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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.

Zusammenfassung

Menschlichen Hypophysen Adenom (PA) ist ein gemeinsames Tumor, der tritt in der menschlichen Hypophyse in der Hypothalamus-Hypophysen-bezogene Achse Organsysteme, und kann als klinisch funktionsfähig oder nicht funktionsfähige PA (FPA und NFPA) eingestuft werden. NFPA ist schwierig für Bühne Frühdiagnostik und Therapie durch Hormone im Blut im Vergleich zu FPA kaum erhöhen. Unser langfristige Ziel ist es, Proteomics Methoden verwenden, um verlässliche Biomarker zur Klärung der PA molekularen Mechanismen und Anerkennung der effektive diagnostische, prognostische Marker und therapeutischen Ziele zu entdecken. Effektive zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) Methoden wurden hier vorgestellt, um menschliche PA Proteome, einschließlich Vorbereitung von Proben, 2D Gelelektrophorese, Protein-Visualisierung, Bildanalyse, in-Gel zu analysieren Trypsin-Verdauung, Peptid Masse Fingerabdruck (PMF) und Tandem Massenspektrometrie (MS/MS). 2-dimensionale Gel-Elektrophorese Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie PMF (2DE MALDI-MS-PMF), 2DE MALDI-MS/MS und 2DE-Liquid Chromatographie (LC)-MS/MS-Verfahren zur Analyse der NFPA Proteom erfolgreich angewendet wurden. Mit dem Einsatz eines Massenspektrometers hochempfindlichen wurden viele Proteine mit 2DE-LC-MS/MS-Methode in jedes 2D Gel vor Ort in einer Analyse der komplexen PA-Gewebe um die Deckung des menschlichen Proteoms PA zu maximieren identifiziert.

Einleitung

PA ist ein gemeinsames Tumor, der Auftritt in der menschlichen Hypophyse in der Hypothalamus-Hypophysen-bezogene Achse Organsysteme, die in das menschliche Hormonsystem eine wichtige Rolle spielen. PA enthält klinisch funktionelle und nicht funktionsfähige PAs (FPA und NFPA)1,2. NFPA ist im frühen Stadium-Diagnose und Therapie schwierig, weil nur leicht erhöhten Hormonspiegel im Blut im Vergleich zu FPA, die Ebenen der entsprechenden Hormone im Blut3,4 deutlich zugenommen hat (z.B.LH und FSH) ,5. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen und Entdeckung der effektive Biomarker hat wichtigen klinische Bedeutung in der Diagnostik, Therapie und Prognose der NFPA. Unser langfristige Ziel ist es, entwickeln und Proteomik Methoden verwenden, um NFPA für die Entdeckung der verlässliche Biomarker zu klären, die molekularen Mechanismen zu untersuchen und wirksame therapeutische Targets sowie diagnostische und prognostische Marker zu erkennen. 2-DE gepaart mit MS Methoden worden ausführlich in unserer langfristigen Forschungsprogramms über menschliche PA Proteom1,2,6,7, einschließlich Errichtung des Proteoms Referenz benutzt 3,8, Analyse differentiell exprimierten Protein Profile9,10,11,12,13, Hormon-Varianten14 Karten ,15, post-translationalen Modifikationen wie Phosphorylierung14 und Tyrosin Nitrierung16,17,18, die Proteomik-Variation der invasiven relativ zu nicht-invasive NFPAs19und der Proteomik Heterogenität der NFPA Subtypen13, führte zu die Entdeckung mehrerer wichtiger Signalweg Netze (mitochondriale Dysfunktion, Zellzyklus Dysregulation, oxidativen Stress und MAPK signaling System-Anomalie), NFPA13,19,20verändert werden.

2de trennt Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) (isoelektrischen Fokussierung, IEF) und Molekulargewicht (über Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dies ist eine gemeinsame und klassische Trennung Technik im Bereich der Proteomik, seit der Einführung der Konzepte der Proteom und Proteomics in 199524. MS ist die entscheidende Technik um herauszufinden, die Identität des 2DE getrennt Proteine, einschließlich PMF und MS/MS-Strategien. Die sehr rasche Entwicklung der MS Instrumente, insbesondere die Aspekte der Empfindlichkeit und Auflösung, in Kombination mit der Verbesserung der LC-System verbessert die Identität des gering oder sehr gering Fülle Proteine in einem Proteomforschung zur Maximierung der Berichterstattung über ein Proteome. Es fordert auch unsere traditionelle Konzepte, dass nur ein oder zwei Proteine befinden sich in einem 2D Gel vor Ort in einer Analyse der komplexen menschlichen Gewebes Proteom und bietet die Möglichkeit, mehrere Proteine in einem 2D Gel vor Ort in einer Analyse des komplexen menschlichen Gewebes zu identifizieren Proteome und maximieren Sie die Abdeckung des NFPA Proteoms.

Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle der 2DE MALDI-MS-PMF, 2DE MALDI-MS/MS und 2DE-LC-MS/MS, die erfolgreich in der Analyse des menschlichen Proteoms NFPA verwendet wurden. Die Protokolle sind Vorbereitung von Proben, zunächst Bemaßung (isoelektrischen Fokussierung, IEF), zweite Dimension (SDS-PAGE), Visualisierung von Proteinen (silberne Färbung und Coomassie blaue Färbung), Bildanalyse von 2D Gel, in Gel Trypsin-Verdauung Reinigung von tryptic Peptide, PMF, MS/MS und anbraten3,8,25,26-Datenbank. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokolls leicht für die Analyse von anderen menschlichen Gewebes Proteome.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Xiangya Krankenhaus medizinische Ethik Komitee der Central South University, China. Für das gesamte experimentelle Verfahren zur Vermeidung von Kontaminationen Keratin von Haut und Haar8sollte eine Kopf Kappe und Handschuhe getragen werden.

1. Vorbereitung der Proben

  1. PA-Gewebe (0,2 - 0,5 mg) von der neurochirurgischen Abteilung zu sammeln. Sofort einfrieren in flüssigem Stickstoff, und übertragen Sie dann auf-80 ° C für die Lagerung.
  2. Fügen Sie 2 mL 0,9 % NaCl in entionisiertem destilliertem Wasser (DdH2O). Verwenden Sie diese Lösung, um das Blut aus der Gewebeoberfläche (3 X) leicht zu waschen.
    Hinweis: DdH2O mit einer Leitfähigkeit von 18,2 MΩ/cm wird im gesamten Protokoll verwendet. Einige der Tissuemight werden verloren, beim Waschen von Blut aus einem Gewebeoberfläche.
  3. Hinzufügen ein Datenträgers (10 mL; 4 ° C) der Lösung mit 2 M Essigsäure und 0,1 % (V/V) β-Mercaptoethanol für jede 0,5 - 0,6 g des Gewebes, Homogenisieren (1 min, 13.000 u/min, 4 ° C, 10 X) mit einem Gewebe-Homogenisator, beschallen die Homogenat für 20 s, lyophilize , und speichern Sie bei −80 ° C.
  4. Den Eiweißgehalt der die lyophilisierten messen, homogenisierte Proben mit Bicinchoninic Säure (BCA) assay Kit.
    Hinweis: BCA Quantifizierung ist keine absolute Quantifizierung, und das Messergebnis wird mit einem anderen Techniker und der experimentellen Agent geändert werden. Ein festen Konzentration Probe Standard sollte für verschiedene Experimente verwendet werden. Daher wird die endgültige Belastung Menge Proteine für jedes 2D Gel mit dem Silber-gebeizt oder Coomassie gefärbt gute Auflösung Bild in die vorgefertigte Experimente bestimmt werden.
    1. 1 Volumenteil (282 µL) Protein-Gewinnung von ca. 300 µg der gefriergetrockneten homogenisierten Probe hinzufügen Puffer (8 M Harnstoff und CHAPS 4 %), gefolgt von 2 h stehen, in einem Wasserbad für 5 min, 1 h, wieder in das Wasserbad für 5 min beschallen drehen beschallen , 1 h wieder drehen und 15.000 x g für 20 min zentrifugieren.
    2. BSA-standard-Lösungen mit Konzentrationen vorzubereiten, wie bereits erwähnt: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µg/mL mit dem kommerziellen BSA Standard (2 mg/mL).
    3. Mix-BCA Reagenz A und B (a = 50: 1) als BCA funktionierende Lösung vor Gebrauch.
    4. 2 mL der BCA Arbeitslösung in einer Microfuge Röhre, gefolgt von mischen und dann Inkubation bei 37 ° C für 30 min fügen Sie 0,1 mL der Probe oder die standard-Lösung hinzu. Schließlich bei Raumtemperatur für 10 min abkühlen und Maßnahme A562 nm O.D Wert.
    5. Berechnen Sie die lineare Normzeile (A562 nm vs. BSA-Konzentration), eine Regressionsgleichung zur Berechnung der Probe Eiweißgehalt mit einem562nm Wert zu erhalten.
  5. Verwenden Sie 150 µg Protein entspricht lyophilisierter Probe für Silber Färbung oder 500 µg Protein für Coomassie-Färbung für eine 18-cm immobilisierte pH Gradienten (IPG) Streifen pH 3-10 nichtlineare (NL).
    Hinweis: Der IPG trockenen Streifen ist 0,5 mm dick und 3 mm breit, mit unterschiedlichen Längen, einschließlich 7, 11, 13, 18 und 24 cm und unterschiedlichen pH-Bereiche einschließlich pH 4-5, 4-7, 6-9 und 3-10 in entweder eine lineare oder nichtlineare pH-Gradienten. Der IPG-Puffer verwendet, muss der Streifen27,28passen.
  6. 1.6.Add 250 µL Puffer zu extrahieren (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % (w/V) CHAPS, 100 mM DTT (fügen Sie vor der Verwendung), 0,5 % V/V Pharmalyte (fügen Sie vor der Verwendung), und eine Spur von Bromophenol blue).
  7. Halten Sie die Lösung unter 30 ° C, gefolgt von vortexen für 5 min, 5 min beschallen und für 50 min. drehen.
  8. Fügen Sie 110 µL Rehydratation Puffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % (w/V) CHAPS, 60 mM DTT (fügen Sie vor der Verwendung), 0,5 % V/V IPG Puffer (fügen Sie vor der Verwendung), und eine Spur von Bromophenol blue). Für 5 min beschallen. Drehen Sie dann die Probe für 50 min., Vortex für 5 min und Zentrifuge für 20 min bei 15.000 x g.
  9. Sammeln Sie den überstand (350 µL) wie das Protein Probe Lösung8.

