Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Resumen

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Resumen

La avispa joya Nasonia vitripennis ha surgido como un sistema modelo eficaz para el estudio de procesos incluyendo la determinación del sexo determinación sexual haplo-diploide, síntesis del veneno y las interacciones huésped-simbionte, entre otros. Una limitación importante de trabajar con este organismo es la falta de protocolos efectivos para llevar a cabo la modificación dirigida del genoma. Una parte importante de la modificación del genoma es la entrega de reactivos, incluyendo las moléculas CRISPR/Cas9, en embriones mediante microinyección de edición. Si bien microinyección está bien establecido en muchos organismos modelo, esta técnica es particularmente desafiante para llevar a cabo en N. vitripennis principalmente debido a su tamaño pequeño embrión y el hecho de que el desarrollo embrionario ocurre enteramente dentro un pupa pupa parasitada. El siguiente procedimiento supera estos retos importantes y demostrando un procedimiento ágil y visual para efectivamente eliminar embriones avispa de parasitados pupas host, microinjecting, cuidadosamente trasplantarlos de nuevo en el host para la continuación y finalización del desarrollo. Este protocolo fuertemente mejorará la capacidad de grupos de investigación para llevar a cabo modificaciones avanzadas del genoma de este organismo.

Introducción

La avispa joya, N. vitripennis, es una de las cuatro especies dentro del género Nasonia que son ectoparasitoides de carne comer moscas como Sarcophaga sellada¹. Debido a sus períodos generacional rápido, facilidad de cría en el laboratorio y una gama de atributos biológicos únicos e importantes, N. vitripennis ha sido un foco para el desarrollo de múltiples herramientas experimentales en organismos modelo tradicional . Por ejemplo, algunos atributos biológicos únicos incluyen un sistema de reproducción de haplo-diploide², una relación con parásitos microbiana y genética^3,4y un supernumerario (B) cromosoma^{5,6 ,7}. Tomados juntos, estos hacen N. vitripennis un importante sistema experimental para experimentos destinados a dilucidar los aspectos celulares y moleculares de estos procesos, además de otras como veneno producción^{8, 9}, de^10,de determinación de sexo¹¹y evolución y desarrollo del eje patrón formación^12,13,14. Además, el kit de herramientas genética para el estudio de la biología de N. vitripennis ha aumentado dramáticamente en la última década o así, con la secuenciación de un genoma de alta resolución¹⁵, varios genes estudios^16,17,18y el capacidad de alterar funcionalmente genes depender de ARN de interferencia (ARNi)^19,20, que juntos han mejorado las capacidades de realizar genética reversa en este organismo y maleabilidad.

A pesar de los muchos importantes los avances científicos y herramientas ampliado en este organismo, a partir del conocimiento presente sólo un grupo ha realizado con éxito microinyecciones embrionarias para generar el genoma hereditario modificaciones²¹. Esto es principalmente debido a las dificultades de trabajar con embriones de N. vitripennis , ya que son bastante frágiles y pequeñas, siendo ~2/3 el tamaño de los embriones de Drosophila melanogaster , que generalmente dificulta manipular. Además, N. vitripennis hembras depositan sus huevos en las pupas de moscas de carne previamente picado, dentro de la cual la totalidad de la embriogénesis, larval y el desarrollo pupal ocurre. Por lo tanto, para microinjertos exitosos, blastoderm previa etapa, embriones deben ser eficientemente recogidos en pupas de host, rápidamente microinyectados y se trasplanta inmediatamente hacia sus anfitriones para el desarrollo. Estos pasos requieren precisión y destreza para evitar dañar los embriones microinyectados, los anfitriones pupas, haciendo la técnica excepcionalmente difícil. No obstante, existe un protocolo corto publicado hace más de una década que describe N. vitripennis embrión microinyección²². Sin embargo, este procedimiento requiere que se secan por los embriones recién puestos, utiliza cinta adhesiva para la fijación de los huevos para microinyección y no incluye una demostración de la técnica. Por lo tanto, se describe aquí es un protocolo actualizado y revisado, incluyendo un procedimiento visual, detallando un mejor protocolo paso a paso para N. vitripennis microinyecciones de embriones que pueden ser seguidos por cualquier laboratorio básico para generar el genoma hereditario modificaciones en este insecto modelo importante.

