Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

Resumo

Microinjeção de Nasonia vitripennis embriões é um método essencial para gerar modificações hereditárias do genoma. Aqui descrito é um procedimento detalhado para microinjeção e transplante de embriões Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente a manipulação futura do genoma deste organismo.

Resumo

A vespa joia Nasonia vitripennis emergiu como um sistema eficaz de modelo para o estudo de processos, incluindo a determinação do sexo, determinação do sexo strigatus-diploides, síntese de veneno e interações do anfitrião-simbionte, entre outros. Uma grande limitação de trabalhar com este organismo é a falta de protocolos eficazes para realizar modificações de genoma direcionado. Uma parte importante da modificação do genoma é entrega de reagentes, incluindo CRISPR/Cas9 moléculas, em embriões através de microinjeção de edição. Enquanto microinjeção está bem estabelecida em muitos organismos-modelo, esta técnica é particularmente desafiadora para realizar em s. vitripennis principalmente devido a seu tamanho pequeno embrião e o fato de que o desenvolvimento embrionário ocorre inteiramente dentro um pupa de varejeira parasitados. O procedimento a seguir supera esses desafios significativos enquanto demonstrar um procedimento simplificado, visual para remover eficazmente embriões de vespa de parasitadas pupas hospedeiras, microinjecting-los, e cuidadosamente transplantá-las de volta para o host para a continuação e a conclusão do desenvolvimento. Este protocolo fortemente irá aumentar a capacidade dos grupos de pesquisa para realizar modificações avançadas do genoma deste organismo.

Introdução

A vespa joia, s. vitripennis, é uma das quatro espécies do género Nasonia que são ectoparasitoids de comer moscas como Sarcophaga bullata¹carne. Devido a seus períodos entre gerações rápido, facilidade de criação em laboratório e uma gama de atributos biológicos únicos e importantes, s. vitripennis tem sido o foco para o desenvolvimento de várias ferramentas experimentais encontrados em organismos-modelo tradicional . Por exemplo, alguns atributos biológicos originais incluem um sistema de reprodução strigatus-diploides², uma relação com parasitas microbiana e genética^3,4e um supranumerários (B) cromossomo^{5,6 ,7}. Tomados em conjunto, estes fazem vitripennis s. um importante sistema experimental para experimentos visando elucidar os aspectos moleculares e celulares destes processos, além de outros, incluindo a produção de veneno^{8, 9}, de^10,de determinação do sexo¹¹e evolução e desenvolvimento de eixo padrão formação^12,13,14. Além disso, o kit de ferramentas genética para estudar a biologia de N. vitripennis aumentou dramaticamente durante a última década ou assim, com o sequenciamento de um genoma de alta resolução¹⁵, várias expressão genética estuda^16,17,18e o capacidade de perturbar funcionalmente expressão gênica depender de interferência de RNA (RNAi)^19,20, que juntos têm melhorado a rastreabilidade e capacidades de realização genética reversa neste organismo.

Apesar dos importantes avanços científicos e toolkits expandida deste organismo, a partir de conhecimentos actuais apenas um grupo tem realizado com sucesso microinjeções embrionárias para gerar genoma hereditários modificações²¹. Isto é principalmente devido as dificuldades de trabalhar com embriões de s. vitripennis como eles são bastante frágeis e pequenos, sendo ~2/3 o tamanho dos embriões de Drosophila melanogaster , tornando-os geralmente difíceis de manipular. Além disso, s. vitripennis fêmeas depositam seus ovos em pupas de varejeira previamente picado, dentro do qual ocorre a totalidade da embriogênese, larval e desenvolvimento pupal. Portanto, para sucesso microinjeções, fase de pré-Drosophila, os embriões devem ser eficientemente recolhidos no pupas hospedeiras, injetadas rapidamente e imediatamente transplantado volta seus hospedeiros para o desenvolvimento. Essas etapas requerem precisão e destreza para não danificar os embriões microinjected, ou os anfitriões pupal, tornando a técnica extremamente desafiador. Não obstante, há um protocolo curto publicado há mais de uma década que descreve s. vitripennis embrião microinjeção²². No entanto, este procedimento requer que os embriões recém estabelecidos ser dissecada, usa fita adesiva para ancorar os ovos para microinjeção e não inclui uma demonstração visual da técnica. Portanto, aqui descrito é um protocolo revisto e atualizado, incluindo um procedimento visual, detalhando um protocolo melhorado passo a passo para s. vitripennis microinjeções de embrião que pode ser seguido por qualquer laboratório básico para gerar hereditários do genoma modificações neste inseto modelo importante.

