JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים דו-ממדית בג'ל (2DE) בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS) להפריד ולזהות פרוטאום רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי, אשר מציג תבנית לשחזור וטוב 2DE. חלבונים רבים שנצפו במקום כל 2DE בעת ניתוח סרטן מורכב פרוטאום עם השימוש של MS רגישות גבוהה.

Abstract

גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי (PA) הוא גידול נפוצה המתרחשת ב בלוטת יותרת המוח האנושי במערכות ציר היפותלמוס-יותרת המוח-ממוקד איברים, והוא עשוי להיות מסווגת כ- PA או פונקציונלי קלינית או מתפקד (FPA ו- NFPA). NFPA קשה לאבחון בשלב מוקדם וטיפול בשל בקושי היא מרוממת הורמונים בדם בהשוואה FPA. מטרתנו לטווח ארוך היא להשתמש בשיטות פרוטאומיקס כדי לגלות סמנים ביולוגיים אמין עבור הבהרה של המנגנונים המולקולריים הרשות הפלשתינית והכרה של סמנים אבחון, prognostic יעילה לבין מטרות טיפוליות. יעיל דו-ממדית בג'ל (2DE) בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה (MS) הוצגו כאן כדי לנתח את האדם proteomes הרשות הפלסטינית, כולל הכנת דוגמאות דו-ממדית בג'ל, חלבון ויזואליזציה, ניתוח תמונות, בג'ל עיכול טריפסין, פפטיד המוני טביעות אצבע (PMF) וטנדם מסה ספקטרומטר (MS/MS). 2-ממדי ג'ל אלקטרופורזה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS ופרוצדורות MS/MS 2DE נוזלי כרומטוגרפיה (LC) בהצלחה יושמו ניתוח של NFPA פרוטאום. עם השימוש של ספקטרומטר מסה רגישות גבוהה, חלבונים רבים זוהו עם שיטת 2DE-LC-MS/MS כל ג'ל 2D במקום ניתוח של רקמות מורכבות הרשות הפלסטינית כדי למקסם את הכיסוי של האדם פרוטאום הרשות הפלסטינית.

Introduction

הרשות הפלסטינית הוא גידול נפוצה המתרחשת ב בלוטת יותרת המוח האנושי במערכות ציר היפותלמוס-יותרת המוח-ממוקד איברים, ממלאים תפקיד חשוב במערכת האנדוקרינית האנושית. הרשות הפלסטינית כולל קלינית ולא פעולות PAs (FPA ו- NFPA)1,2. NFPA קשה לאבחון בשלב מוקדם, טיפול בגלל רמות ההורמונים רק מעט יותר גבוהה מהרגיל (למשל, LH ו- FSH) בדם בהשוואה FPA, המגדילה באופן משמעותי את רמות של הורמונים המתאימים דם3,4 ,5. ההבהרה של המנגנונים המולקולריים וגילוי של סמנים ביולוגיים יעיל יש משמעות קלינית חשוב באבחון, טיפול, ולאחר הפרוגנוזה של NFPA. מטרתנו לטווח ארוך היא לפתח להשתמש בשיטות פרוטיאומיה מבנית ללמוד NFPA גילוי סמנים ביולוגיים אמין כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שלה ושל לזהות מטרות טיפולית יעילה, כמו גם סמנים אבחון ו prognostic. 2-DE בשילוב עם שיטות MS היו בשימוש נרחב בתוכנית מחקר ארוך טווח שלנו לגבי האדם הרשות הפלסטינית פרוטאום1,2,6,7, כולל הקמת פרוטאום הפניה מפות3,8, ניתוח של חלבון באופן שונה ביטוי פרופילים9,10,11,12,13, הורמון גרסאות14 ,15, שינויים post-translational כגון זרחון14 וטירוזין ניטרציה16,17,18, הווריאציות פרוטיאומיה מבנית של פולשני יחסית NFPAs לא פולשנית19, והטרוגניות פרוטיאומיה מבנית של NFPA יחוברו13, אשר הוביל אל הגילוי של ריבוי רשתות מסלול חשוב (תפקוד מיטוכונדריאלי dysregulation מחזור התא, סטרס חמצוני, MAPK איתות מערכת חריגות) זה שונו ב- NFPA13,19,20.