(2) zweidimensionale Gelelektrophorese

  1. IEF (erste dimension): IEF auf der isoelektrischen Fokussierung System führen, wie unten beschrieben.
    1. Fügen Sie 350 µL Probe Proteinlösung in den Steckplatz ein 18-cm-IPG-Filmstreifen-Halter.
    2. Legen Sie eine 18-cm IPG Streifen Gel-Side-Down auf Probe Proteinlösung (Vermeidung von Luftblasen).
    3. Hinzugeben Sie 3-4 mL Mineralöl zur Deckung des IPG-Streifens.
    4. Montieren Sie die IPG-Filmstreifen-Halter in der isoelektrischen Fokussierung System das Spitze Ende auf dem Rücken (+) Teller und Platz Ende auf der Vorderseite (−)-Platte.
    5. Rehydrieren Sie Übernachtung (~ 18 h bei Raumtemperatur).
    6. Legen Sie die IEF-Parameter: maximale aktuelle 30 µA pro Streifen, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, Step und halten; 1.000 V, 1 h, 500 Vh Gradient; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh Gradient; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, Step und halten; und 500 V, 0,5 h und 250 Vh, Schritt halten. Lassen Sie es auf eine Gesamtzeit von 7,5 h und 36.875 Vh zulaufen.
    7. Nach IEF jeder IPG-Streifen herausnehmen Sie und das zusätzliche Mineralöl mit einem unlöslichen Papiertuch. Nun die Streifen in einem Blatt Frischhaltefolie wickeln und bei −80 ° c lagern
      Hinweis: IPGstrip-Halter mit dem IPGstrip Halter Reinigungslösung gereinigt werden und destilliertes Wasser.
  2. SDS-PAGE (zweite dimension): durchführen von SDS-PAGE in einem vertikalen Zelle Elektrophorese-System
    Hinweis: Jeder SDS-PAGE Gel Größe sollte 255 x 190 x 1 mm betragen.
    1. Verwenden Sie eine Multi-Gel-Caster um 12 % Stimmen Seite Gele zu lösen. Gießen 12 % Seite Gele, führen Sie die folgenden Schritte.
      1. Fügen Sie 270 mL DdH2O, 150 mL von 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL 40 % (w/V) Acrylamid/Bisacrylamide Stammlösung (29,1, 40 % w/V Acrylamid und 1,38 % w/V N, N'-Methylenebisacrylamide), 3 mL 10 % Ammonium bleichen und 150 µL TEMED um das Gel zu machen Lösung in ein Becherglas. Mischen Sie vorsichtig und vermeiden Sie Luftblasen.
      2. Gießen Sie die Gel-Lösung sanft in das Multicasting Kammer bis zur Höhe des erwarteten Gel (19 cm).
      3. Fügen Sie ca. 3 mL DdH2O sofort auf jede Lösung von Gel Gele decken hinzu. Lassen Sie das Gel für ca. 1 h polymerisieren.
    2. 20 L der Elektrophorese Puffer (25 mM Tris 192 mM Glycerin und 0,1 % SDS) vorzubereiten. Füllen Sie die Elektrophorese Trennung Einheit Puffertank mit diesen Puffer.
    3. Nehmen Sie die fokussierten IPG-Streifen aus der Tiefkühltruhe, und equilibrate die Streifen für 10 min durch Schaukeln sanft in 4 mL Gleichgewicht Puffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M Harnstoff, 2 % (w/V) SDS, 20 % (V/V) Glycerin, 2 % w/V DVB-t (fügen Sie vor der Verwendung) zu reduzieren und eine Spur von Bromophenol blue).
    4. Equilibrate für 10 min durch sanft schaukelnden reduzierte IPG-Streifen in 4 mL Alkylierung Gleichgewicht Puffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M Harnstoff, 2 % (w/V) SDS, 20 % (V/V) Glycerin, 2,5 % w/V Iodoacetamide (fügen Sie vor der Verwendung), und eine Spur von Bromophenol blue).
    5. Während Gel Gleichgewicht zerlegen Sie Multicasting Kammer zu, und nehmen Sie die vorbereitete Lösung von Gel-Kassette. Spülen Sie 3 X mit DdH2O. Entfernen Sie überschüssige DdH2O mit einem unlöslichen Papiertuch, und in einem Gel-Stander.
    6. Die äquilibriert IPG-Streifen mit Elektrophorese Puffer spülen und überschüssige Flüssigkeit auf der IPG Bandoberfläche mit unlöslichen Papiertuch entfernen.
    7. IPG-Streifen auf die Lösung von SDS-PAGE-Gel, und lassen Sie die IPG-Streifen Kunststoffseite länger Glasplatte und das Spitze Ende nach links wenden Sie sich an.
    8. Gießen Sie 3-4 mL heißen 1 % Agarose im SDS-Elektrophorese Puffer (~ 80 ° C) schnell zu versiegeln den IPG-Streifen auf der Oberseite jedes SDS-PAGE-Gel, setzen Sie die Oberseite des IPG-Streifen auf der Spitze der kürzeren Glasplatte blasenfrei und dann für 10 min polymerisieren.
    9. Legen Sie die montierte Gel Kassette vertikal zwischen Kunststoff Dichtungen in der vertikalen Elektrophorese-System. Setzen Sie die Spitze des Gels mit der IPG-Streifen neben der Kathode (−).
    10. Der Pegel der Elektrophorese Puffer, die Gel-Kassette einzutauchen.
    11. Verbinden und Power Supply/Control Unit in konstanter Spannungsmodus gesetzt, und während der Überwachung des Farbstoffs bei 200 V für ca. 370 min. laufen.
    12. Nach der Ausführung der Gel-Kassette aus dem Elektrophorese-System, herausnehmen Sie vorsichtig und das Gel aus der Gel-Kassette, reißen das Gel, gefolgt von Anfärbung der Proteine 2DE getrennt zu vermeiden.
  3. Färbung von Proteinen 2DE getrennt
    1. Silberne Färbung
      1. Übertragen Sie sanft das Gel mit beiden Händen in einer Schale mit 250 mL Fixierung-Lösung (50 % Methanol (V/V) und 5 % (V/V) Essigsäure) zu, und schütteln Sie das Gel für 20 min.
      2. Verwerfen Sie die Lösung zu und fügen Sie 250 mL 50 % (V/V) Methanol in das Fach und für 10 min schütteln.
      3. Verwerfen Sie Methanol zu und 250 mL DdH2O in das Fach. 10 min schütteln Sie sanft.
      4. Schütteln Sie das Gel für 1 min in 250 mL Sensibilisierung Puffer mit 0,02 % (w/V) Natriumthiosulfat, und verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      5. Schütteln Sie das Gel in 250 mL DdH2O für 1 min (Wiederholung noch einmal). Verwerfen Sie die Flüssigkeit nach jedem Schritt.
      6. Schütteln Sie das Gel für 20 min in 250 mL Silber-Reaktion-Lösung (0,1 % (w/V) Silbernitrat mit 200 µL 37 % (V/V) Formaldehyd hinzugefügt vor Gebrauch).
      7. Schütteln Sie das Gel in 250 mL DdH2O für 1 min (Wiederholung noch einmal). Verwerfen Sie die Flüssigkeit nach jedem Schritt.
      8. Schütteln das Gel sanft in 250 mL Entwicklungslösung (3 % (w/V) Natriumcarbonat mit 100 µL 37 % (V/V) Formaldehyd hinzugefügt vor Gebrauch) bis die gewünschte Intensität der Färbung erhält (üblicherweise 1 bis 3 min), dann verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      9. Schütteln Sie das Gel für 10 min in 250 mL Lösung (5 % (V/V) Essigsäure) zu stoppen und verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      10. Schütteln für 5 min in 250 mL DdH2O und verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      11. Halten Sie das Gel in 250 mL Lösung von 8,8 % Glycerin bei 4 ° c lagern
    2. Coomassie brilliant blau Färbung
      1. Bereiten Sie Coomassie Färbelösung durch Auflösen von Coomassie brillant blue G250 0,3 g Ammoniumsulfat 25 g und Phosphorsäure 25 mL DdH2O und bis zu einem Gesamtvolumen von 200 mL. Vor der Verwendung, fügen Methanol 50 mL.
      2. 250 mL Färbelösung auf das Gel Coomassie hinzufügen und vorsichtig schütteln bei Raumtemperatur bis klare Proteinspots erscheinen (~ 2-4 h). Verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      3. 250 mL DdH2O und schütteln Sie langsam für 5 min, dann zweimal mehr. Verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      4. Geben Sie 250 mL Lösung entfärben (20 % (V/V) Ethanol zu) und schütteln Sie langsam zu, bis die Hintergrundfarbe fast farblos, und verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      5. Mit der frischen destaining Lösung zu ersetzen Sie, wenn das alte man dunkel wird, und verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      6. 250 mL DdH2O hinzugeben und langsam für 5 min. verwerfen die Flüssigkeit schütteln.
      7. Fügen Sie 250 mL Lösung (8,8 % Glycerin) zu speichern und bei 4 ° c halten
  4. Zweidimensionale Gel-Elektrophorese-Bildanalyse
    1. Digitalisieren Sie die gefärbten Gele mit einem Flachbettscanner.
    2. Geben Sie das Bild in 2D Gel-Bildanalysesystem.
    3. Erkennen und jeder Ort mit einem 2D Gel Bildanalyse-Software laut Protokoll des Herstellers zu quantifizieren.
    4. Passen Sie die Flecken zwischen verschiedenen Gele.