Protocolo

1. criação de colônia Vitripennis N.

1. Configurar várias colónias (~ 3-5), colocando 200-500 s. vitripennis adultos (com uma proporção de 3:1 de macho: fêmea) em gaiolas de dormitório de bug.
   Nota: Alternativa ao uso de dormitórios de bug, vespas também pode ser propagada em múltiplos, tubos de ensaio de vidro pequeno obstruídos com algodão com aproximadamente 15-20 vespas/frasco.
   1. Manter as vespas a 25 ± 1 ° C, com umidade relativa de 30% e um ciclo de 12:12 luz escura, alimentá-los diariamente com pequenas gotículas de 01:10 (v/v) solução de sacarose/água.
      Nota: Propagação de colônias de vespas e coleções também pode ser conduzida à temperatura ambiente sem umidade controlada; no entanto, temperaturas inferiores 25 ° C ligeiramente abaixará o timing do desenvolvimento dos embriões.
2. Permitir que as vespas acasalar pelo menos 4 dias antes de injeções.
   1. Para os dois primeiros dias, permitir que fêmeas acasaladas para se alimentar de fresco S. bullata pupas, bem como pequenas gotículas de um 01:10 (v/v) solução de sacarose/água.
   2. Nos dois dias seguintes, remova as pupas da varejeira privar as vespas femininas de um sítio de oviposição, tornando-os muito grávida.

2. recolha e alinhamento do estágio pré-Drosophila Vitripennis N.

1. Permitir que a fêmeas vespas de parasitar (ovipositar embriões) em jovens anfitriões (S. bullata pupas). Para manter os anfitriões fresco, armazenar anfitriões em 4 ° C imediatamente após obtê-las e retire apenas quando necessário.
   Nota: Anfitriões jovens podem ser determinadas por ter um casulo de cor vermelho, enquanto que hosts mais antigos têm um casulo de cor mais escuro (figura 1A).
   1. Lugar fresco individuais S. bullata pupas em uma rolha de espuma com um buraco do tamanho de pupas cortar o centro. Expor apenas ~ 0,2 cm da extremidade anterior (sítio de oviposição preferencial) do host para concentração máxima de parasitization e de mais fácil coleta de embrião.
      Nota: A extremidade anterior é arredondada, enquanto a extremidade posterior é mais espessa e contém uma 'cratera-like' abertura (figura 1B).
   2. Coloque pupas hospedeiras (aproximadamente 5 pupas hospedeiras por 100 vespas) no presente convénio dentro da jaula e esperar cerca de 45 min para permitir que as vespas de parasitar (Figura 2- ii).
      Nota: É muito importante que os embriões são tão jovens quanto possível, idealmente dentro da primeira hora de ser oviposited, para garantir que eles estão em fase de pré-Drosophila. Embriões antigos (> 1,5 h) não deve ser injetado.
   3. Remova hospedeiros parasitados por recuperá-los com a mão e delicadamente escovar/dispensando qualquer vespas residentes. Substituí-los com hosts frescos após cada ~ 15 min para continuar coletando cedo encenado ovos durante as injeções.
2. Remova os anfitriões recém parasitados gaiola à mão. Sob um microscópio de dissecação, usando a pinça, Retire cuidadosamente fora a parte posterior (0,4 cm) o casulo exterior (escudo pupal) para expor os ovos de s. vitripennis (Figura 2- iii).
   Nota: Deve ter cuidado para evitar perfurar a pele de pupa; Se isso acontecer, a hemolinfa vai umedecer os embriões de Vespa, que serão muito difícil de remover para o microinjection.
3. Use o adesivo líquido para colar uma lamela numa lâmina de vidro limpa para preparar um slide de alinhamento do embrião (Figura 3).
   Nota: Um adesivo instantâneo de alta performance é usado para aumentar a resistência e a velocidade de secagem, no entanto qualquer cola que pode manter a lamela de mover-se em torno do slide é aceitável.
4. Brush-Off os embriões do host cuidadosamente com um pincel de ponta fina molhado, certificando-se de não danificar a pele macia e pupa do host.
   Nota: um ' embrião escolher,' que é essencialmente uma metade de um par de pinças ultrafinas, pode ser usado em vez de um pincel.
5. Transferência de ~ 20 embriões um por um para o slide, imediatamente adjacente ao lado da lamela com um pincel molhado. Oriente a extremidade anterior do embrião contra a borda do slide a tampa para que a extremidade posterior dos embriões é apontada na mesma direção (Figura 2- iv). Isto permitirá maior precisão de injectar na mesma posição entre todos os embriões.
   Nota: Esta técnica melhorada não exige fita adesiva dupla-face para fixar os embriões para o slide, conforme descrito anteriormente,^21,22. Além disso, não desidratar embriões ou cobrir os ovos com óleo halocarbono durante a injeção conforme descrito anteriormente para s. vitripennis embrião microinjeção²².