2DE מפריד חלבונים על פי שלהם נקודה איזואלקטרית (pI) (לגירויי כאב תוך התמקדות, הפורום הישראלי לאנרגיה), משקל מולקולרי (באמצעות סודיום dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל, עמודים מרחביות)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. זוהי טכניקה קלאסית ומקובל ההפרדה בתחום פרוטאומיקס, מאז כניסתה של המושגים של פרוטאום ו פרוטאומיקס ב 199524. MS היא הטכניקה מכריע בשביל לגלות את זהותו של חלבונים מופרדת 2DE, כולל אסטרטגיות PMF ו- MS/MS. ההתפתחות המהירה מאוד של כלי MS, במיוחד בהיבטים של איתור רגישות ורזולוציה, בשילוב עם השיפור של מערכת LC, משפר באופן משמעותי את זהותו של חלבונים שפע נמוך או נמוך ביותר ב פרוטאום כדי למקסם סיקור פרוטאום. גם האתגרים שלנו מושגים מסורתיים שרק אחת או שני חלבונים הנמצאים במקום ניתוח של רקמות אנושיות מורכבות פרוטאום ג'ל דו-ממדי, ומספק הזדמנות לזהות חלבונים מרובים ב- 2D ג'ל במקום ניתוח של רקמות אנושיות מורכבות פרוטאום ולמקסם את הכיסוי של NFPA פרוטאום.

כאן נתאר הפרוטוקולים מפורט של PMF MS 2DE-MALDI, 2DE-MALDI MS/MS, ו 2DE-LC-MS/MS אשר שימשו בהצלחה בניתוח פרוטאום NFPA אנושי. הפרוטוקולים כוללים הכנה של דגימות, תחילה dimension (לגירויי כאב תוך התמקדות, הפורום הישראלי לאנרגיה), המימד השני (מרחביות-עמוד), ויזואליזציה של חלבונים (צביעת כסף, כחול Coomassie מכתים), ניתוח של ג'ל דו-ממדי, עיכול בג'ל טריפסין, תמונה טיהור של פפטידים tryptic, PMF, MS/MS מסד הנתונים כובש3,8,25,26. יתר על כן, פרוטוקול זה מתרגם בקלות לניתוח של אחרים proteomes רקמה אנושית.

Protocol

בפרוטוקול הנוכחי עוקב אחר הקווים המנחים של Xiangya חולים לרפואה אתיקה ועדת של אוניברסיטת דרום מרכז, סין. כובע ראש וכפפות לענידה במהלך כל התהליך ניסיוני למנוע זיהום קרטין מן העור והשיער8.

1. הכנת דוגמאות

  1. לאסוף רקמות הרשות הפלסטינית (0.2 - 0.5 מ ג) המחלקה הנוירוכירורגית. להקפיא מיידית בחנקן נוזלי, ולאחר מכן להעביר ל-80 מעלות לאחסון.
  2. להוסיף 2 מ של 0.9% NaCl במים מזוקקים יונים (ddH2O). השתמש פתרון זה. בקלילות לשטוף את הדם מפני השטח רקמות (3 x).
    הערה: ddH2O עם מוליכות 18.2 MΩ/ס מ משמש לאורך כל הפרוטוקול. חלק tissuemight יאבדו כאשר לשטוף את הדם מפני השטח של רקמה.
  3. הוסף אמצעי אחסון (10 מ"ל; 4 ° C) של הפתרון המכיל חומצה אצטית 2 מ' ו- 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol עבור כל 0.5 - 0.6 גרם של רקמת, homogenize (1 דקות, 13,000 סל ד, 4 ° C, 10 x) עם מהמגן רקמות, sonicate את homogenate עבור 20 s, lyophilize , ולאחסן ב −80 מעלות צלזיוס.
  4. למדוד בתוכן lyophilized חלבון, דגימות הומוגני באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) assay קיט.
    הערה: כימות BCA אינה כימות מוחלטת, תשונה התוצאה נמדד עם טכנאי שונים והסוכנת ניסיוני. ריכוז קבוע מדגם רגיל אמור לשמש לניסויים שונים. לכן, הסכום הסופי הטעינה של חלבונים עבור כל ג'ל 2D ייקבעו עם התמונה ברזולוציה טובה שהוכתמו כסף או מוכתם Coomassie בניסויים מעוצב מראש.
    1. להוסיף כ- 300 µg מדגם homogenized lyophilized לנפח אחד (282 µL) של חלבון-חילוץ מאגר (אוריאה שמונה מ' ו- 4% בחורים), ואחריו עומד על 2 h, sonicating באמבט מים במשך 5 דקות, סיבוב לשעה sonicating שוב באמבט מים במשך 5 דקות , מסתובב שוב עבור 1 h וה -צריך שתוציאו ב 15,000 g x עבור 20 דקות.
    2. להכין פתרונות סטנדרטיים BSA עם ריכוזים כאמור: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1500, 2000 µg/mL עם תקן BSA מסחרי (2 mg/mL).
    3. מיקס BCA ריאגנט A ו- B (A:B = 50:1) כפתרון BCA לעבוד לפני השימוש.
    4. להוסיף 0.1 מ"ל של המדגם או הפתרון תקן 2 מ של BCA הפתרון עובד בשפופרת microfuge, ואחריו ערבוב ולאחר מכן המקננת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בסופו של דבר מגניב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ולמדוד A562 nm ערך יתר.
    5. לחשב את קו ליניארי סטנדרטי (A562 nm לעומת ריכוז BSA) כדי לקבל את נוסחת הרגרסיה לחישוב החלבון דגימת תוכן עם ערך562nm .
  5. השתמש µg 150 של המדגם שווה ערך חלבון lyophilized תמורת כסף מכתים או 500 µg של חלבון עבור Coomassie מכתים, עבור pH קיבוע 18 ס מ מעבר צבע (IPG) מרצועת pH 3-10 לא לינארית (NL).
    הערה: רצועת יבשה IPG היא ליבה של wide בעובי של 3 מ מ 0.5-מ מ, באורכים שונים, כולל 7, 11, 13, 18 ו 24 ס מ, וטווחי pH שונים כולל pH 4-5, 4-7, 6-9, 3-10 או הדרגתי pH ליניארי או לא-ליניאריות. המאגר IPG המשמש חייב להתאים את רצועת27,28.
  6. 1.6.Add 250 µL של חילוץ מאגר (אוריאה שבעה מ', 2 מ' thiourea, 4% (w/v) חברים, 100 מ מ DTT (להוסיף לפני השימוש), pharmalyte v/v 0.5% (להוסיף לפני השימוש), ואת זכר bromophenol כחול).
  7. שמור את הפתרון מתחת 30 ° C, ואחריו vortexing במשך 5 דקות, sonicating במשך 5 דקות, וסיבוב למשך 50 דקות.
  8. להוסיף µL 110 מאגר התייבשות (אוריאה שבעה מ', 2 מ' thiourea, 4% (w/v) חברים, 60 מ מ DTT (להוסיף לפני השימוש), מאגר IPG וי/v 0.5% (להוסיף לפני השימוש), ואת זכר bromophenol כחול). Sonicate במשך 5 דקות. ואז לסובב את הדגימה למשך 50 דקות, מערבולת במשך 5 דקות, צנטריפוגה כעשרים דקות ב 15,000 x g.
  9. לאסוף את תגובת שיקוע (350 µL) ככל חלבון לדוגמה פתרון8.

2. אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל

  1. הפורום הישראלי לאנרגיה (ממד קודם): לבצע הציבורית על מערכת המיקוד לגירויי כאב כפי שמתואר להלן.
    1. להוסיף 350 µL של הפתרון לדוגמה חלבונים בתוך החריץ של בעל רצועת IPG 18 ס מ.
    2. את 18 ס מ IPG רצועת ג'ל לצד השני אל הפתרון מדגם חלבון (להימנע בועות).
    3. להוסיף 3-4 מ של שמן מינרלי כדי לכסות את רצועת IPG.
    4. להרכיב בעל רצועת IPG אל תוך התמקדות לגירויי כאב systemwith הקצה המחודד על הגב (+) הצלחת ועל קצה ריבוע על הלוח הקדמי (−).
    5. נתרענן לילה (~ 18 h בטמפרטורת החדר).
    6. קבע את הפרמטרים הציבורית: מקסימום 30 הנוכחי µA לכל רצועת, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, שלב והחזק; 1,000 V, צבע h 1, 500 Vh, 8,000 V, צבע h 1, 4,000 Vh, 8,000 V, 4 שעות, 32,000 Vh, שלב והחזק; . ו-500 V, 0.5 h, 250 Vh, שלב והחזק. . תן לזה לרוץ הזמן הכולל של 7.5 h ו- 36,875 Vh.
    7. לאחר הפורום הישראלי לאנרגיה, להוציא את כל רצועת IPG ולהסיר את שמן מינרלי נוסף מגבת נייר לא מסיסים. עכשיו עוטף רצועת גיליון של ניילון נצמד, ולאחסן ב −80 מעלות צלזיוס.
      הערה: בעל IPGstrip כדאי לנקות עם בעל IPGstrip ניקוי פתרון, מים מזוקקים.
  2. עמודים מרחביות (ממד השני): עמודים מרחביות לבצע מערכת אלקטרופורזה תאים אנכי
    הערה: כל גודל ג'ל מרחביות-דף צריך להיות 255 x 190 x 1 מ מ.
    1. השתמש גלגלית של ג'ל מרובה להטיל 12% דף לפתרון ג'לים. על הליהוק 12% דף ג ' לים, בצע את השלבים הבאים.
      1. להוסיף 270 מ של ddH2O, 150 מ ל 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8), 180 מ של 40% (w/v) אקרילאמיד/bisacrylamide פתרון מניות (29:1, 40% w/v אקרילאמיד ו- 1.38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 מ"ל של 10% קירור, ו 150 µL של TEMED כדי להפוך את הג'ל פתרון בתוך. לערבב בעדינות, להימנע בועות.
      2. שופכים את הפתרון ג'ל בעדינות לתוך תא בשידור לקבוצה עד הגובה הצפוי ג'ל (19 ס מ).
      3. מיד להוסיף 3 מ"ל ddH2O כל ג'ל פתרון כדי לכסות את ג'ל. תן את הג'ל פולימריזציה לשעה בערך.
    2. להכין 20 L מאגר אלקטרופורזה (25 מ מ טריס, גליצרין 192 מ"מ ו 0.1% מרחביות). למלא את מיכל מאגר אלקטרופורזה יחידת ההפרדה מאגר זה.
    3. להוציא את רצועות IPG ממוקד מהמקפיא, equilibrate את רצועות 10 דקות במוזיקת בעדינות ב 4 מ"ל של צמצום מאגר שיווי משקל (375 מ מ טריס-HCl (pH 8.8), אוריאה שישה מ', 2% (w/v) מרחביות, 20% (v/v) גליצרול, 2% w/v DTT (להוסיף לפני השימוש) ואת עקבות של bromophenol כחול).
    4. Equilibrate 10 דקות במוזיקת בעדינות את רצועות IPG מופחתת במאגר שיווי משקל 4 מ ל אלקילציה (375 מ"מ טריס-HCl (pH 8.8), אוריאה שישה מ', 2% (w/v) מרחביות, 20% (v/v) גליצרול, 2.5% w/v iodoacetamide (להוסיף לפני השימוש), ואת זכר bromophenol כחול).
    5. במהלך ג'ל שיווי משקל, לפרק את התא בשידור לקבוצה, תוציא את הקלטת ג'ל פתרון מוכן. לשטוף 3 x ב- ddH2O. הסר ddH עודף2O מגבת נייר לא מסיסים, ולשים על סטנדר ג'ל.
    6. לשטוף את רצועות IPG equilibrated עם מאגר אלקטרופורזה, ולהסיר עודפי נוזלים על פני רצועת IPG עם מגבת הנייר לא מסיסים.
    7. לשים על רצועת IPG על גבי הג'ל מרחביות-דף פתרון, והנח בצד פלסטיק של רצועת IPG קשר עם לוח הזכוכית יותר את הקצה המחודד משמאל.