Protocolo

1. N. Vitripennis Colonia cría

1. Establecer varias colonias (~ 3-5) mediante la colocación de 200-500 N. vitripennis adultos (con una relación 3:1 hembra: macho) en jaulas compartidas de errores.
   Nota: Alternativa al uso de dormitorios de error, las avispas también puede ser propagado en múltiples, tubos de ensayo de vidrio tapados con algodón con aproximadamente 15-20 avispas/vial.
   1. Mantener las avispas a 25 ± 1 ° C con humedad relativa de 30% y un 12:12 luz oscura ciclo de alimentarlo cada día con pequeñas gotitas de 1:10 (v/v) solución de sacarosa y agua.
      Nota: Propagación de las colonias de avispas y colecciones puede también realizarse a temperatura ambiente sin humedad controlada; sin embargo, las temperaturas inferiores a 25 ° C bajará un poco el momento del desarrollo de los embriones.
2. Permiten a las avispas para aparearse durante al menos 4 días antes de las inyecciones.
   1. Durante los primeros dos días, permitir que las hembras acopladas a la alimentación en fresco S. modificaba pupas, así como pequeñas gotitas de un 1:10 (v/v) solución de sacarosa y agua.
   2. Para los siguientes dos días, retire las pupas de moscas de carne para privar a las avispas hembra de un sitio de oviposición, haciéndolos muy grávida.

2. recogida y alineación de embriones en fase de pre-blastoderm N. Vitripennis

1. Permitir que las avispas que parasitan (ovipositan embriones) en jóvenes anfitriones (pupas deS. sellada ). Para mantener fresca el hosts, almacenar hosts en 4 ° C inmediatamente después de la obtención y sólo quitarlo cuando sea necesario.
   Nota: Jóvenes anfitriones pueden determinarse con una mosca de color rojo mientras que más viejos anfitriones tienen un pupario de color más oscuro (figura 1A).
   1. Lugar fresco individual S. modificaba pupas en un tapón de espuma con un hueco del tamaño de pupas a cortar el centro. Exponer sólo ~ 0,2 cm del extremo anterior (sitio recomendado: oviposición) del host para la máxima concentración de parasitismo y la colección embrionaria más fácil.
      Nota: El extremo anterior es redondeado, mientras que el extremo posterior es más grueso y contiene una 'cráter-como' apertura (figura 1B).
   2. Colocar pupas de host (aproximadamente 5 pupas de host por 100 avispas) en este arreglo en la caja y espere aproximadamente 45 minutos para permitir que las avispas que parasitan (figura 2- ii).
      Nota: Es muy importante que los embriones son tan jóvenes como sea posible, idealmente en la primera hora de ser ovipositaron, para asegurarse de que están en la etapa de pre-blastoderm. Viejos embriones (> 1,5 h) no se debe inyectar.
   3. Quitar hosts parasitados por recuperarlos a mano y suavemente cepillado/vuele cualquier avispas que reside. Reemplazarlos con los anfitriones frescos después de cada ~ 15 minutos para continuar recogiendo temprano en escena huevos durante las inyecciones.
2. Retire las huestes recién parasitadas de jaula a mano. Con un microscopio de disección, con unas pinzas, con cuidado retire el extremo posterior (0,4 cm) del pupario exterior (cáscara de la pupa) para exponer los huevos de N. vitripennis (figura 2- iii).
   Nota: Debe tenerse cuidado para evitar pinchar la piel pupal; Si esto sucede, la hemolinfa humedezca los embriones de la avispa, que serán muy difíciles de quitar para la microinyección.
3. Usar pegamento líquido para pegar un cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio limpio para preparar una diapositiva de alineación del embrión (figura 3).
   Nota: Se utiliza un adhesivo instantáneo de alto rendimiento para aumentar la fuerza y velocidad de sequía, sin embargo cualquier pegamento que puede mantener el cubreobjetos de la mudanza de la diapositiva es aceptable.
4. Sacando los embriones desde el host cuidadosamente con un pincel de punta fina mojado, asegurándose de no dañar la piel suave de la pupa del huésped.
   Nota: una ' selección de embriones,' que es esencialmente un medio de un par de pinzas ultrafinos, puede utilizarse en lugar de un pincel.
5. Transferencia de ~ 20 embriones uno por uno en la diapositiva, inmediatamente adyacente al lado del cubreobjetos con un pincel húmedo. Oriente el extremo anterior del embrión contra el borde de la cubierta de la diapositiva de manera que el extremo posterior de los embriones se apunta en la misma dirección (figura 2- iv). Esto permitirá una mayor precisión de inyección en la misma posición entre todos los embriones.
   Nota: Esta técnica mejorada requiere cinta adhesiva doble cara para fijar los embriones a la diapositiva como se describió anteriormente^21,22. Además, desecar los embriones, ni cubrir los huevos con el aceite de halocarburos durante la inyección tal como se describe anteriormente para el N. vitripennis embrión microinyección²².