3. agulha preparação para alevinos

1. Coloque um vidro de aluminossilicato capilar em um extrator de agulha.
   Nota: Uma boa agulha é essencial para o sucesso vitripennis s. injeções de embriões. As agulhas de injeção devem ter um sharp e ponta fina para permitir a fácil penetração através do córion. Quartzo e borosilicato agulhas capilares também podem ser usado (Figura 4).
2. Defina o calor de 605 a velocidade para 130, o atraso de 80, a puxar a 70 e a pressão de 500 em um extrator de agulha.
   Nota: As configurações de extrator adicionais agulha para puxar a quartzo e borosilicato agulhas podem ser vistas na tabela 1; os parâmetros podem variar de filamentos e puxadores diferentes.
3. Ative o extrator de agulha para criar a agulha correta. Repita conforme necessário para a produção de várias agulhas.
   Nota: Puxada de agulhas podem ser armazenadas, colocando-os em uma placa de Petri contendo que paralelo vários rolos de argila do modelador comercial.
4. A ponta da agulha de bisel tocando levemente a ponta da placa abrasiva de diamante em torno de 10 s a 25 ° C (Figura 2- iii).
   Nota: As agulhas de injeção beneficiam chanfradura, promovendo a entrada em embriões com danos mínimos, simultaneamente, melhorando o fluxo de regentes através da agulha.

4. o embrião Microinjection

1. Prepare a mistura de injeção consistindo de reagentes de modificação do genoma (por exemplo, transposon + auxiliar transposase, ou reagentes CRIPSR, etc.) e mantê-lo no gelo.
2. Carrega a agulha de injeção com 2 µ l da mistura de injeção usando dicas de microloader.
   Nota: A mistura de injeção demonstrada no protocolo consiste de RNA único-guia (sgRNA) (s) e proteína recombinante de Cas9 misturado em H₂O.
3. Coloque a lâmina de vidro com os embriões alinhados para o palco de um microscópio composto.
4. Introduza cuidadosamente a agulha na extremidade posterior do embrião, com um ângulo vertical de 25-35 °.

Injetar 15 pL de mistura de injeção (cerca de 2-10% do volume do embrião) e verifique se o embrião aparece inchar um pouco como a mistura é injetada (Figura 2- iv).
Nota: Se muita mistura de injeção é injectada o embrião pode rebentar dissipando o citoplasma do embrião. Além disso, impropriamente chanfradas ou quebrado agulhas com muito grande de uma abertura também pode causar a ruptura do embrião.

1. Tente re-chanfradura agulhas se entupimento ocorre. O citoplasma de s. vitripennis embriões é invulgarmente viscoso e pegajoso, que leva a agulha frequente entupimento (injeções de 1/25).
   Nota: É importante manter os embriões húmido durante o período de injeção regularmente adicionando água deionizada, usando o pincel. A quantidade de água no pincel é chave para movimentar os embriões e alinhar-se com facilidade. Demasiada água resulta em embriões flutuante e pouca água torna difícil para se movimentar.
2. Injetar ~ 20 a 40 ovos de cada vez (deve demorar cerca de 10 min), então pare. Transferir os ovos injetados com um pincel molhado tocando levemente os ovos injetados e colocá-los em um host. Em seguida, continuar a injectar novamente usando uma nova recém colocou o lote de ovos (> velho 1 h).
   Nota: Idealmente este protocolo é mais eficaz se uma pessoa é continuamente coletando e alinhando os ovos, enquanto outra pessoa está injetando os componentes de modificação do genoma e transplante de embriões injetados para pupas hospedeiras.

5. transplante Injected G₀ s. vitripennis embriões para Pre-stung hospedeiro

1. Coloque cuidadosamente os embriões de₀ G injetados em um previamente picado S. bullata pupas (Figura 2- vi) com um pincel molhado depois da microinjeção.
   Nota: As pupas de host usadas para coletar embriões para microinjeção vão trabalhar para esta finalidade. Também, apesar de um esforço significativo, não há atualmente nenhuma dieta artificial disponível que pode ser usado²².
   1. Coloque até 40 embriões injetados um de cada vez para um único host previamente picado para evitar superlotação e larval de competição.
      Nota: Injeção danificará os embriões; descuidado transplante de embriões injetados para as pupas de anfitrião pode espremer o componente injetado ou a gema para fora e levar até a morte dos embriões.
2. Coloque as pupas de acolhimento para uma placa de Petri com papel de filtro úmido e bolas de algodão e incube-os a 25 ° C, com cerca de 70% de umidade até injetados embriões eclodem (aproximadamente 1-2 dias) (Figura 2- vii).
   Nota: Importante, anfitriões podem ser deixadas com um descascado fora casulo e o s. vitripennis ovos desenvolverá normalmente desde que eles são incubados numa câmara umidificada (placa de Petri com papel de filtro úmido e bolas de algodão) para evitar a dessecação. Incubação à temperatura ambiente e com umidade das bolas de algodão umedecido é suficiente no caso de umidade não pode ser controlada.
3. Transferi as pupas de acolhimento para uma nova placa de Petri em 70% de umidade e 25^°C após a escotilha de embriões de₀ G.
   1. Monitore o anfitrião pupas e larvas de₀ G injetadas diariamente. Se as pupas de acolhimento tem um cheiro fétido, transferi as larvas injetadas para pupas de hospedeiro saudável novo.

6. triagem para modificações do genoma

1. Remova cada s. vitripennis pupas do host usando um pincel fino ou picador de embrião. Larvas de₀ G injetadas devem empupar em torno de 8 dias borne injeção.
2. Coloque cada pupa removido dentro de um frasco de vidro isolado obstruído com algodão e permitir que emergem como adultos de₀ G, garantindo que as fêmeas hachuradas será virgem que ajudará com os cruzamentos genéticos a jusante.
   Nota: As fêmeas podem ser classificadas de machos por comprimento da asa: as fêmeas possuem asas mais que ultrapassam o perfil de corpo quando ligado ao lado. Todas as pupas femininas microinjected podem ser colocadas juntos em um frasco conectado, e o mesmo se aplica para pupas masculinas.
3. Indivíduos de₀ tela G, após a eclosão, por qualquer PCR ou visualmente (se interromper um gene fenotípico). Por exemplo, se CRISPR é usado para criar as exclusões em um determinado gene e do gene interrompido confere um fenótipo visível, em seguida, classificar e manter os indivíduos com uma versão mutante do fenótipo afetado (Figura 2- viii)²¹. Se, no entanto, o gene afetado codifica para um fenótipo não-visíveis, tais como um mutante de um gene essencial, executar um esquema de travessia (Cruz G₀ macho com a fêmea tipo selvagem, ou Cruz G₀ fêmea com tipo selvagem macho) para recuperar e tela para Heritable mutantes através do ensaio de letalidade ou esterilidade.
   Nota: Similar ao d. melanogaster, s. vitripennis adultos pode ser imobilizada pela exposição ao CO₂ , permitindo a manipulação direta. Além disso, as fêmeas unmated dará origem a ninhadas de machos haploides 100%, portanto que uma fêmea unmated mutante pode dar origem a grande número de machos mutantes que pode ser usado para análise posterior.
   Nota: Mutações em genes essenciais precisará ser mantido pelo acasalamento sobrevivente G₀ injetado fêmeas (presumivelmente heterozigotos para uma mutação) para machos de tipo selvagem; Neste caso, metade da descendência masculina G₁ deveria morrer devido à herança da mutação letal, enquanto metade da progenitura feminina G₁ serão portadores da letal.
4. Outcross G₀ adultos e progênie de₁ tela G para inserções de transgene usando marcadores de transgênese, se o objetivo for transgênese. Atualmente a transgênese permanece para ser demonstrado em s. vitripennis.

Resultados

Este protocolo fornece diretrizes detalhadas para criação de colônia, coleção de pré-Drosophila embrião, alinhamento, microinjeção e subsequente transplante após a injeção e pode ser usado para engenharia de genoma eficiente em s. vitripennis. Como mostrado na Figura 2, a sequência geral de passos para uma bem sucedida microinjection em s. vitripennis incluem: (i) permitir que adultos machos e fêmeas para acasalar (~ 4 dias), (ii) fornecimento de pupas de mosca hospedeiras fresco (S. bullata) colocado em um plug de espuma modificados para fêmeas acasaladas e permitindo a oviposição (~ 45 min), (iii) cuidadosamente descascando afastado a cutícula de pupas de anfitrião parasitados para expor e coletar embriões de vespa de pré-Drosophila estágio (~ 15 min), (iv) alinhando coletados embriões (~ 15 min), (v) microinjecting componentes de modificação do genoma em embriões (~ 15 min), embriões de injetado cuidadosamente colocação (vi) de volta em hospedeiros previamente picados para permitir o desenvolvimento adequado (~ 15 min), e (vii) impedindo a desidratação do embrião/host injetado através da transferência de -os em uma câmara umidificada com aproximadamente 70% de umidade relativa (~ 15 min). Hospedeiros parasitados então são incubados durante cerca de 14 dias permitir o desenvolvimento completo de s. vitripennis embriões. Uma vez injetado, adultos emergem do host (viii), isolar, acasalam e de tela-los individualmente para a presença de mutações esperadas.

Para a penetração da agulha eficaz e microinjection em s. vitripennis embriões, são testados vários tipos de agulhas de vidro capilar com filamento, incluindo tipos de quartzo, silicato de alumínio e borosilicato. Pode ser encontrada que a qualidade da agulha é fundamental para evitar a ruptura/entupimento durante a injeção e para alcançar altas taxas de ambos eficiência de sobrevivência e transformação do embrião. Para cada tipo de vidro, um protocolo eficaz foi desenvolvido para puxar as agulhas para poder ter uma dica de longa hipodérmica como desejada eficaz para microinjeção de embrião s. vitripennis usando extratores diferentes micropipeta (P-1000 e P-2000) (tabela 1 Figura 4).

Para otimizar o processo, medem-se as taxas de sobrevivência após injeção de quantidades variáveis de componentes de modificação do genoma. Os componentes de modificação do genoma usados aqui foram misto guia RNAs e proteína Cas9 para genoma mediada por CRISPR edição, que foi demonstrado anteriormente a trabalhar bem em vitripennis s.²¹. Semelhante ao que foi anteriormente relatado, aqui um sgRNA como alvo o gene cinnabar é projetado e sintetizado. Pelo direcionamento e interromper este gene, uma mudança fenotípica facilmente identificável é vista na cor dos olhos do organismo^19,21. Uma mistura de injeção combinando uma variedade de concentrações de sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 e 320 ng / µ l) com proteína Cas9 (0, 20, 40, 80, 160 e 320 ng / µ l) é criado e injetado em embriões de tipo selvagem vitripennis s.. Taxa de sobrevivência de embriões injetados é encontrada para ser dose-dependente (tabela 2)²¹. A maior concentração de sgRNA e Cas9 chumbo de proteína para as taxas de sobrevivência diminuída (tabela 2), talvez devido a efeitos aditivos fora do alvo. Alta umidade (~ 70%) encontra-se também importante para a sobrevivência do embrião após transplante para hosts, como baixa umidade (~ 10%) resultou na morte de 100% para todos os embriões injetados.

Figura 1 . Preparação de pupas hospedeiras (S. bullata) para s. vitripennis oviposição embrião. () Jovens e velhos S. bullata pupas. Pupas mais velhas têm uma cutícula mais escura enquanto pupas mais jovens têm uma tonalidade mais avermelhada a sua cutícula. Mais jovens pupas são preferidas para maximizar a oviposição. Extremidades anteriores e posteriores das pupas também podem ser distinguidas por uma "cratera de abertura na extremidade posterior, Considerando que a extremidade anterior chega a um ponto arredondado. (B) preparação de pupa Host (S. bullata) para oviposição de embrião vitripennis s. . Inserir as pupas de anfitrião em um plugue de espuma que tem tido um pupas tamanho buraco esculpido. Tem o lado posterior da face de pupas de acolhimento dentro do plugue enquanto 0,2 cm da extremidade anterior exposta para permitir a concentração máxima de oviposição para a área anterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Cronograma para a criação de s. vitripennis mutantes pelo microinjection. Cronograma de colheita de embriões vitripennis s. CRISPR/Cas9 microinjeção e procedimentos pós-injeção. S. vitripennis adultos foram autorizados para acasalar na ausência de um sítio de oviposição por 4 dias (eu). A seguir, foi introduzido um fresco, carne mosca pupas hospedeiras, S. bullata, colocado dentro de uma rolha de espuma a expor apenas 0,5 cm da extremidade posterior, as fêmeas gravid por 45 min, para permitir a parasitization (ii). Simultaneamente, materiais de injeção incluindo microinjeção agulhas e CRISPR/Cas9 componentes foram preparados (iii). Os embriões foram coletados do host (iv), alinhados (v) e injetados com componentes CRISPR/Cas9 (vi). Os embriões injetados eram cuidadosamente transferidos para um host previamente picado (vii) e incubados até totalmente desenvolvidos (14 dias) (viii). Quando os adultos emergiram, mutantes foram projectados para fenótipos de esperado CRISPR/Cas9 induzidas mutações no gene alvo (ix). Todo o procedimento geralmente leva 19 dias para completar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Lâmina de microscópio modificado para forro embriões. (A), A lamela. (B), uma lâmina de microscópio. (C) um dispositivo de alinhamento do embrião.Uma lamela pode ser colada numa lâmina de microscópio para ser usado para embriões de linha para injeção. A finalidade da lamela é agir como uma vantagem para permitir fácil manipulação e forro de embriões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 . Preparação de agulha de injeção. (A) exemplos de agulhas de vidro de aluminossilicato de boas e más. (B) as dicas de uma agulha chanfrada análise corretamente chanfrada e mal. Tubos capilares de vidro de silicato de alumínio foram puxados usando um extrator da micropipeta. As pontas de agulha produzidos foram então gentilmente abriram e refinado usando um chanfrador. A agulha chanfrada bom tem uma ponta muito afiada, e a agulha chanfrada ruim tem uma ponta romba. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de vidro capilar	Modelo de extrator de agulha Sutter	Calor	Filamento	Velocidade	Atraso	Puxe	Pressão
Quartzo	P-2000	750	4	40	150	165	-
Silicato de alumínio	P-1000	605	-	130	80	70	500
Borosilicato	P-1000	450	-	130	80	70	500

Tabela 1. Configurações para extrator de agulha.
Nota: Configuração de extrator de agulha variam de máquina para máquina, assim que cada laboratório precisa otimizar suas próprias configurações de extrator de agulha. Esta tabela foi modificada de Li et al. ²¹

sgRNA-1	Cas9	Embriões de totais	Transplante (10% de umidade)	Transplante (70% de umidade)
			As larvas sobreviventes	As larvas sobreviventes	Sobreviventes adultos
			Total (%)	Total (%)	♂	♀	Total (%)
Sem injeção	Sem injeção	100	94 (94)	96 (96)	66	26	92 (92)
Água	Água	100	0 (0)	78 (78)	44	32	76 (76)
20 ng / µ l	20 ng / µ l	100	0 (0)	74 (74)	34	34	68 (68)
40 ng / µ l	40 ng / µ l	100	0 (0)	67 (67)	30	32	62 (62)
80 ng / µ l	80 ng / µ l	100	0 (0)	53 (53)	24	22	46 (46)
160 ng / µ l	160 ng / µ l	100	0 (0)	41 (41)	16	22	38 (38)
320 ng / µ l	320 ng / µ l	100	0 (0)	25 (25)	10	10	20 (20)

Tabela 2. Injeção e transplante de sobrevivência e mutagênese taxas de baseado em injeções de diferentes concentrações de sgRNA e Cas9. Esta tabela foi modificada de Li et al. ²¹

Discussão

O recente sequenciamento do genoma de s. vitripennis desencadeou-se uma necessidade importante de ferramentas moleculares caracterizar funcionalmente genes desconhecidos dentro desta espécie de²³. O sistema CRISPR-Cas9 e muitos outras gene ferramentas de edição, tem provado para ser valiosa na investigação de funções do gene para um número de organismos²⁴. No entanto, para gerar mutações hereditárias, essas ferramentas exigem realizando microinjeções de embrião. Portanto, demonstrado aqui é uma técnica visual detalhada que inclui uma série de inovações que permitem uma eficiente s. vitripennis microinjeções de embrião.

Em geral, esta técnica detalhada oferece uma série de inovações significativas, no que diz respeito de métodos existentes²³, que permitem a eficiente s. vitripennis microinjeções de embrião. Por exemplo, para facilitar a rápida coleta de embriões, uma ferramenta de oviposição (rolha de espuma) é criada e usada para restringir a postura inteiramente à extremidade posterior do hospedeiro (Figura 1), que facilita muito a coleção de inúmeros embriões dentro de ovos um curto período de tempo. Técnicas para a criação de colônias de vespas com números grandes para coletar o maior número de ovos são também melhorou e definidas. Além disso, para acelerar o alinhamento do embrião, é desenvolvido um dispositivo de alinhamento do embrião que permite que embriões sejam eficientemente alinhados e injetado sem ter que usar fita adesiva de dupla face para fixar os embriões no lugar (Figura 3).

Além disso, encontra-se que, mantendo os embriões úmido com água durante a injeção e não ressecando os embriões ou cobrindo-os com óleo melhorou as taxas de sobrevivência. Além disso, vários tipos de vidro capilar são testados e são determinados parâmetros para construir as agulhas perfeitas para s. vitripennis microinjection (tabela 1, Figura 4). Além disso, seguir microinjeção, sobrevivência embrionária, taxas são capazes de aumentar significativamente devido a incubar ovos injetados em hospedeiros previamente picados colocados em câmaras de alta umidade (70%). Estas inovações permitem vitripennis s.para um procedimento de microinjeção mais simplificada e bem sucedida.

Pequenas modificações em termos de aparelho de injeção e a criação de procedimentos podem ser feitas a este protocolo, dependendo das preferências do usuário. No entanto, um número de passos críticos será essencial para a geração de mutantes com sucesso em s. vitripennis. Por exemplo, trabalhando rapidamente para que os embriões injetados são > 1 h antigo e assegurando que as agulhas de injeção são nítidas o suficiente para minimizar os danos para o embrião vão ser essencial. Enquanto este protocolo deve ser eficaz para gerar mutações em genes muitos (se não todos), uma grande limitação é a exigência de CRIPSR/Cas9 para uma sequência de PAM (NGG) que vai ditar a sequência de destino-alvo.

Em conclusão, esta técnica melhorada pode ser usada para gerar muitos tipos de modificações de genoma, tais como mutações, deleções e possivelmente até mesmo inserções usando CRIPSR/Cas9 tecnologias²¹, ou até mesmo transgene inserções para gerar transgênicos S. vitripennis, que muito deve acelerar a investigação funcional deste organismo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugdorm	Bugdorm	41515	Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes	Fisher Scientific	982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata	Carolina Insects	144440
Microelectrode Beveler	Sutter Instruments	BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)	Sutter Instruments	104E
Micromanipulator	World Precision Instruments	Kite R
Femtojet Express programmable microinjector	Eppendorf
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 or P-2000
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Compound Microscope	Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)	Sutter Instruments	BF100-58-10	Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs	JAECE	L800-B	Foam plugs
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3
Micro Cover glass	VWR	48366045
Adhesive	Aron Alpha	AA471	For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush	ZEM	2595
Ultra-fine tip forcep	Fisher Scientific	16-100-121
Femtotips Microloader tips	Fisher Scientific	E5242956003