3. Identifizierung von 2DE getrennt Proteine mit MS

  1. Vorbereitung der tryptic Peptid-Mischung
    Hinweis: Silikonisierte oder Low-Aufbewahrungs-Röhren und Pipettenspitzen sollte verwendet werden, um den Verlust von Proteine oder Peptide zu vermeiden.
    1. Silber-Gel entfärben
      1. Schneiden Sie das Gel Flecken in einem 1,5 mL silikonisiert Rohr und in 500 µL DdH2O 6 Mal waschen.
      2. Die gewaschene Gel in eine neue 1,5 mL silikonisiert Röhre gesteckt, und in viele kleine Stücke hacken (0,5-1 mm-3).
      3. Destain Gel-Stücke in 20 µL der destaining Lösung, die ein Teil von 30 mM Kalium Ferricyanid und ein Teil der 100 mM Natriumthiosulfat (1:1) vor der Verwendung mischt, um die bräunliche Farbe (üblicherweise 1-2 min) verschwinden zu lassen. Verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      4. Die Gel-Stücke mit 20 µL des DdH2O 5 - 6 Mal zu waschen, die gelbe Farbe verschwinden zu lassen. Verwerfen Sie die Flüssigkeit nach jedem Schritt.
      5. Die Gel-Stücke 20 µL 200 mM Ammonium Bicarbonat hinzu, und bleiben für 20 min. Waschen die Gel-Stücke mit DdH2O (20 µL, 1 Mal). Verwerfen Sie die Flüssigkeit.
      6. Entwässern Sie die Gel-Stücke mit 30 µL Acetonitril mindestens zweimal um die Gel-Stücke eine Deckweiß und Vakuum-Zentrifuge für 30 min trocken machen zu lassen.
    2. Coomassie brilliant blau Gel entfärben
      1. Gel-Spots in ein 1,5 mL silikonisiert Rohr schneiden und waschen mit 500 µL DdH2O mindestens 3 Mal.
      2. Die gewaschene Gel in eine neue 1,5 mL silikonisierte Röhre gesteckt, und in mehrere Stücke hacken (0,5-1 mm-3) mit einer Pipettenspitze.
      3. Destain das Gel in 50-100 µL entfärben Lösung (1:1 V/V Mischung 200 mM NH4HCO3 mit Acetonitril) abhängig von dem Gel-Volumen, bei 37 ° C im Wasserbad inkubieren. Wiederholen Sie und fügen Sie frische entfärben Lösung, bis die Farbe verschwindet (~ 1 h). Verwerfen Sie die Flüssigkeit nach jedem Schritt.
      4. Waschen Sie die Gel-Stücke einmal mit 20 µL DdH2O.
      5. Entwässern Sie die Gel-Stücke in 100 µL Acetonitril (zweimal), die Gel-Stücke einem undurchsichtigen weißen drehen zu lassen.
      6. Vakuum für 30 Minuten trocken.
    3. Im Gel Trypsin-Verdauung der Proteine in den getrockneten Gel-Stücken
      1. 20 µg (833 Pmol) lyophilisierter Trypsin-Pulver in 100 µL 50 mM Essigsäure auflösen.
      2. Verdünnen Sie 20 µL Trypsin-Lösung (200 ng/µL), 16 ng/µL mit 230 µL 50 mM Ammonium Bicarbonat.
      3. Fügen Sie 20-30 µL (0,32-0,48 µg) der verdünnten Trypsin-Lösung für jedes Rohr mit getrockneten Gel Stück. 18-20 h in einem 37 ° C im Wasserbad inkubieren. Lassen Sie die Lösung bei 4 ° C für 30 min stehen.
      4. Zentrifugieren Sie sanft die Lösung für 10 S. Sonicate in einem Wasserbad für ca. 5-6 min. bei 30 ° C und dann bei 12.000 x g für 2 min zentrifugieren.
      5. Den Überstand mit tryptic Peptid-Mischung in eine 0,5 mL silikonisierte Röhre zu sammeln.
    4. Reinigung von tryptic Peptid-Mischung mit C18 Microcolumn.
      1. Waschen Sie jeden C18-Säule mit Acetonitril (10 µL, 5-Mal), und dann mit 50 % Acetonitril (10 µL, 5 Mal).
      2. Equilibrate mit 0,1 % trifluor Essigsäure (TFA) (10 µL, 5 Mal).
      3. Pipette die Probe rauf und runter durch die vorbereiteten C18-Säule, 15 Mal.
      4. Waschen Sie die Probe 2 X mit 10 µL 0.1 % TFA.
        Hinweis: Die gereinigten tryptic Peptide werden in der Spalte C18 beibehalten.
      5. Hinzufügen eines Datenträgers (6 µL) Lösung (85 % V/V acetonitrile/0.1% V/V Ameisensäure) in einem sauberen 0,5 mL silikonisierte Rohr, pipette diese Lösung vorsichtig und langsam rauf und runter durch Peptid-C18 Perlen für 10 X, waschen Sie die Anleihe Peptide in die Lösung an der Luft trocknen , und Store (−20 ° C) für MS-Analyse.
  2. MS-Analyse
    1. MALDI-MS PMF-Analyse
      1. Fügen Sie 4 µL von 85 % V/V acetonitrile/0.1% V/V TFA das gereinigte tryptic Peptid-Gemisch auflösen. Last 2 µL aufgelöst tryptic Peptid Mischung auf einen Teller MALDI und sofort hinzufügen 2 µL а-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA)-Lösung, die 10 g/L in Acetonitril 500 mL/L enthält 1 mL/L TFA, dann an der Luft trocknen.
      2. Laden Sie die MALDI-Platte mit tryptic Peptid-Mischung in ein MALDI-MS-Massenspektrometer.
        Hinweis: Geräteparameter sind legen Sie als Reflektor-Modus mit 20 kV Spannung, positiver Polarität und 160 ns Extraktion Verzögerungszeit zu beschleunigen. Jedes MS-Spektrum wird mit 200 Laserschüsse mit einer Reichweite von 1.000 bis 4.000 m/Z nach der externen Kalibrierung mit standard-Peptid erworben Masse.
      3. Verwenden Sie eine MS-Spektrum-Processing-Software, um jedes MS-Spektrum, einschließlich Basislinienkorrektur, Rauschunterdrückung (5 %) und Peak Deisotoping verarbeiten.
      4. Korrigieren Sie die Masse Liste von jedem MS-Spektrum mit der Beseitigung von kontaminierenden Massen von Trypsin, Matrix, Keratine und andere unbekannten Verunreinigungen parallel leer-Gel Experimente.
      5. Eingabe die korrigierte Masse Liste in eine PMF-basierte Protein Suche Software, um Proteine in der Swiss-Prot-Protein-Datenbank mit der folgenden Suchparameter, einschließlich PMF Suchtyp, menschlich, zu identifizieren Trypsin mit 1 maximale verpasst Spaltung, behoben Carbamidomethyl Cystein, Variable Methionin Oxidation, Monoisotopic, Peptid Masse Toleranz 50 ppm, Peptid kostenlos angeben (1 +) und Lärm (S/N) 5.0 signalisieren.
      6. Proteine zu identifizieren, mit statistisch signifikanten Protein Scores, und wo Gäste Protein =-10 × log(p), wo p ist die Wahrscheinlichkeit, dass die beobachteten Übereinstimmung ein zufälliges Ereignis ist.
    2. MALDI-MS/MS-Analyse
      1. Fügen Sie 4 µL 50 % V/V acetonitrile/0.1% V/V TFA das gereinigte tryptic Peptid-Gemisch auflösen. Jeder gereinigten tryptic Peptid-Mischung (0,5 µL) war auf einem 384-Well-MALDI-Platte entdeckt, sofort entdeckt 0,5 µL der gesättigten CHCA Matrix in 50 % acetonitrile/0.1% TFA auf der Oberseite der Peptid-Probe und dann an der Luft getrocknet.
      2. Lassen Sie die MALDI-TOF-TOF-MS/MS automatisch verwaltet werden mit 100 Laserschüsse auf einem MS1 Spektrum erwerben und sammeln 6 wiederholt MS1 Spektren in einem synthetischen MS1-Spektrum.
      3. 4 die meisten intensiven Vorläufer Ionen von jedem synthetischen MS1-Spektrum für MS/MS-Analyse gesetzt. Einsatz 100 Laserschüsse für jedes Ion Vorläufer einer MS/MS-Spektrum zu erwerben und ansammeln, 4 wiederholt MS/MS-Spektren in einem synthetischen MS/MS-Spektrum.
      4. Verwenden Sie die synthetischen MS/MS-Daten zur Proteine durch Protein ein MS/MS-basierte Software mit Parameter einschließlich MS/MS Ionen-Suche, menschliche Datenbank Swiss-Prot, Trypsin mit maximal 1 verpasste Spaltung, festen Carbamidomethyl (C), Variable Suche Suche Oxidation (M), Monoisotopic Masse Wert, Peptid Masse Toleranz ± 100 ppm und Fragment Masse Toleranz ± 0,7 Da.
      5. Identifizieren ein Proteins mit einer statistisch signifikanten Wahrscheinlichkeit basierend auf Mowse-Score und Ionen-Score =-10 x Log(P), wo p die Wahrscheinlichkeit ist, dass die beobachteten Übereinstimmung ein zufälliges Ereignis ist.
    3. LC-ESI-MS/MS-Analyse
      1. Fügen Sie 6 µL 5 % V/V acetonitrile/0.1% V/V Ameisensäure aufzulösen die gereinigten tryptic Peptid-Mischung hinzu.
      2. Verwendung ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-System mit einem Elektrospray-Ionisation (ESI) online gekoppelt-MS/MS Masse Spektrometer mit eine MS/MS-Daten erworben Management-Software den gesamten Betrieb zu verwalten.
      3. Verwenden Sie die C18-Trap-Säule (300 µm i.d. × 5 mm Länge), und umgekehrt-Phase C18 Säule (75 µm i.d. 15 cm Länge) mit einer Trennung Steigung bei 98 % Lösungsmittel (0,1 % Ameisensäure) und 2 % Lösungsmittel B (0,1 % Ameisensäure in 100 % Acetonitril) für 2 min , 2 % bis 40 % Lösungsmittel B für 45 min, 40 % bis 95 % Lösungsmittel B für 5 min und 95 % Lösungsmittel B für 10 min (insgesamt 65 min bei 300 nL/min).
      4. Positiv-Ionen und automatische Erhebung datenabhängiges Modus, MS und MS/MS Spektren zu erwerben, und Kollision-induzierte Dissoziation (CID) für Ionen-Fragmentierung festgelegt.
      5. Legen Sie jedem MS-Scan auf ein Massenbereich von 350-1.800 m/Z mit einer Auflösung von 100.000 bei m/Z 400. Durchführen Sie der Scan für die 7 die meisten intensiven Ionen in der MS-Scan.
      6. Verwendung MS/MS-basierte Protein Software Suche ich die Datenbank zur Identifizierung von Proteinen zu suchen.
        1. Wählen Sie die menschliche Protein-Datenbank.
        2. Wählen Sie Trypsin mit einem verpassten Spaltstelle erlaubt.
        3. Legen Sie Peptid Toleranz (±10 ppm), fragment Ionen-Toleranz (±0.8 Da), Peptid kostenlos (2 + 3 + und 4 +), feste Carbamidomethylation an Cystein und Variable Oxidation bei Methionin.
        4. Legen Sie false Discovery Rate (FDR) < 1 %, und nur die Peptide mit Rang 1 akzeptiert.
        5. Protein mit PSM≥1 identifizieren (PVSM: die Gesamtzahl der identifizierten Peptid-Sequenzen (PVSM) für das Protein, einschließlich derjenigen redundant identifiziert) und mindestens zwei einzigartige Peptide pro Protein.
      7. Verwenden Sie auch MS/MS-basierten Protein Suche Software II, um die Datenbank zur Identifizierung von Proteinen zu suchen.
        1. Konvertieren Sie die raw-MS-Datei in eine .mgf-Datei.
        2. Die menschliche Protein-Datenbank (uniprothuman_20161031.fasta enthält 70940 Sequenzen und 23897047 Rückstände) ausgewählt.
        3. Wählen Sie Trypsin-Verdauung mit einem Maximum von 2 verpasste Spaltungen.
        4. Satz, die feste Carbamidomethyl (C), Variable Deamidated (NQ) und Oxidation (M), Vorläufer Ionen-Masse Toleranz 10 ppm, Tochter Ion mass Toleranz 0,8 Da und Monoisotopic Peak.
        5. Identifizieren Sie Proteine mit einer Signifikanzschwelle von 0,05 und mindestens 2 einzigartige Peptide.

Ergebnisse

1. 2DE MALDI-MS-PMF: mit dem oben beschriebenen experimentellen Verfahren wurden insgesamt 150 µg Proteine aus FSH ausgedrückt NFPA Gewebe extrahiert (weiblich; 50 Jahre alt, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-) (+), FSH und TSH (-)) und bekleidet mit einem 18 cm IPG-Streifen (pH 3-10 NL) und ein Großformat-SDS-PAGE Gel, visualisiert mit silbernen Färbung. Wir erhalten eine reproduzierbare und gute 2DE Gel Muster der NFPA Gewebe Proteom (

Diskussion

2de, gepaart mit MS Methoden einschließlich 2DE-MS PMF und 2DE-MS/MS, erfolgreich eingesetzt in unserem langfristigen Programm - die Verwendung von Proteomics, menschliche NFPA Proteomic Variationen und molekulare Netzwerk Variationen für die Aufklärung der molekularen Mechanismen zu studieren und Entdeckung der effektive Biomarker für NFPAs. 2de basierte vergleichende Proteomik mit gute Reproduzierbarkeit spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung von NFPA Proteomic Variationen9,...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation von China (Grant Nr. 81572278 und 81272798 zur XZ), die Zuschüsse aus der Hunan, China "863" Plan-Projekt (Grant No. 2014AA020610-1, XZ) und die Xiangya Krankenhaus Fonds für Talent (XZ) unterstützt. Provinzielle Natural Science Foundation von China (Grant No. 14JJ7008, XZ). Die Autoren erkennen auch die wissenschaftliche Beiträge von Dr. Dominic M. Desiderio in der University of Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuierlich entwickelt und 2DE-MS-Methoden verwendet, um die Hypophyse Adenom Proteom ab 2001 zu analysieren, konzipiert das Konzept für das vorliegende Manuskript, schrieb das Manuskript überarbeitet, koordinierte die einschlägige Arbeit und war verantwortlich für die finanzielle Unterstützung und entsprechende Arbeit. YL beteiligte sich an der Überarbeitung des Manuskripts. YH teilgenommen Sammlung von Referenzen und Überarbeitung des Manuskripts. Alle Autoren genehmigt das endgültige Manuskript.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareisoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAThe vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHigh performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Insoluble paper towel
WatterMade by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizerBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gel image analysis software
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrum-processing software
Mascot softwarePMF-based protein searching software  
Mascot softwareMS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fastaHuman protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02) MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

Referenzen

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
  28. Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).

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