3. la aguja de preparación de microinyecciones

1. Coloque un vidrio de aluminosilicato capilar en un extractor de aguja.
   Nota: Una buena aguja es crítica para el éxito N. vitripennis inyecciones de embriones. Las agujas de inyección deben tener un agudo y punta fina para permitir la fácil penetración a través del corion. Cuarzo y borosilicate capilares agujas también pueden ser utilizado (figura 4).
2. Establecer el calor 605, la velocidad a 130, el retraso a 80, la Tire a 70 y la presión a 500 en un extractor de aguja.
   Nota: Configuración del extractor de aguja adicional para tirar agujas de borosilicato y cuarzo puede verse en la tabla 1; los parámetros pueden variar de filamentos y tiradores diferentes.
3. Activar el botón de la aguja para crear la aguja correcta. Repita según sea necesario para la producción de múltiples agujas.
   Nota: Agujas tiradas pueden guardarse colocándolos en una placa de Petri que contiene un que paralelo varios rollos de arcilla de modeler comercial.
4. Bisel de la punta de la aguja ligeramente tocando la punta de la placa abrasivos de diamante alrededor de 10 s a 25 ° C (figura 2- iii).
   Nota: Las agujas de inyección aprovechar biselado por promover la entrada en los embriones con un daño mínimo al tiempo que simultáneamente mejora el flujo de regentes a través de la aguja.

4. embrión microinyección

1. Prepare la mezcla de inyección consistente en reactivos de modificación del genoma (por ejemplo, transposón + ayudante transposasa, o reactivos CRIPSR, etcetera) y mantenerlo en hielo.
2. Cargar la aguja de inyección con 2 μl de mezcla de inyección mediante consejos de microloader.
   Nota: La mezcla de inyección demostrada en el protocolo consiste en Guía de solo RNA (sgRNA) (s) y la proteína recombinante Cas9 mezclado en H₂O.
3. Colocar el portaobjetos de vidrio con los embriones alineados en el escenario de un microscopio compuesto.
4. Introduzca cuidadosamente la aguja en el extremo posterior del embrión con un ángulo vertical de 25-35 °.

Inyectar 1-5 pL de mezcla de inyección (2-10% aproximadamente del volumen del embrión) y asegúrese de que el embrión parece hincharse un poco, la mezcla se inyecta en ella (figura 2- iv).
Nota: Si se inyecta demasiada mezcla de inyección en el embrión puede reventar disipando el citoplasma del embrión. Además, mal biselado o roto demasiado grande de agujas con una apertura también puede causar ruptura del embrión.

1. Intente volver a biselado agujas si obstrucción ocurre. El citoplasma de embriones N. vitripennis es inusualmente viscosa y pegajosa, que conduce a la aguja frecuente obstrucción (inyecciones de 1/25).
   Nota: Es importante mantener los embriones húmedos durante el período de inyección añadiendo regularmente agua desionizada utilizando el pincel. La cantidad de agua en el pincel es clave para moverse embriones y alinear con facilidad. Demasiada agua los resultados en embriones de agua flotante y poco hace difícil moverse.
2. Inyecte ~ 20-40 huevos en un momento (debe tomar aproximadamente 10 minutos), luego se detiene. Transferir los huevos inyectados con un pincel mojado tocando ligeramente los huevos inyectados y colocarlos en un host. Luego continuar inyectando con una fresca recién puesta de huevos (> 1 h de edad).
   Nota: Idealmente este protocolo es más efectivo si una persona es continuamente recogiendo y alineación de huevos, mientras que otra persona es inyectar los componentes de modificación del genoma y transplante de embriones inyectados a pupas de host.

5. trasplante inyectado G₀ N. vitripennis embriones en Host Pre-stung

1. Coloque cuidadosamente los embriones inyectados de₀ G en un previamente picado S. modificaba pupas (figura 2- vi) con un pincel mojado después de la microinyección.
   Nota: Las pupas de host utilizadas para recolectar embriones de microinyección trabajará para ello. También, a pesar de un esfuerzo importante, actualmente no hay disponible dieta artificial que puede ser utilizado²².
   1. Coloque los embriones inyectados hasta 40 uno en un momento en un único host previamente picado para evitar hacinamiento y larvas de la competencia.
      Nota: La inyección puede causar daños a los embriones; descuidado trasplante de embriones inyectados a las pupas de host puede apretar la yema hacia fuera o el componente inyectado y conducen a la muerte de los embriones.
2. Colocar las pupas de host en una placa de Petri con papel filtro húmedo y bolas de algodón e incúbelos a 25 ° C con aproximadamente 70% de humedad hasta inyectados embriones eclosionan (aproximadamente 1-2 días) (figura 2- vii).
   Nota: Importante, los hosts pueden dejarse con un pelado pupario y N. vitripennis huevos se desarrollan normalmente hasta se incuban en una cámara humidificada (placa de Petri con papel filtro húmedo y bolas de algodón) para evitar la desecación. Incubar a temperatura ambiente y con la humedad de las bolas de algodón humedecido es suficiente en caso de que no se puede controlar la humedad.
3. Transferencia las pupas de anfitrión en una nueva placa de Petri en el 70% de humedad y 25^°C después de portilla de embriones₀ G.
   1. Monitorizar el host pupas y larvas de₀ G inyectadas diariamente. Si las pupas de host tienen un olor fétido, transferir las larvas inyectadas a nuevas pupas huésped sano.

6. detección de modificaciones del genoma

1. Eliminar cada N. vitripennis pupas del host usando un pincel fino o selección de embriones. Larvas de₀ G inyectadas deben pupate alrededor de 8 días después de la inyección.
2. Lugar cada pupa quitado en un frasco de cristal aislado tapados con algodón y permitir que emergen como adultos de₀ G, garantizando que las hembras nacidas sea virgen que ayudarán con cruces genéticos posteriores.
   Nota: Las hembras pueden ordenarse de machos por la longitud del ala: las hembras tienen alas más largas que se extienden más allá del perfil del cuerpo cuando está en el lado. Todos pupas hembras microinyectados pueden juntarse en un frasco tapado, y lo mismo se aplica a pupas masculinas.
3. Individuos de pantalla G₀ , después de la eclosión, o PCR o visualmente (si interrumpir un gen fenotípico). Por ejemplo, si CRISPR se utiliza para crear eliminaciones en un determinado gen y el gen interrumpido confiere un fenotipo visible, luego ordenar y mantener a las personas con una versión mutante del fenotipo afectado (figura 2- viii)²¹. Si, sin embargo, el gen afectado codifica para un fenotipo no visibles, como una mutante de un gen esencial, realizar un esquema de cruce (cross G₀ macho con hembra de tipo salvaje o Cruz G₀ hembra con macho tipo salvaje) para recuperar y pantalla para mutantes hereditarios a través de análisis de la letalidad o esterilidad.
   Nota: Similar a la D. melanogaster, N. vitripennis adultos puede ser inmovilizado por la exposición a CO₂ lo que permite la manipulación directa. Por otra parte, las hembras fecundadas dará lugar a crías macho haploide del 100%, por lo tanto, que una hembra fecundada mutante puede dar lugar a gran número de hombres mutantes que pueden utilizarse para el análisis posterior.
   Nota: Las mutaciones en genes esenciales debe ser guardado por el apareamiento sobreviviente G₀ inyectado hembras (presumiblemente heterozigótico para una mutación) a hombres de tipo salvaje; en este caso, la mitad de la progenie masculina de₁ G debe morir debido a la herencia de la mutación letal, mientras que la mitad de la progenie hembra G₁ serán portadores de la mortal.
4. Outcross G₀ adultos y progenie de₁ pantalla G para inserciones de transgenes mediante transgénesis marcadores si el objetivo es la transgénesis. Actualmente transgénesis queda demostrada en el N. vitripennis.

Resultados

Este protocolo proporciona directrices detalladas para la colonia de cría, colección pre-blastoderm embrión, alineación, microinyección y posterior trasplante después de la inyección y puede ser utilizado para la ingeniería del genoma eficiente en N. vitripennis. Como se muestra en la figura 2, la secuencia general de pasos para una exitosa microinyección en N. vitripennis incluyen: (i) permitir que adultos machos y hembras para aparearse (~ 4 días), (ii) suministro de pupas de mosca fresca host (S. modificaba) colocado en un tapón de espuma modificado a hembras fecundadas y permitiendo para la oviposición (~ 45 min), (iii) cuidadosamente pelando lejos la cutícula de pupas parasitadas host para exponer y recoger embriones en fase de pre-blastoderm de avispa (~ 15 min), (iv) alinear recogida embriones (~ 15 min), (v) microinjecting componentes de modificación del genoma en embriones (~ 15 min), cuidadosamente colocando embriones inyectados (vi) de nuevo en picado previamente hosts para permitir el correcto desarrollo (~ 15 min), y (vii) prevención de la deshidratación del embrión inyectado/host mediante la transferencia de en una cámara humidificada con aproximadamente 70% de humedad relativa (~ 15 min). Huéspedes parasitados luego se incuban durante aproximadamente 14 días permitir el desarrollo completo de N. vitripennis embriones. Una vez inyectado, adultos emergen desde el host (viii), aislaran, mate y les pantalla individualmente la presencia de mutaciones esperadas.

Para la penetración de la aguja efectiva y microinyección en embriones de N. vitripennis , se prueban varios tipos de agujas de capilar de vidrio con filamento incluyendo tipos de cuarzo, silicato y borosilicato. Se encuentra que la calidad de la aguja es crítica para evitar la rotura/taponamiento durante la inyección y para lograr altas tasas de ambos eficacia de supervivencia y transformación del embrión. Para cada tipo de vidrio, se desarrolló un protocolo eficaz para sacar las agujas para poder tener una deseado hipodérmica larga punta en forma eficaz para microinyección de embriones de N. vitripennis usando tiradores de diferentes Micropipetas (P-1000 y P-2000) (tabla 1 Figura 4).

Para optimizar el procedimiento, las tasas de supervivencia se miden después de la inyección de cantidades variables de componentes de modificación del genoma. Los componentes de modificación genoma utilizados aquí eran mixto guía RNAs y proteínas Cas9 para genoma mediada por CRISPR edición, que se demuestre previamente que funcionan bien en N. vitripennis²¹. Similar a lo que antes era divulgado aquí un sgRNA dirigidos al gene de cinabrio está diseñado y sintetizado. Por orientación e interrumpir este gen, se ve un cambio fenotípico fácilmente identificable en el color de los ojos del organismo^19,21. Una mezcla de inyección combinando una variedad de concentraciones de sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 y 320 ng/μL) con Cas9 proteína (0, 20, 40, 80, 160 y 320 ng/μL) se crea y se inyectan en embriones de tipo salvaje N. vitripennis. La tasa de supervivencia de los embriones inyectados es encontrada para ser dependiente de la dosis (tabla 2)²¹. La concentración creciente del sgRNA y Cas9 proteína a las tasas de disminución de la supervivencia (tabla 2), quizás debido a efectos off-target aditivos. Humedad alta (~ 70%) se encuentra también a ser importante para la supervivencia de embriones después del trasplante a los anfitriones, como humedad baja (~ 10%) resultaron en la muerte de 100% a todos los embriones inyectados.

Figura 1 . Preparación de pupas de host (S. modificaba) para N. vitripennis oviposición embrión. (A) Joven y viejo pupas de S. modificaba . Pupas de mayores tienen una cutícula más oscuro mientras que pupas más jóvenes tienen un tinte más rojizo a su cutícula. Pupas jóvenes son preferidos para maximizar la oviposición. Extremos anteriores y posteriores de las pupas se pueden distinguir también por un "cráter-como apertura en el extremo posterior, mientras que el extremo anterior llega a un punto redondeado. (B) preparación de pupa de Host (S. sellada) para la oviposición de embrión N. vitripennis . Insertando un tapón de espuma que ha tenido un pupas de las pupas de host tamaño agujero tallado hacia fuera. Tienen la parte posterior de la cara de pupas de host dentro del enchufe mientras que 0,2 cm del extremo anterior descubierto para permitir la máxima concentración de oviposición en el área anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Línea de tiempo para la creación de N. vitripennis mutantes por microinyección. Cronología de la colección de embriones N. vitripennis , CRISPR/Cas9 microinyección y procedimientos después de la inyección. Adultos de N. vitripennis podían aparearse en ausencia de un sitio de oviposición durante 4 días (). Después, un fresco, mosca de la carne host pupas, S. sellada, dentro de un tapón de espuma en cuanto a exponer sólo 0,5 cm del extremo posterior, se introdujo a las hembras grávidas por 45 min para permitir el parasitismo (ii). Al mismo tiempo materiales de inyección incluyendo agujas de microinyección y CRISPR/Cas9 componentes prepararon (iii). Los embriones fueron recogidos desde el host (iv), alineados (v) e inyectó CRISPR/Cas9 componentes (vi). Los embriones inyectados con cuidado se transfiere nuevamente a un host previamente picado (vii) y se incubaron hasta completamente desarrollados (14 días) (viii). Cuando los adultos emergieron, mutantes fueron defendidos para fenotipos esperados CRISPR/Cas9 inducida por mutaciones en el gene de la blanco (ix). El procedimiento completo generalmente toma 19 días para terminar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Portaobjetos de microscopio modificado para el revestimiento de los embriones. (A) A cubreobjetos. (B) una diapositiva del microscopio. (C) un dispositivo de alineación de embrión.Puede pegar un cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio a utilizar a los embriones de línea para la inyección. El propósito del cubreobjetos es actuar como un borde para permitir la fácil manipulación y guarnición de los embriones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 . Preparación de la aguja de inyección. (A) ejemplos de agujas de vidrio de aluminosilicato buenos y malos. (B) la punta de una aguja biselada unbeveled correctamente biselada y mal. Tubos capilares de vidrio de aluminosilicato fueron tirados usando un extractor de la micropipeta. Las puntas de aguja producido fueron entonces abrieron suavemente y refinaron con un beveler. La aguja biselada buena tiene una punta muy afilada, y la aguja biselada mala tiene una punta Roma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de capilar de vidrio	Modelo de extractor de aguja de Sutter	Calor	Filamento	Velocidad	Retardo de	Tire de	Presión
Cuarzo	P-2000	750	4	40	150	165	-
Aluminosilicato de	P-1000	605	-	130	80	70	500
Borosilicato	P-1000	450	-	130	80	70	500

Tabla 1. Configuración para extractor de aguja.
Nota: Ajuste de aguja puller variar de máquina a máquina por lo que cada laboratorio tendrá que optimizar sus propios ajustes de extractor de aguja. Esta tabla ha sido modificada de Li et al. ²¹

sgRNA-1	Cas9	Total embriones	Trasplante (10% humedad)	Trasplante (70% humedad)
			Las larvas sobrevivientes	Las larvas sobrevivientes	Adultos sobrevivientes
			Total (%)	Total (%)	♂	♀	Total (%)
Ninguna inyección	Ninguna inyección	100	94 (94)	96 (96)	66	26	92 (92)
Agua	Agua	100	0 (0)	78 (78)	44	32	76 (76)
20 ng/μl	20 ng/μl	100	0 (0)	74 (74)	34	34	68 (68)
40 ng/μl	40 ng/μl	100	0 (0)	67 (67)	30	32	62 (62)
80 ng/μl	80 ng/μl	100	0 (0)	53 (53)	24	22	46 (46)
160 ng/μl	160 ng/μl	100	0 (0)	41 (41)	16	22	38 (38)
320 ng/μl	320 ng/μl	100	0 (0)	25 (25)	10	10	20 (20)

Tabla 2. Tipos de inyección y trasplante supervivencia y mutagénesis basados en inyecciones de diferentes concentraciones de sgRNA y Cas9. Esta tabla se ha modificado de Li et al. ²¹

Discusión

La reciente secuenciación del genoma N. vitripennis ha desatado una importante necesidad de herramientas moleculares caracterizar funcionalmente genes desconocidos dentro de esta especie²³. El sistema CRISPR Cas9 y muchos otros genes herramientas de edición, han demostrado para ser valiosos en la investigación de las funciones del gene para un número de organismos²⁴. Sin embargo, para generar mutaciones heredables, estas herramientas requieren realizar microinyecciones de embrión. Por lo tanto, demostrado aquí es una técnica visual detallada que incluye una serie de innovaciones que permitan la eficiente N. vitripennis microinyecciones de embrión.

En general, esta técnica detallada ofrece una serie de innovaciones importantes, con respecto a los métodos existentes²³, que permiten eficiente N. vitripennis microinyecciones de embrión. Por ejemplo, para facilitar la rápida recolección de embriones, una herramienta de oviposición (tapón de espuma) es creada y utilizada para restringir la postura totalmente al extremo posterior del huésped (figura 1), que facilita enormemente la colección de numerosos embriones dentro de un corto período de tiempo. Técnicas para la cría de las colonias de avispas con un gran número para recoger el mayor número de huevos también mejoradas y definidas. Además, para acelerar la alineación del embrión, se desarrolla un dispositivo de alineación de embriones que permite embriones ser alineados e inyectado sin tener que utilizar cinta adhesiva doble cara para garantizar los embriones en el lugar (figura 3).

Además, se encuentra que al mantener los embriones húmedos con agua durante la inyección y no desecación los embriones o cubriéndolos con aceite mejorado las tasas de supervivencia. Además, varios tipos de vidrio capilar se prueban y se determinan parámetros para construir el perfectas agujas para microinyección N. vitripennis (tabla 1, figura 4). Por otra parte, microinyección siguiente, supervivencia embrionaria tarifas son capaces de aumentar considerablemente debido a incubar huevos inyectados en huéspedes previamente picados colocados en cámaras de alta humedad (70%). Estas innovaciones permiten un procedimiento más ágil y acertado de microinyección para N. vitripennis.

Pequeñas modificaciones en cuanto a aparatos de inyección y procedimientos de cría se pueden hacer en el presente Protocolo, dependiendo de las preferencias del usuario. Sin embargo, una serie de pasos críticos será esencial para generar con éxito mutantes en N. vitripennis. Por ejemplo, trabajando rápidamente para que los embriones inyectados son > 1 h old y asegurando que agujas de inyección están suficientemente afiladas minimizar el daño al embrión ambos serán esenciales. Si bien este protocolo debe ser eficaz para la generación de mutaciones en los genes de muchos (si no todos), una limitación importante es el requisito de CRIPSR/Cas9 dirigir una secuencia de PAM (NGG) que determinará la secuencia de destino.

En conclusión, esta técnica mejorada puede utilizarse para generar muchos tipos de modificaciones del genoma, tales como mutaciones, canceladuras y posiblemente incluso inserciones usando tecnologías CRIPSR/Cas9²¹o incluso transgénica inserciones para generar transgénicos N. vitripennis, que debe aceleran investigación funcional en este organismo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugdorm	Bugdorm	41515	Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes	Fisher Scientific	982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata	Carolina Insects	144440
Microelectrode Beveler	Sutter Instruments	BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)	Sutter Instruments	104E
Micromanipulator	World Precision Instruments	Kite R
Femtojet Express programmable microinjector	Eppendorf
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 or P-2000
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Compound Microscope	Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)	Sutter Instruments	BF100-58-10	Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs	JAECE	L800-B	Foam plugs
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3
Micro Cover glass	VWR	48366045
Adhesive	Aron Alpha	AA471	For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush	ZEM	2595
Ultra-fine tip forcep	Fisher Scientific	16-100-121
Femtotips Microloader tips	Fisher Scientific	E5242956003