    8. יוצקים 3-4 מ ל חם agarose 1% במאגר אלקטרופורזה מרחביות (~ 80 ° C) במהירות כדי לאטום את רצועת IPG בראש כל עמוד מרחביות ג'ל, לשים בצד העליון של רצועת IPG אל החלק העליון של לוח הזכוכית קצר ללא בועות, ואתה פולימריזציה ואז 10 דקות.
    9. הכנס את הקלטת ג'ל שהורכב אנכית בין פלסטיק אטמים במערכת אלקטרופורזה אנכי. החזיר את קודקוד הג'ל עם רצועת IPG ליד הקתודה (−).
    10. להתאים את רמת אלקטרופורזה מאגר לטבול את הקלטת ג'ל.
    11. להתחבר, הגדר את יחידת אספקת/בקרה כוח במצב מתח קבוע, ולהפעיל ב- 200 וולט למשך כ 370 דקות תוך מעקב אחר לצבוע.
    12. לאחר ריצה, תוציא את הקלטת ג'ל אלקטרופורזה מהמערכת ולאחר בעדינות להסיר את הג'ל בקלטת ג'ל, הימנעות קורע את הג'ל, ואחריו מכתים של חלבונים מופרד 2DE.
  3. צביעת החלבונים מופרדים 2DE
    1. צביעת כסף
      1. בעדינות להעביר את הג'ל עם שתי ידיים מגש המכיל 250 מ של פתרון קיבעון (50% מתנול (v/v), חומצה אצטית 5% (v/v)), ומנערים בעדינות את הג'ל במשך 20 דקות.
      2. למחוק את הפתרון, להוסיף 250 מ של 50% (v/v) מתנול במגש ומנערים בעדינות במשך 10 דקות.
      3. למחוק מתנול ולהוסיף 250 מ של ddH2O במגש. מנערים בעדינות במשך 10 דקות.
      4. בעדינות לנער את הג'ל על 1 דקות ב- 250 מ של רגישות עולה מאגר המכיל נתרן תיוסולפט 0.02% (w/v), ולמחוק את הנוזל.
      5. לנער בעדינות את הג'ל ב 250 מ של ddH2O עבור 1 דקות (אני חוזר עוד פעם אחת). למחוק את הנוזל אחרי כל שלב.
      6. לנער בעדינות את הג'ל במשך 20 דקות בתמיסה התגובה 250 מ ל כסוף (0.1% (w/v) כסף חנקתי עם 200 פורמלדהיד 37% (v/v) של µL, נוסף לפני השימוש).
      7. לנער בעדינות את הג'ל ב 250 מ של ddH2O עבור 1 דקות (אני חוזר עוד פעם אחת). למחוק את הנוזל אחרי כל שלב.
      8. לנער הג'ל בעדינות בפתרון פיתוח 250 מ ל (3% (w/v) נתרן פחמתי עם 100 µL 37% (v/v) פורמלדהיד נוסף לפני השימוש) עד העוצמה הרצויה של צביעת מתקבל (בדרך כלל 1-3 דקות), ואח כ לזרוק את הנוזל.
      9. בעדינות לנער את הג'ל במשך 10 דקות ב- 250 מ ל עוצר פתרון (חומצה אצטית 5% (v/v)) וזורקים את הנוזל.
      10. בעדינות לנער 5 דקות ב- 250 מ של ddH2O וזורקים את הנוזל.
      11. לשמור את הג'ל על 250 מ ל אחסון פתרון של 8.8% גליצרול ב 4 º C.
    2. Coomassie מכתים כחול מבריק
      1. להכין Coomassie מכתים פתרון על ידי המסת Coomassie מבריק כחול 0.3 g G250, אמוניום סולפט 25 גרם, חומצה זרחתית 25 מ ב- ddH2O ועד הנפח הכולל של 200 מ ל. לפני השימוש, להוסיף מתנול 50 מ ל.
      2. להוסיף 250 מ של Coomassie מכתים לפתרון הג'ל וללחוץ בעדינות בטמפרטורת החדר עד ברור מופיעים כתמים חלבון (~ 2-4 h). למחוק את הנוזל.
      3. להוסיף 250 מ של ddH2O ומנערים לאט במשך 5 דקות, ואז פעמיים נוספות. למחוק את הנוזל.
      4. להוסיף 250 מ של פתרון destaining (20% (v/v) אתנול) ומנערים לאט עד שצבע הרקע להיות כמעט חסר צבע, ולמחוק את הנוזל.
      5. החלף הפתרון destaining טריים כאשר הישן אחד מתחיל להחשיך, ולמחוק את הנוזל.
      6. להוסיף 250 מ של ddH2O ומנערים לאט במשך 5 דק. להשליך הנוזל.
      7. להוסיף 250 מ של אחסון פתרון (8.8% גליצרול) ולהשאיר ב 4 º C.
  4. ניתוח תמונות דו-ממדיות ג'ל אלקטרופורזה
    1. דיגיטייז את ג'לים ויטראז'ים עם סורק משטח אופקי.
    2. קלט את התמונה לתוך מערכת ניתוח תמונת ג'ל דו-ממדי.
    3. לזהות ולכמת בכל מקום באמצעות תוכנת ניתוח תמונת ג'ל דו-ממדי על פי הפרוטוקול של היצרן.
    4. להתאים את הנקודות בין ג'לים שונים.

3. זיהוי של חלבונים מופרדת 2DE עם MS

  1. הכנת תערובת פפטיד tryptic
    הערה: צינורות siliconized או נמוך-השמירה וטיפים פיפטה אמור לשמש כדי למנוע אובדן של חלבונים או פפטידים.
    1. כסף-ג'ל destaining
      1. לסלק את הג'ל כתמים לתוך siliconized 1.5 מ ל צינור, ולשטוף 500 µL ddH2O 6 פעמים.
      2. לשים את הג'ל שטף לתוך צינור 1.5 mL siliconized החדש, מינצ אותו לחתיכות קטנות רבות (0.5-1 מ מ3).
      3. Destain את השברים ג'ל 20 µL של הפתרון destaining שמשלב בין חלק ferricyanide אשלגן 30 מ מ, וחלק 100 מ מ נתרן תיוסולפט (1:1) לפני השימוש כי צבע חום נעלמים (בדרך כלל 1-2 דקות). למחוק את הנוזל.
      4. לשטוף את החלקים ג'ל עם 20 µL של ddH2O 5 - 6 פעמים כי צבע צהוב נעלמים. למחוק את הנוזל אחרי כל שלב.
      5. להוסיף חתיכות ג'ל µL 20 של 200 מ"מ אמוניום ביקרבונט, ולהישאר במשך 20 דקות לשטוף החלקים ג'ל עם ddH2O (20 µL, פעם 1). למחוק את הנוזל.
      6. מייבשים את חתיכות ג'ל עם acetonitrile 30 µL לפחות פעמיים כדי לאפשר את החלקים ג'ל להפוך של לבן אטום, ואת ואקום-צנטריפוגה יבש למשך 30 דקות.
    2. Coomassie ג'ל כחול מבריק destaining
      1. לחתוך ג'ל כתמים לתוך צינור 1.5 mL siliconized ולשטוף עם 500 µL ddH2O לפחות 3 פעמים.
      2. לשים את הג'ל שטף לתוך צינור siliconized 1.5-mL, מינצ זה מספר חתיכות (0.5-1 מ מ3) עם טיפ פיפטה.
      3. Destain את הג'ל בפתרון 50-100 µL destaining (1:1 v/v מיקס 200 מ"מ NH4HCO3 עם acetonitrile) בהתאם לנפח ג'ל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. חזור על ולהוסיף פתרון destaining טריים עד הצבע נעלם (~ 1 h). למחוק את הנוזל אחרי כל שלב.
      4. לשטוף את החלקים ג'ל פעם אחת עם 20 µL של ddH2O.
      5. מייבשים את השברים ג'ל 100 µL acetonitrile (לפחות פעמיים) לתת את החלקים ג'ל להלבין של אטום.
      6. אבק יבש למשך 30 דקות.
    3. בג'ל טריפסין עיכול החלבונים בתוך החלקים ג'ל מיובשים
      1. לפזר 20 µg (833 pmol) של אבקת טריפסין lyophilized 100 µL של חומצה אצטית 50 מ מ.
      2. למהול 20 µL של פתרון טריפסין (200 ng/µL) כדי 16 ng/µL עם µL 230 של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט.
      3. הוסף 20-30 µL (0.32 נקודות-0.48 µg) של הפתרון מדולל טריפסין כל שפופרת המכילה פיסות ג'ל מיובשים. תקופת דגירה של 18-20 ש ח בחודש 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים. תן את הפתרון לעמוד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      4. Centrifuge הפתרון בעדינות על 10 ס' Sonicate באמבט מים למשך 5-6 דקות ב 30 מעלות צלזיוס, ואז צנטריפוגה ב g x 12,000 למשך 2 דקות.
      5. לאסוף את תגובת שיקוע המכיל תערובת פפטיד tryptic לתוך צינור siliconized 0.5-mL.
    4. טיהור של פפטיד tryptic תערובת עם סי18 microcolumn.
      1. לשטוף כל עמודה סי18 עם acetonitrile (µL 10, 5 פעמים), ולאחר מכן עם 50% acetonitrile (µL 10, 5 פעמים).
      2. Equilibrate עם 0.1% trifluoro חומצה אצטית (TFA) (10 µL, 5 פעמים).
      3. Pipette המדגם למעלה ולמטה דרך העמודה סי18 מוכן עבור 15 פעמים.
      4. לשטוף את הדגימה 2 x עם 10 µL 0.1% TFA.
        הערה: פפטידים tryptic מטוהרים נשמרים בעמודה סי18.
      5. מוסיפים אמצעי אחסון (6 µL) פתרון (85% v/v acetonitrile/0.1% וי/v חומצה פורמית) צינור נקי 0.5-mL siliconized, pipette פתרון זה בעדינות, לאט לאט למעלה ולמטה באמצעות פפטיד-סי18 חרוזים x 10 לשטוף את פפטידים בונד לתוך הפתרון, מילה נהדרת. , חנות (−20 ° C) לניתוח MS.
  2. ניתוח MS
    1. ניתוח MALDI-MS PMF
      1. להוסיף 4 µL של 85% v/v acetonitrile/0.1% וי/v TFA כדי להמיס את התערובת פפטיד tryptic מטוהרים. עומס 2 תערובת של פפטיד tryptic µL התפרקה לצלחת MALDI ומיד להוסיף 2 µL של פתרון חומצה ריהאוס-cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA) המכילה 10 גרם/ליטר ב- 500 מ"ל/L acetonitrile 1 מ"ל/L TFA, ואז מילה נהדרת.
      2. לטעון את הצלחת MALDI עם פפטיד tryptic התערובת לתוך ספקטרומטר מסה MALDI-MS.
        הערה: הפרמטרים כלי מוגדרות כמצב המשקף עם 20 kV האצת מתח, קוטביות חיובית ולאחר זמן החילוץ של ההשהיה ns 160. כל ספקטרום MS היא רכשה עם 200 יריות לייזר עם מגוון של m/z 1000 עד 4,000 לאחר כיול חיצוני עם פפטיד סטנדרטי מסה.
      3. השתמש תוכנת עיבוד ספקטרום MS כדי לעבד כל ספקטרום MS, כולל תיקון בסיסי, הסרת רעש (5%) deisotoping שיא.
      4. תקן את רשימת המונית של כל ספקטרום MS עם ההסרה של ההמונים ההרסנית של טריפסין, מטריקס, keratins אחרים מזהמים לא ידוע במקביל הניסויים ריק-ג'ל.
      5. קלט המסה המתוקן רשימה לתוך חלבון מבוסס-PMF חיפוש תוכנה לזיהוי חלבונים במסד הנתונים של חלבון שוויצרי-פרוט עם הפרמטרים הבאים חיפוש, כולל PMF סוג חיפוש, אנושי, מחשוף טריפסין 1 המרבי פספס, קבוע ציסטאין carbamidomethyl, מתיונין משתנה חמצון, monoisotopic, פפטיד סובלנות המונים 50 ppm, תשלום פפטיד המדינה (1 +), אות רעש (S/N) 5.0.
      6. לזהות חלבונים עם חלבון סטטיסטית ציונים, איפה ניקוד חלבון =-10 × log(p), כאשר p הוא ההסתברות כי ההתאמה שנצפה הוא אירוע אקראי.
    2. ניתוח MALDI-MS/MS
      1. להוסיף 4 µL של 50% v/v acetonitrile/0.1% וי/v TFA כדי להמיס את התערובת פפטיד tryptic מטוהרים. כל תערובת פפטיד tryptic מטוהרים (0.5 µL) היה הבחין על צלחת MALDI 384-. טוב, מיד הבחין 0.5 µL של מטריקס CHCA רווי ב- 50% acetonitrile/0.1% TFA בראש המדגם פפטיד ולאחר מכן מיובש באוויר.
      2. . תן MALDI-תוף-תוף MS/MS תנוהל באופן אוטומטי, באמצעות 100 יריות לייזר לרכוש אחת ספקטרום MS1, וחזר צבירת 6 ספקטרה MS1 לתוך אחד ספקטרום MS1 סינתטי.
      3. ממוקם 4 יונים קודמן ביותר-אינטנסיבי של כל ספקטרום MS1 סינתטי לניתוח MS/MS. שימוש יריות לייזר 100 עבור כל יון קודמן לרכוש אחת ספקטרום MS/MS, ולצבור 4 חזר MS/MS ספקטרה לתוך בתנאי MS/MS סינתטי.
      4. השתמש את הנתונים MS/MS סינתטיים כדי לחפש חלבונים דרך חיפוש תוכנה עם פרמטרים כולל MS/MS יון חיפוש, שוויצרי-פרוט האנושי מסד נתונים, טריפסין עם מקסימום של 1 החמיץ המחשוף, carbamidomethyl קבוע (C), משתנה חלבון מבוססות MS/MS חמצון (ז), ערך המוני monoisotopic, פפטיד רגישות מסה ± 100 ppm, וקטע המוני סובלנות ± 0.7 Da.
      5. לזהות חלבון עם הסתברות סטטיסטית מבוססת על Mowse ציון, ציון יונים =-10 x Log(P), כאשר p הוא ההסתברות כי ההתאמה שנצפה הוא אירוע אקראי.
    3. ניתוח LC-ESI-MS/MS
      1. להוסיף 6 µL 5% acetonitrile/0.1% וי/v v/v חומצה פורמית כדי להמיס את התערובת פפטיד tryptic מטוהרים.
      2. שימוש מערכת ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) באינטרנט הבנויות יינון ספקטרומטריית electrospray (ESI)-MS/MS מסה ספקטרומטר עם תוכנה לניהול רכשה נתונים MS/MS כדי לנהל את המבצע כולו.
      3. השתמש סי18 מלכודת עמודה (300 µm זהות × 5 מ מ אורך), ו עמודה סי18 הפוכה-פאזי (75 µm זהות x 15 ס מ אורך) במילוי הדרגתי ההפרדה-98% ממס (חומצה פורמית 0.1%) ו- 2% ממס B (0.1% חומצה פורמית ב 100% acetonitrile) למשך 2 דקות , 2% עד 40% ממס B עבור 45 min, 40% עד 95% ממס B עבור 5 דקות ו- 95% ממס B עבור 10 דקות (סך של 65 דקות ב nL 300/דקה).
      4. הגדר מצב יון חיובי ומצב סקר אוטומטית נתונים תלויי כדי לרכוש ספקטרה MS ו- MS/MS ולהגדיר התנגשות-induced דיסוציאציה (CID) יון שאין בהם פיצול.
      5. הגדר כל סריקה MS מגוון מסה m/z 350-1,800 עם רזולוציה של 100,000- מ/z 400. ביצוע הסריקה עבור היונים רוב רגשניים 7 שבסריקה על MS.
      6. חלבון מבוססת על שימוש MS/MS חיפוש תוכנה אני לחפש את מסד הנתונים עבור זיהוי של חלבונים.
        1. בחר את מסד הנתונים של חלבון אנושי.
        2. בחר טריפסין עם אחד מחשוף שלא נענתה באתר מורשה.
        3. להגדיר סובלנות פפטיד (±10 ppm), קטע יון סובלנות (±0.8 Da), פפטיד תשלום (2 +, 3 +, 4 +), קבוע carbamidomethylation-ציסטאין, וחמצון משתנה-מתיונין.
        4. הגדרת גילוי שקר המחירים (פד) < 1% ורק פפטידים עם דרגה 1 מתקבלים.
        5. מזהים חלבון עם PSM≥1 (PSMs: המספר הכולל של פפטיד מזוהה רצפים (PSMs) עבור החלבון, כולל אלה שזוהו בחיבור יתיר) לפחות שני פפטידים ייחודי לכל חלבון.
      7. בנוסף, להשתמש מבוססות MS/MS חלבון-חיפוש תוכנה II כדי לחפש את מסד הנתונים עבור זיהוי של חלבונים.
        1. המר את קובץ MS raw לקובץ .mgf.
        2. נבחר את מסד הנתונים של חלבון אנושי (uniprothuman_20161031.fasta אשר מכיל רצפים 70940 משקעים 23897047).
        3. בחר טריפסין העיכול עם מקסימום של 2 אדמירל שלא נענתה.
        4. סט קבוע carbamidomethyl (ג), המשתנה deamidated (NQ), חמצון (ז), קודמן יון המוני סובלנות 10 עמודים לדקה, הבת יון המוני סובלנות 0.8 Da, שיא monoisotopic.
        5. זיהוי חלבונים עם סף מובהקות של 0.05, לפחות 2 פפטידים ייחודי.

