her SDS-sayfa jel üstüne dökün ve IPG şerit aşağı daha kısa cam levha kabarcıklar olmadan üst yüzeye koyup 10 dakikadır polimerize.
    9. Dikey Elektroforez Sistemi plastik contalar arasında dikey olarak birleştirilmiş jel kaset yerleştirin. Jel katot (−) yanında IPG şeridi ile üst koymak.
    10. Elektroforez jel kaset sokmak için arabellek düzeyini ayarlayın.
    11. Bağlanmak ve sabit voltaj modunda güç kaynağı/kontrol ünitesi ve 200 V yaklaşık 370 min için boya izleme sırasında çalışması.
    12. Çalışan sonra jel kaset Elektroforez sisteminden çıkar ve jel 2DE ayrılmış proteinlerin boyama tarafından takip jel, yırtılma kaçınarak jel kaset yavaşça kaldırın.
  3. 2DE ayrılmış proteinlerin boyama
    1. Gümüş boyama
      1. Yavaşça jel 250 mL fiksasyon çözeltisi (% 50 metanol (v/v) ve (v/v) % 5 Asetik asit) içeren bir tepsi içinde iki elle aktarmak ve yavaşça 20 dk için jel sallamak.
      2. Çözüm atın ve 250 mL % 50 (v/v) metanol içinde belgili tanımlık tepsi ekleyin ve hafifçe sallayın 10 dakikadır.
      3. Metanol atın ve 250 mL GKD2O içinde belgili tanımlık tepsi ekleyin. 10 dakikadır hafifçe sallayın.
      4. Yavaşça 1 dk. için jel 250 mL %0.02 (w/v) sodyum thiosulfate içeren Sensitizasyonu arabellek sallamak ve sıvı atın.
      5. Yavaşça GKD2O için 1 dk (tekrar bir kez daha) 250 ml jel sallamak. Sıvı her adımdan sonra atın.
      6. Yavaşça 20 dk için jel 250 mL gümüş tepki çözüm (%0,1 (w/v) gümüş nitrat kullanılmadan önce eklendi 200 µL % 37 (v/v) formaldehit ile) sallamak.
      7. Yavaşça GKD2O için 1 dk (tekrar bir kez daha) 250 ml jel sallamak. Sıvı her adımdan sonra atın.
      8. Shake jel 250 mL geliştirme çözümü içinde yavaşça (%3 (w/v) Sodyum karbonat 100 µL % 37 (v/v) formaldehit ile kullanılmadan önce eklendi) Boyama istenen yoğunluğu (genellikle 1-3 dk), elde edilir kadar sonra atmak sıvı.
      9. Yavaşça 10 min için jel 250 mL çözüm (%5 (v/v) Asetik asit) durdurma sallamak ve sıvı atın.
      10. Yavaşça 5 dk'ya 250 ml GKD2O sallamak ve sıvı atın.
      11. 250 mL % 8.8 gliserol 4 ° C'de çözüm depolama jel tutmak
    2. Coomassie parlak mavi boyama
      1. Çözüm Coomassie parlak çözülerek boyama Coomassie hazırlamak G250 0.3 g, 25 g amonyum sülfat ve fosforik asit GKD2O ve en fazla 200 mL toplam hacmi 25 mL mavi. Önce metanol ekle 50 mL.
      2. Jel çözüm boyama Coomassie 250 mL ekleyin ve hafifçe kadar temiz oda sıcaklığında sallamak protein noktalar görünür (~ 2-4 h). Sıvı atmak.
      3. GKD2O 250 mL ekleyin ve yavaş yavaş 5 dk, sonra iki kez daha fazla çalkalanır. Sıvı atmak.
      4. 250 mL destaining çözeltisi (% 20 (v/v) etanol) eklemek ve arka plan rengini neredeyse renksiz hale ve sıvı atmak kadar yavaşça sallayın.
      5. Ne zaman eski bir hava kararıyor taze destaining çözüm ile değiştirin ve sıvı atın.
      6. GKD2O 250 mL ekleyin ve yavaş yavaş 5 dk. atma sıvı sallamak.
      7. Depolama çözümü (% 8.8 gliserol) 250 mL ekleyin ve 4 ° C'de tutmak
  4. İki boyutlu Jel Elektroforez görüntü analizi
    1. Lekeli jelleri Düz Yataklı Tarayıcı ile dijital ortama.
    2. Görüntü 2D jel görüntü analiz sistemi girdi.
    3. Algılamak ve üreticinin protokolüne göre bir 2D jel görüntü analiz yazılımı kullanarak her spot ölçmek.
    4. Farklı jelleri arasındaki noktalar aynı.

3. kimlik ile Bayan 2DE ayrılmış proteinlerin

  1. Tryptic peptid karışımı hazırlanması
    Not: Silikonlu veya düşük tutma tüpler ve pipet ipuçları proteinler veya peptidler kaybı önlemek için kullanılmalıdır.
    1. Gümüş-jel destaining
      1. Noktalar 1,5 mL silikonlu içine tüp ve 500 µL GKD2O 6 kez yıkayın jel tüketim.
      2. Yıkanmış jel yeni silikonlu 1,5 mL tüp içine koymak ve birçok küçük parçalar halinde kıyma (0,5-1 mm3).
      3. 20 µL jel parçaları 30 mM potasyum ferricyanide bir parçası ve 100 mM sodyum thiosulfate (1:1) kullanım öncesinde bir parçası (genellikle 1-2 dk) ortadan kahverengimsi renk izin vermek karışımları destaining çözüm destain. Sıvı atmak.
      4. 5 - 6 kez GKD2O 20 µL ile jel parçalarını yıkamak yok sarı renk izin vermek. Sıvı her adımdan sonra atın.
      5. 200 mM amonyum bikarbonat 20 µL jel parçaları ekleyin ve 20 dk. yıkama için jel adet (20 µL, 1 saat) ile GKD2O dur. Sıvı atmak.
      6. 30 µL Asetonitril jel taşlarla en az iki kez açmak için 30 dk kuru bir opak beyaz ve vakum-santrifüj jel adet izin kurutmak.
    2. Parlak mavi jel Coomassie destaining
      1. Jel noktalar silikonlu 1,5 mL tüp içine kesilmiş ve 500 µL GKD2ile O en az 3 kez yıkayın.
      2. Yıkanmış jel bir yeni 1.5 mL siliconized tüp içine koymak ve birkaç parçaya kıyma (0,5-1 mm3) bir pipet ucu ile.
      3. Jel 50-100 µL destaining çözümü (1:1 v/v mix 200 mM NH4HCO3 ile Asetonitril) jel hacmine bağlı olarak destain, bir su banyosu içinde 37 ° C'de kuluçkaya. Tekrarlayın ve (~ 1 h) rengi kayboluncaya kadar taze destaining çözüm ekleyin. Sıvı her adımdan sonra atın.
      4. GKD2O. bir kez ile 20 µL jel parçalarını yıkayın
      5. Jel parçalar halinde bir opak beyaz açmak jel adet izin 100 µL Asetonitril (en az iki kez) kurutmak.
      6. Vakum için 30 dk kuru.
    3. Jel tripsin sindirim kurutulmuş jel parçalar halinde proteinlerin
      1. 20 µg (833 pmol) 50 mM asetik asitin 100 µL tripsin liyofilize toz geçiyoruz.
      2. Tripsin çözüm (200 ng/µL) 20 µL 16 ng/µL 230 µL 50 mM amonyum bikarbonat ile oranında seyreltin.
      3. 20-30 µL ekleyin (0,32-0.48 µg) kurutulmuş jel parçaları içeren her tüpün seyreltilmiş tripsin çözüm. 18-20 h su banyosu içinde 37 ° C'de için kuluçkaya. 4 ° C'de 30 dk için stand çözüm ver.
      4. Çözüm yavaşça su banyosu için 5-6 dk 30 ° C'de 10 s. Sonicate için santrifüj kapasitesi ve 12.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi.
      5. Toplamak 0.5 mL tryptic peptid karışımı içeren süpernatant tüp silikonlu.
    4. Tryptic peptid karışımı C18 microcolumn ile arıtma.
      1. Her C18 sütun Asetonitril (10 µL, 5 kez) ve o zaman % 50 Asetonitril (10 µL, 5 kez) ile yıkayın.
      2. % 0.1 trifluoro Asetik asit (TFA) (10 µL, 5 kez) ile equilibrate.
      3. Örnek yukarı ve aşağı için 15 kez hazırlanan C18 sütunu boyunca pipette.
      4. Örnek 2 yıkama x 10 µL % 0.1 ile TFA.
        Not: Saf tryptic peptidler C18 sütununda korunur.
      5. Bir birim (6 µL) çözeltisi (% 85 v/v acetonitrile/0.1% v/v formik asit) bir temiz 0.5 mL siliconized tüp içinde eklemek, bu çözüm yavaşça pipette ve yukarı ve aşağı yavaş yavaş peptid-C18 boncuk bond peptidler çözüm içine yıkamak 10 x için aracılığıyla kuruması ve MS analizi için mağaza (−20 ° C).
  2. MS analizi
    1. MALDI-MS PMF analizi
      1. 4 µL % 85 v/v acetonitrile/0.1% v/v arıtılmış tryptic peptid karışımı çözülmeye TFA ekleyin. Yük 2 çözünmüş µL tryptic peptid karışımı bir maldı plaka üzerine ve hemen ekleyin 2 µL 10 g/L 500 mL/L Asetonitril içerir a-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm 1 mL/L TFA, sonra kuruması.
      2. Tryptic peptid karışımı ile maldı plaka maldı-MS Kütle Spektrometre yükleyin.
        Not: Aracı parametreleri reflektör modu 20 olarak ayarlanmıştır kV gerilim, pozitif polarite ve 160 ns gecikme çıkarma süresi hızlandırılması. Her MS spektrum m/z 1000-4000 bir dizi ile 200 lazer çekin sonra dış kalibrasyon standart peptid ile kazanılır kitle.
      3. Bir MS spektrum-işleme yazılımı temel düzeltme, gürültü kaldırma (% 5) ve en yüksek deisotoping da dahil olmak üzere her MS spektrum işlemek için kullanın.
      4. Tripsin, matris, keratins ve bilinmeyen diğer kirletici boş-jel deneyler paralel bulaşıcı modellerden kaldırılması ile her MS spektrum kitle listeden düzeltin.
      5. Düzeltilmiş kitle cevapsız tripsin 1 en fazla bölünme, sabit bir PMF tabanlı protein araştırıcı proteinler İsviçre-Prot protein veritabanındaki PMF arama türü, insan, dahil olmak üzere aşağıdaki arama parametreleri ile belirlemek için bilgisayar yazılımı içine liste girişi carbamidomethyl sistein, değişken metiyonin oksidasyon, monoisotopic, peptid kitle tolerans 50 ppm, peptid sorumlu devlet (1 +) ve sinyal gürültü (S/N) 5.0.
      6. Proteinler ile istatistiksel olarak anlamlı protein Skorlar, tanımlamak ve nerede protein skor-10 × log(p), p gözlenen maç rastgele bir olay olma olasılığını nerede =.
    2. MALDI-MS/MS analizi
      1. 4 µL % 50 v/v acetonitrile/0.1% v/v arıtılmış tryptic peptid karışımı çözülmeye TFA ekleyin. Her saf tryptic peptid karışımı (0.5 µL) 384-iyi maldı-tabak içinde benekli, hemen 0,5 µL % 50 acetonitrile/0.1% TFA peptid örnek üst doymuş CHCA matrisin lekeli ve havada kurutulmuş.
      2. 100 lazer çekim bir MS1 spektrum, elde etmek için kullanarak otomatik olarak yönetilecek MALDI-TOF-TOF MS/MS izin ve biriken 6 MS1 spectra bir sentetik MS1 spektrum tekrar.
      3. 4 en yoğun habercisi iyonları her sentetik MS1 spektrum MS/MS analizi için ayarlayın. Kullanım 100 lazer çekim bir MS/MS spektrum elde etmek ve 4 birikir her öncül iyon için MS/MS spectra bir sentetik MS/MS spektrum tekrarladı.
      4. Sentetik MS/MS veri proteinler Yazılım MS/MS iyon arama, İsviçre-Prot insan veritabanı, en fazla 1 cevapsız bölünme, sabit carbamidomethyl (C), değişken tripsin dahil olmak üzere parametreleri ile arama bir MS/MS tabanlı protein aracılığıyla aramak için kullanın Oksidasyon (M), monoisotopic kitle değer, peptid kitle tolerans ± 100 ppm ve parça kitle tolerans ± 0.7 Da.
      5. Mowse puan ve iyonları puanı göre istatistiksel olarak anlamlı bir olasılık ile bir protein belirlemek -10 = Log(P), p gözlenen maç rastgele bir olay olma olasılığını nerede x.
    3. LC-ESI-MS/MS analizi
      1. 6 µL arıtılmış tryptic peptid karışımı çözülmeye % 5 v/v acetonitrile/0.1% v/v formik asit ekleyin.
      2. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sistemi online bir electrospray iyonlaşma (ESI) ile birleştiğinde kullanmak-MS/MS Kütle Spektrometre ile bütün operasyonu yönetmek için bir MS/MS veri alınan yönetim yazılımı.
      3. C18 tuzak sütun (300 µm kimlik × 5 mm Uzunluk) ve % 98'i solvent (%0,1 formik asit), bir ayrılık gradyan ile ters fazlı C18 sütun (75 µm kimlik x 15 cm uzunluk) ve % 2 çözücü B kullanın (%0,1 formik asit % 100 Asetonitril) için 2 dk , 2-% 40 çözücü B 45 dk, 5 min için % 40 ila % 95 çözücü B ve % 95 çözücü B 10 dakika (300 nL/dk 65 dk toplam).
      4. Pozitif iyon ve MS ve MS/MS spectra elde etmek ve ayrılma (CID) çarpışma indüklenen iyon parçalanma için ayarlamak için veri bağımlı otomatik anket modları ayarlayın.
      5. Her MS tarama m/z 350-1.800 kitle bir dizi 100.000 m/z 400, çözünürlük için ayarlayın. MS tarama 7 en yoğun iyonu için tarama gerçekleştirin.
      6. Kullanım MS/MS tabanlı protein yazılım arama ben kimlik proteinlerin veritabanını aramak için.
        1. İnsan proteini veritabanını seçin.
        2. Tripsin bir cevapsız bölünme site izin seçin.
        3. Peptid toleransı (±10 ppm) ayarla, iyon toleransı (±0.8 Da), sistein, peptid sabit ücret (2 +, 3 + ve 4 +), carbamidomethylation ve metionin, değişken oksidasyon parçası.
        4. Ayarla yanlış bulma oranları (FDR) < % 1 ve sadece peptidler sırası 1 ile kabul edilir.
        5. Protein PSM≥1 ile tanımlamak (PSMs: tanımlanan peptid dizileri (PSMs) protein artıksız tespit de dahil olmak üzere, toplam sayısı) ve protein başına en az iki benzersiz peptidler.
      7. Ayrıca, protein arama yazılımı MS/MS tabanlı II proteinler tanımlaması veritabanını aramak için kullanın.
        1. Ham MS dosyasını .mgf dosyasına dönüştürme.
        2. İnsan proteini veritabanı (uniprothuman_20161031.fasta 70940 dizileri ve 23897047 kalıntılar içeren) seçili.
        3. Tripsin sindirim en fazla 2 cevapsız nefrette seçin.
        4. Sabit carbamidomethyl (C), değişken deamidated (NQ) ve oksidasyon (M), öncül iyon kitle toleransı 10 ppm, kızı iyon kütle tolerans 0.8 kümesi Da ve monoisotopic en yüksek.
        5. Proteinler 0,05 ve en az 2 benzersiz peptidler önem eşik ile tanımlayın.

Sonuçlar

1. 2DE-maldı MS PMF: yukarıda açıklanan deneysel bir işlem ile toplam 150 µg proteinlerin NFPA FSH ifade edilen dokulardan elde (erkek; 50 yıl yaşlı, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) ve TSH (-)) ve bir 18 cm ile dizilmiş IPG Şerit (pH 3-10 NL) ve bir geniş formatlı SDS-sayfa jeli, gümüş boyama ile görüntülenir. NFPA doku Proteom (şekil 1), bir ortalama konum sapma 1,98 ± IEF yönde 0,75 mm ile v...

Tartışmalar

2DE 2DE-MS PMF ve 2DE-MS/MS, MS yöntemleri ile birleştiğinde, başarılı bir şekilde kullanılmıştır bizim uzun vadeli programı - insan NFPA proteomik varyasyonları ve moleküler ağ çeşitleri için moleküler mekanizmaları aydınlatma çalışmaya proteomik kullanımı ve NFPAs için etkili biyolojik keşfi. İyi tekrarlanabilirlik ile karşılaştırmalı proteomik 2DE tabanlı NFPA proteomik varyasyonları9,10,11...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çatışma olduğunu ilan eder.

Teşekkürler

Bu eser Çin (Grant Hayır 81572278 ve 81272798 olarak XZ), Çin "863" planı Projesi (Grant No XZ için 2014AA020610-1), Hunan ve yetenek Giriº (XZ) Xiangya hastane fon gelen hibe Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Çin'in il doğal Bilim Vakfı (XZ için Grant No. 14JJ7008). Yazarlar da Dr Dominic M. Desiderio Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi içinde bilimsel katkısını kabul. X.Z. sürekli olarak geliştirilen ve 2DE-MS yöntemleri 2001'den başlayarak hipofiz adenom Proteom çözümlemek için kullanılan, mevcut el yazması için kavram gebe, yazdı ve el yazması revize, ilgili çalışmaları koordine ve sorumlu mali desteği ve karşılık gelen çalışma. Yl el yazması revizyonunda katıldı. Y.H başvurular topluluğu ve el yazması revizyonu'na katılmıştır. Tüm yazarlar son el yazması onayladı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareisoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAThe vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHigh performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Insoluble paper towel
WatterMade by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizerBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gel image analysis software
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrum-processing software
Mascot softwarePMF-based protein searching software  
Mascot softwareMS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fastaHuman protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02) MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

Referanslar

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
  28. Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmalarsay 134iki boyutlu Jel ElektroforezIsoelectric odaklanarakAkrilamid Jel Elektroforezg m boyamaCoomassie boyamag r nt analizipeptid kitle parmak izi PMFTandem k tle spektrometresi MS MShipofiz AdenomProteom

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır