Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Zusammenfassung

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Zusammenfassung

Die Juwel-Wespe Nasonia Vitripennis hat als ein wirksames Modell-System für die Untersuchung von Prozessen einschließlich Geschlechtsbestimmung, Haplo-diploiden Geschlechtsbestimmung, Venom Synthese und Host-Symbionten Interaktionen, unter anderem entstanden. Eine große Einschränkung der Arbeit mit diesem Organismus ist der Mangel an effektiven Protokolle gerichtete Genom Änderungen durchführen. Ein wichtiger Teil des Genoms Modifikation ist die Lieferung von Reagenzien, einschließlich CRISPR/Cas9 Moleküle zu Embryonen durch Mikroinjektion bearbeiten. Mikroinjektion in vielen Modellorganismen etabliert ist, diese Technik ist besonders schwierig, in N. Vitripennis durchzuführen, vor allem aufgrund seiner kleinen Embryo Größe und der Tatsache, dass embryonale Entwicklung völlig innen tritt ein parasitierte Schmeißfliege Puppe. Das folgende Verfahren überwindet diese bedeutenden Herausforderungen während demonstriert ein schlanke, visuelle Verfahren effektiv entfernen Wespe Embryonen von Host-Puppen, microinjecting, parasitiert und sorgfältig verpflanzen sie zurück in den host für die Fortsetzung und Abschluss der Entwicklung. Dieses Protokoll wird die Fähigkeit der Forschungsgruppen, führen Sie erweiterte Genom Änderungen in diesem Organismus stark verbessern.

Einleitung

Die Juwel-Wespe, N. Vitripennis, ist eines der vier Arten innerhalb der Gattung Nasonia , die Ectoparasitoids von Fleisch essen fliegen wie Sarcophaga Bullata¹. Aufgrund ihrer schnellen Generationswechsel, Leichtigkeit der Aufzucht im Labor und eine Reihe von einzigartigen und wichtige biologische Eigenschaften, wurde N. Vitripennis ein Fokus für die Entwicklung von experimentellen Mehrfachwerkzeuge gefunden in traditionellen Modellorganismen . Beispielsweise enthalten einige einzigartige biologische Attribute ein Haplo-diploiden Reproduktion System², eine Beziehung mit mikrobiellen und genetische Parasiten^3,4und (B) überzähligen Chromosoms^{5,6 ,7}. Zusammengenommen machen diese N. Vitripennis ein wichtiges experimentelle System für Experimente zur Aufklärung der molekularen und zellulären Aspekte dieser Prozesse, neben anderem Venom Produktion^{8, 9}, Geschlecht Bestimmung^10,11, und Evolution und Entwicklung der Achse Muster Bildung^12,13,14. Darüber hinaus das genetische Toolkit, die Biologie des Nzu studieren. Vitripennis hat im letzten Jahrzehnt dramatisch zugenommen oder mehrere Genexpression Studien also, mit der Sequenzierung eines hochauflösenden Genom-¹⁵,^16,17,18, und die Fähigkeit, funktionell stören Genexpression unter Berufung auf RNA-Interferenz (RNAi)^19,20, die haben zusammen die Lenkbarkeit und die Möglichkeiten der Durchführung reverse Genetik in diesem Organismus verbessert.

Trotz der vielen wichtigen wissenschaftlichen Fortschritte und erweiterte Toolkits in diesem Organismus hat nur eine Gruppe ab dem heutigen Stand unserer Kenntnisse erfolgreich embryonale Mikroinjektionen vererbbar Genom Änderungen²¹generieren durchgeführt. Dies ist in erster Linie aufgrund der Schwierigkeiten bei der Arbeit mit Embryonen von N. Vitripennis sind sehr zerbrechlich und klein, als ~2/3 so groß wie von Drosophila Melanogaster Embryonen, so dass sie in der Regel schwer zu manipulieren. Darüber hinaus einzahlen N. Vitripennis Weibchen Eiablage auf bereits gestochen Schmeißfliege Puppen, innerhalb, die derer die Gesamtheit der Embryogenese, Larven, und pupal Entwicklung tritt. Daher müssen für erfolgreiche Mikroinjektionen, Pre-Blastoderm Bühne, Embryonen effizient Host Puppen, schnell mikroinjiziert, und sofort wieder in ihre Wirte für Entwicklung verpflanzt abgeholt werden. Diese Schritte erfordern Präzision und Geschicklichkeit zu beschädigen die microinjected Embryonen oder die pupal Gastgeber, machen die Technik besonders anspruchsvoll. Dennoch gibt es ein kurzes Protokoll veröffentlicht vor über einem Jahrzehnt, das N. Vitripennis Embryo Mikroinjektion²²beschreibt. Jedoch dieses Verfahren setzt voraus, dass die frisch gelegten Embryonen ausgetrocknet werden, es verwendet Klebeband um den Eiern für die Mikroinjektion zu verankern, und beinhaltet keine visuelle Demonstration der Technik. Daher ist hier beschrieben, eine aktualisierte und überarbeitete Protokoll, einschließlich eines optischen Verfahrens, Detaillierung eines verbesserten Schritt für Schritt Protokoll für N. Vitripennis Embryo Mikroinjektionen, die von jedem grundlegenden Labor, vererbbare Genom zu generieren verfolgt werden kann Änderungen in dieser wichtigen Vorbild Insekt.

Protokoll

1. N. Vitripennis Kolonie Aufzucht

1. Richten Sie mehrere Kolonien (~ 3-5) indem man 200-500 N. Vitripennis Erwachsene (mit 3:1 Verhältnis weiblich: männlich) in Bug Wohnheim Käfige.
   Hinweis: Alternative zur Verwendung von Bug Schlafsäle, Wespen kann auch in mehrere, kleine Glas-Reagenzgläser mit Baumwolle mit ca. 15-20 Wespen/Vial eingesteckt vermehrt werden.
   1. Pflegen die Wespen bei 25 ± 1 ° C mit 30 % Relative Luftfeuchtigkeit und ein 12:12 Licht-dunklen Zyklus, füttern sie täglich mit kleinen Tröpfchen von 01:10 (V/V) Saccharose/Wasser-Lösung.
      Hinweis: Ausbreitung der Wespe Kolonien und Sammlungen kann auch ohne kontrollierte Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur durchgeführt werden; jedoch niedrigere Temperaturen als 25 ° C das entwicklungspolitische Timing der Embryonen etwas niedriger wird.
2. Können Sie Wespen für mindestens 4 Tage vor Injektionen zu Paaren.
   1. Für die ersten zwei Tage ermöglichen begatteten Weibchen ernähren sich von frisch S. Bullata Puppen, sowie kleine Tröpfchen von einem 01:10 (V/V) Saccharose/Wasser-Lösung.
   2. Entfernen Sie für die folgenden zwei Tage die Schmeißfliege Puppen die weibliche Wespen einer Eiablage-Website, so dass sie sehr trächtigen zu berauben.

2. Erhebung und die Ausrichtung des N. Vitripennis Pre Blastoderm Embryonen

1. Weibliche Wespen zu parasitieren erlauben (oviposit Embryonen) in jungen Gastgeber (S. Bullata Puppen). Um Gastgeber frisch, speichern Sie Gastgeber in 4 ° C sofort nach Erhalt sie und nur entfernen Sie, wenn benötigt.
   Hinweis: Jungen Gastgeber können bestimmt werden, indem er einen roten farbigen Puppenkammer während älteren Hosts einen dunkleren farbigen Puppenkammer (Abbildung 1A haben).
   1. Legen Sie individuelle frisch S. Bullata Puppen in einem Schaum Stopfen mit einem Puppen-Größe Loch in der Mitte geschnitten. Setzen Sie nur ~ 0,2 cm vom vorderen Ende (bevorzugte Eiablage Website) des Hosts für maximale Konzentration der Parasitierung und einfacher Embryo-Sammlung.
      Hinweis: Das vordere Ende ist gerundet, während das hintere Ende dicker ist und eine "Krater-ähnliche" Öffnung (Abb. 1 b enthält).
   2. Setzen Sie Host-Puppen (etwa 5 Host-Puppen pro 100 Wespen) in dieser Anordnung in den Käfig und warten Sie etwa 45 min um Wespen zu ihnen (Abbildung 2- Ii) parasitieren zu ermöglichen.
      Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass die Embryonen so früh wie möglich, idealerweise innerhalb der ersten Stunde sind des oviposited wird, um sicherzustellen, dass sie in der Pre-Blastoderm Bühne. Alten Embryonen (> 1,5 h) darf nicht injiziert werden.
   3. Entfernen Sie parasitierte Gastgeber, indem sie eigenhändig und sanft Bürsten/Abblasen ansässigen Wespen abzurufen. Ersetzen Sie diese durch frische Gastgeber nach jeder ~ 15 min weiter sammeln von Eiern während Injektionen früh inszeniert.
2. Entfernen Sie die frisch parasitierte Gastgeber aus Käfig von hand. Ziehen Sie unter dem sezierenden Mikroskop mit Pinzette vorsichtig entfernt das hintere Ende (0,4 cm) von außen Puppenkammer (pupal Shell), N. Vitripennis Eiern (Abbildung 2- Iii) verfügbar zu machen.
   Hinweis: Vorsicht ist geboten, um zu vermeiden, die pupal Haut durchstechen; in diesem Fall wird die Hämolymphe die Wespe Embryonen, befeuchten Sie die sehr schwer zu entfernen für die Mikroinjektion werden.
3. Verwenden Sie flüssigen Klebstoff, kleben Sie ein Deckglas auf einen sauberen Objektträger eine Embryo Ausrichtung Folie (Abbildung 3) vorzubereiten.
   Hinweis: Ein Hochleistungs-Sekundenkleber wird verwendet, um die Klebkraft zu erhöhen und Trocknung Geschwindigkeit, aber keinen Kleber, die das Deckglas davon abhalten kann, bewegen sich auf der Folie ist akzeptabel.
4. Vertröstet die Embryonen vom Host sorgfältig mit einem nassen Fine-Tip-Pinsel und achten Sie nicht auf die weichen pupal Haut des Wirtes schädigen.
   Hinweis: ein "Embryo zu wählen," das ist im Wesentlichen eine Hälfte eines Paares von ultrafeinen Zange statt einem Pinsel verwendet werden.
5. Übertragen ~ 20 Embryonen eins nach dem anderen auf der Folie, direkt an der Seite des Deckglases mit einem nassen Pinsel. Vordere Ende des Embryos gegen die Titeldia Rand zu orientieren, damit das hintere Ende der Embryonen in die gleiche Richtung (Abbildung 2- iv) gerichtet ist. Dies ermöglicht höhere Genauigkeit der Injektion in der gleichen Position unter allen Embryonen.
   Hinweis: Diese verbesserte Technik erfordert keine doppelseitigen Klebeband, Embryonen auf die Folie, wie zuvor beschrieben^21,22zu beheben. Darüber hinaus nicht auszutrocknen Sie Embryonen, oder decken Sie die Eiern mit Halocarbon Öl beim Einspritzen wie zuvor für N. Vitripennis Embryo Mikroinjektion²²beschrieben.

3. Nadel Vorbereitung für Mikroinjektionen

1. Legen Sie eine Kapillare Aluminosilikat-Glas in einem Nadel-Abzieher.
   Hinweis: Eine gute Nadel ist entscheidend für erfolgreiche N. Vitripennis Embryonen Injektionen. Die Injektionsnadeln sollte eine scharf und fein-Spitze zu leicht eindringen durch die Chorion haben. Quarz und Borosilikatglas Kapillare Nadeln können auch werden verwendet (Abbildung 4).
2. Soll die Hitze auf 605, die Geschwindigkeit auf 130, die Verzögerung auf 80, ziehen 70 und der Druck auf 500 auf eine Nadel-Abzieher.
   Hinweis: Zusätzliche Nadel Puller Einstellungen für das Ziehen von Quarz und Borosilikatglas Nadeln sehen in Tabelle 1; die Parameter können für verschiedene Abzieher und Filamente variieren.
3. Aktivieren Sie die Nadel Abzieher um die richtige Nadel zu erstellen. Wiederholen Sie gegebenenfalls für die Produktion von mehreren Nadeln.
   Hinweis: Gezogene Nadeln können gespeichert werden, indem man sie in eine Petrischale mit mehrere Parallel von kommerziellen Modellierer Ton Rollen.
4. Abschrägung die Nadelspitze durch leicht berühren die Spitze, die Schleifmittel Diamant-Platte ca. 10 s bei 25 ° C (Abbildung 2- Iii).
   Hinweis: Die Injektionsnadeln profitieren durch die Förderung der Einstieg in die Embryonen mit minimaler Beschädigung und verbessert gleichzeitig den Fluss des Regenten durch die Nadel abschrägen.

4. Embryo Mikroinjektion

1. Bereiten Sie die Injektion Mischung bestehend aus Genom Modifikation Reagenzien (z. B. Transposon + Helfer Transposase oder CRIPSR Reagenzien, etc.), und halten sie auf dem Eis.
2. Laden Sie die Injektionsnadel mit 2 µL des Injektierungsgemisches mithilfe Microloader Tipps.
   Hinweis: Die Injektion Mischung gezeigt, in das Protokoll besteht aus Einzel-Guide RNA (SgRNA) (s) und rekombinante Cas9 Eiweiß gemischt in H₂O.
3. Legen Sie die Glas-Folie mit den gefütterten Embryonen auf die Bühne eines Compound-Mikroskops.
4. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das hintere Ende des Embryos mit einem vertikalen Winkel von 25-35 °.

Injizieren Sie 1-5 pL des Injektierungsgemisches (ca. 2-10 % des Volumens der Embryo) zu und sicherzustellen Sie, dass der Embryo erscheint leicht anschwellen, da die Mischung hinein (Abbildung 2- iv) injiziert wird.
Hinweis: Wenn zu viel Injektierungsgemisches in den Embryo injiziert wird es bersten Zytoplasma vom Embryo zu zerstreuen. Zusätzlich, unsachgemäß abgeschrägt oder gebrochene Nadeln mit zu groß von eine Öffnung kann auch bersten Embryo.

1. Versuchen Sie erneut abschrägen Nadeln, wenn Verstopfung auftritt. Das Zytoplasma der N. Vitripennis Embryonen ist ungewöhnlich zähflüssig und klebrig, was zu häufigen Nadel verstopfen (1/25 Injektionen) führt.
   Hinweis: Es ist wichtig, die Embryonen während die Einspritzdauer feucht zu halten, indem Sie regelmäßig deionisiertes Wasser mit dem Pinsel. Die Menge des Wassers auf der Bürste ist der Schlüssel zu Embryonen bewegen und ausrichten mit Leichtigkeit. Zu viel Wasser führt zu Embryonen, die schwimmenden und zu wenig Wasser sie schwierig macht zu bewegen.
2. Injizieren ~ 20-40 Eiern zu einem Zeitpunkt (dauert ca. 10 min), dann stoppen. Übertragen Sie die injizierten Eizellen mit einem nassen Pinsel durch leichte Berührung die injizierten Eizellen und legen Sie sie in einen Wirt. Dann weiter Injektion wieder mit einem frischen neu Ladung von Eiern gelegt (> alt 1 h).
   Hinweis: Im Idealfall ist dieses Protokoll am effektivsten wenn eine Person ständig sammeln und Schlange, Eiern, während eine andere Person Injektion die Genom-Änderung-Komponenten und Umpflanzen injizierte Embryonen zu Host Puppen.

(5) Umpflanzen injiziert G₀ N. Vitripennis Embryonen auf Pre-stung Host

1. Legen Sie vorsichtig die injizierten G₀ Embryonen auf eine zuvor gestochen S. Bullata Puppen (Abbildung 2- vi) mit einem nassen Pinsel nach Mikroinjektion.
   Hinweis: Der Host-Puppen zum Sammeln von Embryonen für die Mikroinjektion verwendet werden zu diesem Zweck arbeiten. Auch, trotz erheblichen Aufwand gibt es derzeit keine verfügbar künstliche Ernährung, die verwendeten²²sein kann.
   1. Legen Sie bis zu 40 injizierte Embryonen eine zu einem Zeitpunkt auf einem bereits gestochen Host, Überbelegung und Larven Wettbewerb zu vermeiden.
      Hinweis: Injektion verursacht Schäden an den Embryonen; unvorsichtige Transplantation von injizierten Embryonen, die Host-Puppen kann drücken die injizierten Komponente oder das Eigelb, und zum Tod des Embryos führen.
2. Legen Sie die Host-Puppen in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier und Wattebällchen und inkubieren sie bei 25 ° C mit etwa 70 % Luftfeuchtigkeit, bis injizierte Embryonen schlüpfen (etwa 1 – 2 Tage) (Abbildung 2- Vii).
   Hinweis: Vor allem Gastgeber gelassen werden können mit einer geschälten Puppenkammer und N. Vitripennis Eiern entwickeln normalerweise so lange, wie sie in eine feuchte Kammer (Petrischale mit feuchtem Filterpapier und Watte) inkubiert werden, um Austrocknung zu verhindern. Inkubation bei Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit aus der feuchten Watte reicht, für den Fall, dass Feuchtigkeit nicht kontrolliert werden kann.
3. Übertragen Sie die Host-Puppen in eine neue Petrischale bei 70 % Luftfeuchtigkeit und 25^°C nach G₀ Embryonen schlüpfen.
   1. Überwachen Sie die Host-Puppen und injizierten G₀ Larven täglich. Wenn die Host-Puppen einen fauligen Geruch haben, übertragen Sie die injizierten Larven auf neue gesunde Host Puppen.

(6) Screening für Genom-Modifikationen

1. Entfernen Sie jede N. Vitripennis Puppen aus der Gastgeber mit einem feinen Pinsel oder Embryo Pick. Eingespritzte G₀ Larven sollten etwa 8 Tage Post Injektion verpuppen.
2. Legen Sie jedes entfernte Puppe in einer isolierten Glasfläschchen mit Baumwolle eingesteckt und lassen sie sich als G₀ Erwachsene, um sicherzustellen, dass die geschlüpften Weibchen Jungfrau sein werden die helfen, mit nachgeschalteten genetische kreuzen.
   Hinweis: Frauen können von Männern nach Flügellänge sortiert werden: Frauen haben längere Flügel, die über das Körperprofil als auf der Seite hinausgehen. Alle microinjected weiblichen Puppen können zusammen in einer verstopften Flasche platziert werden, und das gleiche gilt für männliche Puppen.
3. Bildschirm G₀ Personen nach Bewegungsapparate, indem entweder PCR oder optisch (wenn eine phänotypische gen stören). Zum Beispiel wenn CRISPR verwendet wird, um Löschungen in einem bestimmten gen zu erstellen und das gestörte gen einen sichtbaren Phänotyp verleiht, dann sortieren und halten Sie Personen mit einer mutierten Version des betroffenen Phänotyps (Abbildung 2- Viii)²¹. Wenn jedoch das betroffene gen für einen nicht sichtbaren Phänotyp, wie z. B. eine Mutante des wesentlichen Gens kodiert, führen Sie eine Kreuzung-Schema (Kreuz G₀ mit Wildtyp-weiblich männlich oder Kreuz G₀ mit Wildtyp-männlich weiblich) zu erholen und für Bildschirm vererbbare Mutanten durch Prüfung Letalität oder Sterilität.
   Hinweis: Ähnlich wie D. Melanogaster, N. Vitripennis Erwachsene können durch die Einwirkung von CO₂ ermöglicht einfache Manipulation immobilisiert werden. Darüber hinaus werden unbegatteten Weibchen zu 100 % haploiden männlichen Bruten, führen daher ein mutiertes unbegatteten Weibchen zu große Anzahl von mutierten Männchen führen können, die für die spätere Analyse verwendet werden können.
   Hinweis: Mutationen im wesentlichen Gene müssen durch Paarung erhaltene G₀ injiziert Weibchen (vermutlich heterozygot für eine Mutation) zu Wildtyp Männchen gehalten werden; in diesem speziellen Fall sollte die Hälfte der G₁ männliche Nachkommen sterben durch Vererbung der tödliche Mutation, während die Hälfte der weiblichen Nachkommen G₁ Träger der tödlichen werden.
4. Outcross G₀ Erwachsene und Bildschirm G₁ Nachkommen bei Transgen Einfügungen mit Transgenese-Markern, wenn das Ziel Transgenese. Derzeit bleibt Transgenese in N. Vitripennisnachgewiesen werden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll enthält detaillierte Richtlinien zur Kolonie Aufzucht, Pre-Blastoderm Embryo Sammlung, Ausrichtung, Mikroinjektion und anschließende Transplantation nach der Injektion und für effiziente Genom Engineering in N. Vitripennisverwendet werden. Wie in Abbildung 2gezeigt, die allgemeine Reihenfolge der Schritte für eine erfolgreiche Mikroinjektion in N. Vitripennis gehören: (i) die fakultative männliche und weibliche Erwachsene zu Paaren (~ 4 Tage), (Ii) liefert frische Host fliegen Puppen (S. Bullata) platziert einer modifizierte Schaum Stecker auf begatteten Weibchen und damit für die Eiablage (~ 45 min), (Iii) sorgfältig peeling entfernt die parasitierte Host Puppen Nagelhaut zu entlarven und sammeln Pre Blastoderm Wespe Embryonen (~ 15 min), (iv) ausrichten Embryonen gesammelt (~ 15 min), (V) microinjecting Genom Änderung Komponenten zu Embryonen (~ 15 min), (vi) sorgfältig Platzierung injizierte Embryonen zurück in Pre gestochen Gastgeber für die richtige Entwicklung ermöglichen (~ 15 min), und (Vii) verhindert Austrocknung des injizierten Embryo/Hosts durch die Übertragung von Sie sind in eine feuchte Kammer mit etwa 70 % Relative Luftfeuchtigkeit (~ 15 min). Parasitierte Gastgeber sind dann für ca. 14 Tage für Komplettentwicklung von N. Vitripennis Embryonen inkubiert. Sobald injiziert, Erwachsene ergeben sich aus der Host (Viii), isolieren, Paaren und Bildschirm sie individuell auf das Vorhandensein von erwarteten Mutationen.

Für effektive Nadel eindringen und Mikroinjektion in N. Vitripennis Embryonen sind mehrere Arten von Kapillaren Glas Nadeln mit Faden einschließlich Quarz, Silikat und Borosilikat-Typen getestet. Es wird festgestellt, dass die Qualität der Nadel entscheidend zur Vermeidung von Bruch/Verstopfung während der Einspritzung und für hohe Raten von beiden Embryo überleben und Transformation-Effizienz zu erreichen. Für jede Glasart ein wirksames Protokoll wurde entwickelt, um die Nadeln ziehen, um eine gewünschte Infusions-wie lange Spitze effektiv für N. Vitripennis Embryo Mikroinjektion mit verschiedenen Mikropipette Abzieher (P-1000 und P-2000) haben (Tabelle 1 Abbildung 4).

Um das Verfahren zu optimieren, werden Überlebensraten nach Injektion von unterschiedliche Mengen an Genom Änderung Komponenten gemessen. Die Genom Änderung Komponenten verwendet hier waren gemischte Guide RNAs und Cas9 Protein für CRISPR-vermittelten Genom Bearbeitung, die bisher gezeigt wurden, auch in N. Vitripennis²¹arbeiten. Ähnlich wie zuvor war berichtet, hier eine SgRNA Ausrichtung der Zinnober -gen entwickelt und synthetisiert wird. Von targeting und dieses Gens zu stören, ist eine leicht erkennbare phänotypische Veränderung in die Augenfarbe des Organismus^19,21gesehen. Eine Kombination verschiedener Konzentrationen von SgRNA Injektierungsgemisches (0, 20, 40, 80, 160 und 320 ng/µL) mit Cas9 Protein (0, 20, 40, 80, 160 und 320 ng/µL) erstellt und in Embryonen von Wildtyp N. Vitripennisinjiziert. Überlebensrate von injizierten Embryonen erweist sich dosisabhängig (Tabelle 2)²¹. Die erhöhte Konzentration von SgRNA und Cas9 Protein führen zu verminderten Überlebensraten (Tabelle 2), vielleicht durch additive Ziel Effekte. Hohe Luftfeuchtigkeit (~ 70 %) findet sich auch wichtig für das Embryo Überleben nach der Transplantation, Gastgeber, als niedrige Luftfeuchtigkeit (~ 10 %) 100 % Tod alle Embryonen injiziert.

Abbildung 1 . Vorbereitung der Host Puppen (S. Bullata) für N. Vitripennis Embryo Eiablage. (A) Jung und alt S. Bullata Puppen. Ältere Puppen haben eine dunklere Kutikula, während jüngere Puppen eine mehr rötliche Färbung, ihre Cuticula haben. Jüngere Puppen werden bevorzugt zur Eiablage zu maximieren. Hinteren und vordere Enden der die Puppen können auch unterschieden werden, durch eine "Krater-ähnliche Öffnung am hinteren Ende, während das vordere Ende zu einem abgerundeten Punkt kommt. (B) Host (S. Bullata) Puppe Vorbereitung N. Vitripennis Embryo Eiablage. Einfügen der Host-Puppen in einen Schaum-Stecker, der eine Puppen hat große Loch heraus geschnitzt. Haben Sie der hinteren Seite von der Host-Puppen-Gesicht innerhalb des Steckers während 0,2 cm vom vorderen Ende ausgesetzt, um maximale Konzentration der Eiablage in den vorderen Bereich zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Zeitplan für die Erstellung von N. Vitripennis Mutanten durch Mikroinjektion. Timeline von N. Vitripennis Embryo Sammlung, Mikroinjektion CRISPR/Cas9 und nach der Injektion Verfahren. N. Vitripennis Erwachsene durften in Ermangelung einer Eiablage Seite für 4 Tage (ich) zu Paaren. Folgend ein frisch, Fleisch Fly Host Puppen, S. Bullata, platziert im Inneren ein Schaum-Stopper, nur 0,5 cm vom hinteren Ende setzen wurde eingeführt, die trächtigen Weibchen für 45 min, um Parasitierung (Ii) zu ermöglichen. Gleichzeitig wurden Injektion Materialien einschließlich der Mikroinjektion Nadeln und CRISPR/Cas9 Komponenten (Iii) vorbereitet. Embryonen wurden gesammelt vom Host (iv), (V) ausgerichtet und injiziert mit CRISPR/Cas9 Komponenten (vi). Die injizierten Embryonen wurden sorgfältig wieder zu einem bereits gestochen Host (Vii) übertragen und bis zu voll entwickelten (14 Tage) (Viii) inkubiert. Wenn die Erwachsenen entstanden, wurden Mutanten Phänotypen von erwarteten CRISPR/Cas9 induzierte Mutationen in das Zielgen (Ix) gezeigt. Das gesamte Verfahren dauert in der Regel 19 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . Modifizierte Objektträger zur Auskleidung von Embryonen. (A) A Deckglas. (B) ein Mikroskop-Objektträger. (C) ein Embryo Achse Gerät.Ein Deckglas kann auf einen Objektträger zu Linie Embryonen verwendet werden, für die Injektion geklebt werden. Das Deckglas dient als Kante ermöglicht einfache Manipulation und Auskleidung von Embryonen zu handeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . Injektion Nadel Vorbereitung. (A) Beispiele für gute und schlechte Silikat Glas Nadeln. (B) die Spitzen der eines unbeveled, richtig abgeschrägte und schlecht abgeschrägte Nadel. Aluminosilikat-Glas-Kapillarröhrchen wurden mithilfe einer Mikropipette Puller gezogen. Die produzierten Nadelspitzen dann vorsichtig geöffnet und verfeinert wurden mit einem Beyeler. Die gute abgeschrägte Nadel hat eine sehr scharfe Spitze, und die schlechten abgeschrägte Nadel hat eine stumpfe Spitze. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kapillare Glasart	Sutter-Nadel-Puller-Modell	Wärme	Filament	Geschwindigkeit	Verzögerung	Ziehen Sie	Druck
Quarz	P-2000	750	4	40	150	165	-
Silikat	P-1000	605	-	130	80	70	500
Borosilikat	P-1000	450	-	130	80	70	500

Tabelle 1. Einstellungen für Nadel-Puller.
Hinweis: Puller Nadeleinstellung variieren von Maschine zu Maschine, so dass jeder Übungseinheit muss eigene Nadel-Puller-Einstellungen optimieren. Diese Tabelle wurde von Li Et Al. modifiziert ²¹

SgRNA-1	Cas9	Insgesamt Embryonen	Transplantation (10 % Luftfeuchtigkeit)	Transplantation (70 % Feuchtigkeit)
			Überlebenden Larven	Überlebenden Larven	Erwachsenen Überlebenden
			Gesamt (%)	Gesamt (%)	♂	♀	Gesamt (%)
Keine Injektion	Keine Injektion	100	94 (94)	96 (96)	66	26	92 (92)
Wasser	Wasser	100	0 (0)	78 (78)	44	32	76 (76)
20 ng/µL	20 ng/µL	100	0 (0)	74 (74)	34	34	68 (68)
40 ng/µL	40 ng/µL	100	0 (0)	67 (67)	30	32	62 (62)
80 ng/µL	80 ng/µL	100	0 (0)	53 (53)	24	22	46 (46)
160 ng/µL	160 ng/µL	100	0 (0)	41 (41)	16	22	38 (38)
320 ng/µL	320 ng/µL	100	0 (0)	25 (25)	10	10	20 (20)

Tabelle 2: Injektion und Transplantation Survivorship und Mutagenese Preise basieren auf Injektionen von verschiedenen Konzentrationen von SgRNA und Cas9. Diese Tabelle wurde von Li Et Al. geändert ²¹

Diskussion

Die jüngsten Sequenzierung des Genoms N. Vitripennis hat eine wichtige Notwendigkeit für molekulare Werkzeuge, um unbekannte Gene innerhalb dieser Arten²³funktionell charakterisieren entfesselt. Das CRISPR-Cas9-System und viele andere gen Bearbeitungstools, erwiesen sich als wertvoll bei der Untersuchung von Genfunktionen für eine Reihe von Organismen²⁴sein. Diese Tools erfordern jedoch um vererbbare Mutationen zu erzeugen, Embryo Mikroinjektionen durchführen. Daher gezeigt, hier ist eine detaillierte visuelle Technik, die enthält eine Reihe von Innovationen, mit denen für effiziente N. Vitripennis Embryo Mikroinjektionen.

Alles in allem diese detaillierte Technik bietet eine Reihe von bedeutenden Innovationen in Bezug auf die bestehenden Methoden²³, ermöglichen effiziente N. Vitripennis Embryo Mikroinjektionen. Beispielsweise um die schnelle Erfassung von Embryonen zu erleichtern, Instrument der Eiablage (Schaum Stopper) erstellt und verwendet, um einzuschränken Eiablage ganz auf das hintere Ende des Hosts (Abbildung 1), die Sammlung von zahlreichen Embryonen in erheblich erleichtert einen kurzen Zeitraum hinweg. Techniken zur Aufzucht Wespe Kolonien mit einer großen Anzahl größerer Zahl von Eiern zu sammeln sind auch verbessert und definiert. Darüber hinaus entwickelt um Embryo Ausrichtung zu beschleunigen, eine Embryo-Ausrichtung-Gerät, das ermöglicht die Embryonen effizient ausgerichtet und ohne doppelseitiges Klebeband verwenden, um die Embryonen im Ort (Abbildung 3) injiziert werden.

Darüber hinaus wird festgestellt, dass durch Feuchthalten der Embryonen mit Wasser während der Injektion und nicht austrocknenden Embryonen oder mit Öl bedeckt Überlebensraten verbessert. Darüber hinaus mehrere Kapillare Glasarten sind getestet und Parameter zu konstruieren die perfekte Nadeln für die Mikroinjektion N. Vitripennis (Tabelle 1, Abbildung 4) bestimmt. Darüber hinaus folgende Mikroinjektion, Embryo überleben, die Preise deutlich erhöhen durch Inkubation injizierte Eiern in Pre gestochen Gastgeber können in hoher Luftfeuchtigkeit (70 %) Kammern gelegt. Diese Innovationen ermöglichen eine optimierte und erfolgreicher Mikroinjektion Verfahren für N. Vitripennis.

Geringfügige Änderungen in Bezug auf Injektionsapparat und Aufzucht Verfahren können dieses Protokolls je nach Präferenzen des Nutzers erfolgen. Eine Reihe von kritischen Schritte werden jedoch wesentlich zur Erzeugung von Mutanten erfolgreich in N. Vitripennis. Beispielsweise arbeitet schnell, dass injizierte Embryos sind > 1 h alt, und um sicherzustellen, dass Injektionsnadeln sind scharf genug, um Schäden an den Embryo zu minimieren werden beide unerlässlich. Während dieses Protokoll für die Erzeugung von Mutationen in Genen viele (wenn nicht sogar alle) wirksam sein sollte, ist eine große Einschränkung die CRIPSR/Cas9-Anforderung, eine PAM (NGG) Sequenz zu Zielen, die die Zielsequenz wird diktieren.

Zusammenfassend kann diese verbesserte Technik zur generieren viele Arten von Genom-Modifikationen, wie Mutationen, Löschungen, und möglicherweise sogar Einschübe mit CRIPSR/Cas9 Technologien²¹oder sogar Transgen Einfügungen zu transgenen generieren N. Vitripennis, die sehr funktionale Forschung in diesem Organismus beschleunigen sollte.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugdorm	Bugdorm	41515	Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes	Fisher Scientific	982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata	Carolina Insects	144440
Microelectrode Beveler	Sutter Instruments	BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)	Sutter Instruments	104E
Micromanipulator	World Precision Instruments	Kite R
Femtojet Express programmable microinjector	Eppendorf
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 or P-2000
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Compound Microscope	Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)	Sutter Instruments	BF100-58-10	Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs	JAECE	L800-B	Foam plugs
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3
Micro Cover glass	VWR	48366045
Adhesive	Aron Alpha	AA471	For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush	ZEM	2595
Ultra-fine tip forcep	Fisher Scientific	16-100-121
Femtotips Microloader tips	Fisher Scientific	E5242956003