תוצאות

1. 2DE-MALDI MS PMF: עם ההליך ניסיוני שתוארו לעיל, סכום כולל של 150 חלבונים µg חולצו רקמות NFPA הביע-FSH (נקבה; בן 50, זינק (-), GH (-), PRL (-), (-) LH, FSH (+), ו- TSH (-)) והציב עם 18 ס מ רצועת IPG (NL pH 3-10), ג'ל מרחביות עמודים בפורמט גדול, אז דמיינו צביעת כסף. השגנו דפוס ג'ל 2DE טוב הדירים פרוטאום רק...

Discussion

2DE, בשילוב עם שיטות MS כולל PMF 2DE-MS ו- 2DE-MS/MS, שימש בהצלחה בתוכנית שלנו לטווח ארוך - השימוש פרוטאומיקס ללמוד האנושי NFPA פרוטיאומיה מבנית וריאציות ווריאציות רשת מולקולרית עבור הבהרה של המנגנונים המולקולריים ו גילוי של סמנים ביולוגיים יעיל עבור NFPAs. מבוסס על 2DE פרוטאומיקס השוואתית עם הפארמצבטית טו...

Disclosures

המחברים מצהירים כי שאין התנגשות של אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (מענק מס ' 81572278 ו- 81272798 כדי XZ), המענקים של סין "863" תוכנית הפרוייקט (מענק מס ' 2014AA020610-1 כדי XZ), את הכספים בבית החולים Xiangya עבור הכישרון מבוא (XZ) של הונאן קרן מחוזי מדעי הטבע של סין (מענק מס 14JJ7008 כדי XZ). המחברים גם להכיר את התרומה המדעית של ד ר דומיניק מ Desiderio ב המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טנסי. X.Z. ברציפות פיתח, השתמשו בשיטות 2DE-MS כדי לנתח גידול בבלוטת יותרת המוח פרוטאום החל מ- 2001 הגה את הרעיון של היד, כתב, תוקן כתב היד, תיאם את העבודה הרלוונטי, היה אחראי תמיכה כספית, עבודה המתאימה. ובמקורות השתתפו תיקון של כתב היד. Y.H השתתף אוסף של הפניות, ובחינה של כתב היד. כל המחברים אישרה את כתב היד הסופי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareisoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAThe vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHigh performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Insoluble paper towel
WatterMade by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizerBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gel image analysis software
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrum-processing software
Mascot softwarePMF-based protein searching software  
Mascot softwareMS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fastaHuman protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339) MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02) MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
  28. Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134CoomassiePMFMS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved