Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

Riepilogo

Microiniezione di embrioni Nasonia vitripennis è un metodo essenziale per la generazione di modifiche del genoma ereditabile. Una procedura dettagliata per microiniezione e il trapianto di embrioni Nasonia vitripennis , che agevolerà notevolmente la manipolazione del genoma futuri in questo organismo è descritto qui.

Abstract

La Vespa gioiello Nasonia vitripennis è emerso come un sistema efficace modello per lo studio dei processi tra cui la determinazione del sesso, determinazione del sesso aplo-diploide, sintesi di veleno e interazioni ospite-simbionte, tra gli altri. Una limitazione importante di lavorare con questo organismo è la mancanza di efficaci protocolli per eseguire le modifiche dirette del genoma. Una parte importante della modificazione del genoma è consegna di reagenti, tra cui molecole CRISPR/Cas9, negli embrioni attraverso microiniezioni di editing. Mentre microiniezione è ben consolidata in molti organismi di modello, questa tecnica è particolarmente difficile da eseguire in N. vitripennis principalmente a causa della sua dimensione di piccolo embrione e il fatto che lo sviluppo embrionale avviene interamente all'interno un pupa blowfly parassitati. La procedura seguente supera queste sfide significative mentre dimostrando una procedura snella, visual per rimuovere efficacemente gli embrioni della Vespa da parassitato pupe host, microinjecting li, e attentamente trapianto loro nuovamente dentro l'host per la continuazione e il completamento dello sviluppo. Questo protocollo aumenterà fortemente la capacità dei gruppi di ricerca di eseguire modifiche avanzate genoma in questo organismo.

Introduzione

La Vespa di gioiello, N. vitripennis, è una delle quattro specie del genere Nasonia che sono ectoparasitoids di carne mangiare mosche come Sarcophaga bullata¹. A causa di loro periodi veloce-generazionale, facilità di allevamento in laboratorio e una gamma di attributi biologici unici e importante, N. vitripennis è stato un punto focale per lo sviluppo di molteplici strumenti sperimentali trovati in organismi modello tradizionale . Ad esempio, alcuni attributi biologici unici includono un sistema di riproduzione aplo-diploide², una relazione con parassiti microbici e genetica^3,4e un sovrannumero (B) del cromosoma^{5,6 ,7}. Presi insieme, questi fanno N. vitripennis un importante sistema sperimentale per esperimenti volti a chiarire gli aspetti molecolari e cellulari di questi processi, oltre ad altri tra cui veleno produzione^{8, 9}, sesso determinazione^10,11ed evoluzione e sviluppo di asse modello formazione^12,13,14. Inoltre, il toolkit genetico per studiare la biologia di N. vitripennis è aumentato drammaticamente negli ultimi dieci anni o così, con il sequenziamento di un genoma ad alta risoluzione¹⁵, espressione genica diversi studi^16,17,18e il capacità di interferire funzionalmente basandosi su RNA interference (RNAi)^19,20, che insieme hanno migliorato la trattabilità e la capacità di eseguire genetica inversa in questo organismo l'espressione genica.

Nonostante i molti importanti progressi scientifici e Toolkit espansa in questo organismo, a partire da conoscenze attuali solo un gruppo ha eseguito correttamente embrionali microiniezioni per generare ereditabile genoma modifiche²¹. Ciò è principalmente dovuto la difficoltà di operare con embrioni di N. vitripennis in quanto sono piuttosto fragile e piccola, essendo ~2/3 le dimensioni degli embrioni di Drosophila melanogaster , che li rende generalmente difficili da manipolare. Inoltre, N. vitripennis femmine depositano le loro uova in pupe blowfly pre-stung, all'interno del quale si verifica l'interezza dell'embriogenesi, larvale e sviluppo pupa. Pertanto, per successo microiniezioni, fase di pre-blastoderm, devono essere raccolti in modo efficiente il embrioni, da pupe host, microiniettati rapidamente e immediatamente trapiantato nel loro padroni di casa per lo sviluppo. Questi passaggi richiedono precisione e destrezza per evitare di danneggiare gli embrioni iniettati o i padroni di casa pupal, rendendo la tecnica estremamente impegnativo. Nonostante, c'è un protocollo a breve pubblicato oltre un decennio fa che descrive vitripennis N. embrione microiniezione²². Tuttavia, questa procedura richiede che gli embrioni appena deposte essere essiccata, usa il nastro adesivo per ancorare le uova per il microinjection e non include una dimostrazione visiva della tecnica. Pertanto, è descritto qui un protocollo aggiornato e riveduto, compresa una procedura visual, dettagliare un protocollo migliorato passo dopo passo per microiniezioni di embrione N. vitripennis che può essere seguito da qualsiasi base del laboratorio per generare ereditabile genoma modifiche a questo insetto importante modello.

Protocollo

1. N. Vitripennis Colonia allevamento

1. Impostare diverse colonie (~ 3-5) inserendo 200-500 vitripennis N. adulti (con un rapporto 3:1 donna e uomo) in gabbie dormitorio bug.
   Nota: Alternativa all'utilizzo di dormitori di bug, vespe può anche essere propagata in più, provette di vetro piccolo collegati con cotone con circa 15-20 vespe/flacone.
   1. Mantenere le vespe a 25 ± 1 ° C con umidità relativa 30% e un ciclo di buio luce 12:12, nutrirli quotidianamente con piccole goccioline di 01:10 (v/v) soluzione di saccarosio/acqua.
      Nota: Propagazione delle colonie di Vespa e collezioni può essere condotta anche a temperatura ambiente senza umidità controllata; Tuttavia, temperature inferiori a 25 ° C si abbassa leggermente la tempistica dello sviluppo degli embrioni.
2. Consentire vespe di accoppiarsi per almeno 4 giorni prima di iniezioni.
   1. Per i primi due giorni, permettere a donne accoppiate di mangimi freschi S. bollata pupe, così come piccole goccioline di un 01:10 (v/v) soluzione di saccarosio/acqua.
   2. Per i due giorni seguenti, rimuovere le pupe blowfly per privare le vespe femminile di un sito di deposizione delle uova, che li rende molto gravid.

2. raccolta e allineamento di embrioni in fase di pre-blastoderm N. Vitripennis

1. Consentire femminile vespe di parassitare (oviposit embrioni) in giovani padroni di casa (S. bollata pupe). Per mantenere freschi gli host, memorizzare i padroni di casa a 4 ° C immediatamente dopo aver ottenuto loro e rimuovere solo quando necessario.
   Nota: Giovani padroni di casa può essere determinate avendo un pupario colorata di rosso, mentre più vecchi padroni di casa hanno un pupario colorato più scuro (Figura 1A).
   1. Posto fresco individuali bollata di S. pupe in un tappo di gomma piuma con un foro di dimensioni pupe ritagliare al centro. Esporre solo ~ 0,2 cm dell'estremità anteriore (sito preferito di deposizione delle uova) dell'host per la massima concentrazione di spesso e più facile raccolta di embrioni.
      Nota: L'estremità anteriore è arrotondato, mentre l'estremità posteriore è più spessa e contiene un 'cratere-come' apertura (Figura 1B).
   2. Inserire pupe host (all'incirca 5 pupe di host per 100 vespe) in questa disposizione nella gabbia e aspettare circa 45 min per consentire vespe di parassitare loro (Figura 2- ii).
      Nota: È molto importante che gli embrioni sono giovani come possibile, idealmente entro la prima ora di essere oviposited, per garantire che essi sono in fase di pre-blastoderm. Vecchi embrioni (> 1,5 h) non deve essere iniettato.
   3. Rimuovere gli host parassitati recuperandoli a mano e delicatamente spazzolatura/soffiando fuori qualsiasi residente vespe. Sostituirli con padroni di casa fresche dopo ogni ~ 15 min per continuare la raccolta presto in scena le uova durante le iniezioni.
2. Rimuovere a mano i padroni di casa appena parassitati dalla gabbia. Sotto un microscopio per dissezione, usando il forcipe, attentamente staccarsi l'estremità posteriore (0,4 cm) del pupario esterna (pupal shell) per esporre le uova N. vitripennis (Figura 2- iii).
   Nota: Si deve prestare attenzione per evitare di perforare la pelle pupal; Se questo accade, l'emolinfa sarà inumidire gli embrioni di Vespa, che saranno molto difficili da rimuovere per il microinjection.
3. Usare liquido adesivo per incollare un vetrino coprioggetto su un vetrino pulito per preparare una diapositiva di allineamento di embrione (Figura 3).
   Nota: Un adesivo istantaneo ad alte prestazioni viene utilizzato per aumentare la forza di legame e rapidità di essiccazione, tuttavia qualsiasi colla che può mantenere il vetrino coprioggetto da muoversi sulla diapositiva è accettabile.
4. Veemenza gli embrioni dall'host accuratamente con un pennello bagnato di multa-punta, facendo attenzione a non danneggiare la pelle morbida pupal dell'host.
   Nota: un «embrione pick,' che è essenzialmente una metà di una coppia di pinze ultrafini, può essere utilizzato invece di un pennello.
5. Trasferimento ~ 20 embrioni uno-ad-uno nella diapositiva, immediatamente adiacente al lato del coprivetrino con un pennello bagnato. Orientare l'estremità anteriore dell'embrione contro il bordo della diapositiva coperchio in modo che il lato posteriore degli embrioni sia rivolto nella stessa direzione (Figura 2- iv). Ciò consentirà una maggiore precisione di stampaggio ad iniezione nella stessa posizione tra tutti gli embrioni.
   Nota: Questa tecnica migliorata non richiede bifacciale nastro adesivo per fissare gli embrioni alla diapositiva come descritto in precedenza^21,22. Inoltre, non essiccare embrioni o coprire le uova con olio halocarbone durante l'iniezione, come descritto in precedenza per vitripennis N. embrione microiniezione²².

3. ago preparazione per microiniezioni

1. Inserire un vetro capillare di silicato di alluminio in un estrattore dell'ago.
   Nota: Un ago di qualità è fondamentale per il successo vitripennis N. iniezioni di embrioni. Gli aghi per iniezione dovrebbero avere un sharp e belle-punta per consentire la facile penetrazione attraverso il corion. Quarzo e borosilicato aghi capillari possono anche essere utilizzato (Figura 4).
2. È possibile impostare il calore a 605, la velocità a 130, il ritardo a 80, il tirare su 70 e la pressione a 500 su un estrattore dell'ago.
   Nota: Impostazioni di estrattore ferri aggiuntivi per la trazione al quarzo e aghi di borosilicato possono essere visto nella tabella 1; i parametri possono variare per diversi estrattori e filamenti.
3. Attivare la levetta di regolazione dell'ago per creare l'ago corretta. Ripetere se necessario per la produzione di aghi multipli.
   Nota: Tirati aghi possono essere memorizzati inserendoli in una capsula di Petri contenente che parecchi paralleli rotoli di argilla di modeler commerciale.
4. Smusso la punta dell'ago toccando leggermente la punta alla piastra abrasiva diamante circa 10 s a 25 ° C (Figura 2- iii).
   Nota: Gli aghi per iniezione beneficiano di smussatura promuovendo entrata in embrioni con danno minimo migliorando contemporaneamente il flusso dei reggenti attraverso l'ago.

4. embrione Microinjection

1. Preparare la miscela di iniezione di reagenti di modificazione del genoma (ad es., trasposoni + helper transposase, o CRIPSR reagenti, ecc.) e tenerlo sul ghiaccio.
2. Caricare l'ago per iniezione con 2 µ l di miscela di iniezione utilizzando suggerimenti microloader.
   Nota: La miscela di iniezione ha dimostrata nel protocollo consiste di singolo-guida RNA (sgRNA) (s) e la proteina ricombinante Cas9 miscelati in H₂O.
3. Porre il vetrino di vetro con gli embrioni foderati sul palco di un microscopio composto.
4. Inserire delicatamente l'ago nell'estremità posteriore dell'embrione con un angolo verticale di 25-35 °.

Iniettare 1-5 pL della miscela di iniezione (circa il 2-10% del volume dell'embrione) e garantire che l'embrione sembra gonfiarsi leggermente, come la miscela viene iniettata in esso (Figura 2- iv).
Nota: Se troppo miscela di iniezione viene iniettato l'embrione possono scoppiare dissipare il citoplasma dall'embrione. Inoltre, impropriamente smussato o rotto troppo grande di aghi con un'apertura può anche causare la rottura dell'embrione.

1. Prova a ri-smussatura aghi in caso di intasamento. Il citoplasma degli embrioni N. vitripennis è insolitamente densa e collosa, che conduce ai ferri frequenti intasamento (iniezioni di 1/25).
   Nota: È importante mantenere gli embrioni umido durante il periodo di iniezione regolarmente aggiungendo acqua deionizzata utilizzando il pennello. La quantità di acqua sul pennello è la chiave per muoversi embrioni e allineare con facilità. Troppa acqua si traduce in embrioni galleggiante e troppo poca acqua li rende difficile muoversi.
2. Iniettare ~ 20-40 uova alla volta (dovrebbe prendere circa 10 min), poi fermarsi. Trasferire le uova iniettate con un pennello bagnato toccando leggermente le uova iniettate e inserirli in un host. Poi continuare iniettando nuovamente utilizzando un fresco appena partita di uova di cui (> 1h vecchio).
   Nota: Idealmente questo protocollo è più efficace se una persona è continuamente raccogliendo e allineando le uova, mentre un'altra persona è iniettando i componenti di modificazione del genoma e il trapianto di embrioni iniettati di pupe di host.

5. trapianto iniettato G₀ vitripennis N. embrioni su Host Pre-stung

1. Posizionare gli embrioni iniettati di₀ G su una precedenza stung bollata di S. pupe (Figura 2- vi) con un pennello bagnato dopo microiniezione.
   Nota: Le pupe di host utilizzate per raccogliere gli embrioni per il microinjection funzionerà per questo scopo. Inoltre, nonostante il notevole sforzo, non c'è attualmente nessuna dieta artificiale disponibile che possa essere usate²².
   1. Posto fino a 40 embrioni iniettati uno alla volta in un singolo host pre-stung per evitare sovraffollamento e larvale concorrenza.
      Nota: Iniezione causerà danni agli embrioni; sbadato trapianto di embrioni iniettati per le pupe di host può spremere il componente iniettato o il tuorlo fuori e portare alla morte degli embrioni.
2. Inserire le pupe di host in una capsula di Petri con carta da filtro umido e batuffoli di cotone e li Incubare a 25 ° C con circa 70% di umidità fino a quando embrioni iniettati schiudono (circa 1-2 giorni) (Figura 2- vii).
   Nota: Importante, padroni di casa possono essere lasciati con un pelati off pupario e vitripennis N. uova svilupperà normalmente fino a quando essi sono incubati in una camera umidificata (capsula di Petri con carta da filtro umido e batuffoli di cotone) per evitare il disseccamento. Incubare a temperatura ambiente e con umidità dai batuffoli di cotone inumidito è sufficiente nel caso in cui l'umidità non può essere controllato.
3. Trasferire le pupe di host in una nuova piastra di Petri a 25^°C e umidità 70% dopo il tratteggio di embrioni₀ G.
   1. Monitorare quotidianamente le pupe di host e iniettate larve di₀ G. Se le pupe host hanno un cattivo odore, trasferire le larve iniettate al nuovo pupe ospite sano.

6. lo screening per le modifiche del genoma

1. Rimuovere ogni pupe N. vitripennis dall'host utilizzando un pennello fine o embrione pick. Le larve di₀ G iniettate dovrebbero pupate circa 8 giorni dopo l'iniezione.
2. Luogo ogni pupa rimosso in una fiala di vetro isolato collegato con cotone e consentire loro di emergere come gli adulti₀ G, assicurando che le femmine nati sarà Vergine che vi aiuterà con incroci genetici a valle.
   Nota: Le femmine possono essere ordinate da maschi per lunghezza dell'ala: le femmine hanno ali più lunghe che si estendono oltre il profilo del corpo quando girato sul lato. Tutte le pupe femminili iniettati possono essere messi insieme in un flacone tappato, e lo stesso vale per pupe maschi.
3. Gli individui₀ schermo G, dopo eclosion, entrambi PCR o visivamente (se interrompere un gene fenotipico). Ad esempio, se CRISPR viene utilizzato per creare le eliminazioni in un dato gene e gene perturbato conferisce un fenotipo visibile, quindi ordinare e mantenere gli individui con una versione mutante del fenotipo interessato (Figura 2- viii)²¹. Se, tuttavia, il gene interessato codifica per un fenotipo non visibili, come un mutante di un gene essenziale, eseguire uno schema di attraversamento (Croce G₀ maschio con femmina tipo selvaggio, o croce G₀ femmina con maschio di tipo selvaggio) per recuperare e dello schermo per mutanti ereditabile attraverso analizzante letalità o sterilità.
   Nota: Simile a d. melanogaster, N. vitripennis adulti può essere immobilizzato da esposizione al CO₂ permettendo per semplice manipolazione. Inoltre, le femmine spaiate darà luogo a 100% nidiate di maschi aploidi, così dunque che una donna mutante spaiata può dar luogo a gran numero di maschi mutanti che può essere utilizzato per la successiva analisi.
   Nota: Le mutazioni in geni essenziali dovranno essere tenuti dall'accoppiamento superstite G₀ iniettato femmine (presumibilmente eterozigoti per una mutazione) ai maschi di tipo selvaggio; in questo caso particolare, la metà della prole maschio G₁ dovrebbe morire a causa dell'ereditarietà della mutazione letale, mentre la metà della prole femmina₁ G saranno portatrici della letale.
4. Outcross G₀ adulti e progenie₁ schermo G per gli inserimenti di transgene usando gli indicatori transgenesi, se l'obiettivo è la transgenesi. Attualmente la transgenesi resta da dimostrare in N. vitripennis.

Risultati

Questo protocollo fornisce linee guida dettagliate per Colonia allevamento, raccolta pre-blastoderm embrione, allineamento, microiniezione e successivo trapianto dopo l'iniezione e può essere utilizzato per l'ingegneria di genoma efficiente in N. vitripennis. Come illustrato nella Figura 2, la sequenza di passaggi per un successo microiniezione in N. vitripennis generale includono: (i) permettendo adulti maschi e femmine ad accoppiarsi (~ 4 giorni), (ii) fornitura di pupe volare fresco host (S. bullata) collocati in un spina di schiuma modificate alle femmine accoppiate e consentendo per la deposizione delle uova (~ 45 min), (iii) staccando accuratamente la cuticola di pupe parassitati host per esporre e raccogliere embrioni in fase di pre-blastoderm wasp (~ 15 min), (iv) allineando raccolti embrioni (~ 15 min), (v) microinjecting componenti di modificazione del genoma negli embrioni (~ 15 min), embrioni iniettati con attenzione immissione (vi) nuovamente dentro pre-stung host per consentire lo sviluppo corretto (~ 15 min), e (vii) prevenire la disidratazione dell'embrione/host iniettato trasferendo loro in una camera umidificata con circa 70% di umidità relativa (~ 15 min). Parassitati padroni di casa sono incubate per circa 14 giorni consentire lo sviluppo completo di N. vitripennis embrioni. Una volta iniettato, adulti emergono dall'host (viii), isolare, amico e li proteggi singolarmente per la presenza di mutazioni previste.

Per penetrazione efficace dell'ago e microiniezione in vitripennis N. embrioni, vengono sottoposti a diversi tipi di aghi di vetro capillare con filamento inclusi i tipi di quarzo, silicato di alluminio e borosilicato. Si è trovato che la qualità dell'ago è fondamentale per evitare la rottura/intasamento durante l'iniezione e per il raggiungimento di elevati tassi di entrambi efficienza di sopravvivenza e trasformazione di embrione. Per ogni tipo di vetro, un efficace protocollo è stato sviluppato per tirare aghi al fine di avere una lunga punta di desiderata ipodermica-come efficace per il microinjection di embrione N. vitripennis uso estrattori diversi micropipetta (P-1000 e P-2000) (tabella 1 Figura 4).

Per ottimizzare la procedura, i tassi di sopravvivenza sono misurati dopo iniezione di quantità variabili di componenti di modificazione del genoma. I componenti di modificazione del genoma utilizzati qui sono stati guida mista RNA e proteina Cas9 per genoma CRISPR-mediata di editing, che erano precedentemente dimostrato di lavorare bene in vitripennis N.²¹. Simile a quello che era precedentemente segnalato, qui un sgRNA con destinazione il gene di cinabro è progettato e sintetizzato. Di mira e interrompere questo gene, un cambiamento fenotipico facilmente identificabile è visto nel colore degli occhi del organismo^19,21. Una miscela di iniezione combinando una serie di concentrazioni di sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 e 320 ng / µ l) con la proteina Cas9 (0, 20, 40, 80, 160 e 320 ng / µ l) viene creato e iniettato in embrioni di tipo selvaggio N. vitripennis. Tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati è trovato per essere dose-dipendente (tabella 2)²¹. La maggiore concentrazione di sgRNA e Cas9 proteina provocare tassi di sopravvivenza in diminuzione (tabella 2), forse a causa di effetti additivi fuori bersaglio. Umidità elevata (~ 70%) trova anche ad per essere importante per la sopravvivenza dell'embrione dopo trapianto ai padroni di casa, come bassa umidità (~ 10%) ha provocato la morte di 100% per tutti gli embrioni iniettati.

Figura 1 . Preparazione di pupe di host (S. bullata) per vitripennis N. deposizione delle uova dell'embrione. (A) Giovane e vecchio S. bollata pupe. Pupe più anziani hanno una cuticola più scura mentre pupe più giovani hanno una tinta più rossastra a loro cuticola. Pupe più giovani sono preferiti per massimizzare la deposizione delle uova. Estremità anteriori e posteriori delle pupe si distinguono anche aprendo un"cratere-come sul lato posteriore, mentre l'estremità anteriore si tratta di un punto arrotondato. (B) preparazione di pupa Host (S. bullata) per la deposizione delle uova dell'embrione di vitripennis N. . Le pupe di host inserendo una spina di schiuma che ha avuto un pupe dimensioni foro scavato. Hanno il lato posteriore della faccia pupe host all'interno della spina mentre 0,2 cm dell'estremità anteriore esposti per consentire massima concentrazione di deposizione delle uova nella zona anteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Timeline per la creazione di N. vitripennis mutanti dal microinjection. Timeline di raccolta degli embrioni vitripennis N. , CRISPR/Cas9 microiniezione e procedure di post-iniezione. N. vitripennis adulti sono stati permessi ad accoppiarsi in assenza di un sito di deposizione delle uova per 4 giorni (io). In seguito, un fresco, pupe di host Mosca di carne, S. bollata, collocato all'interno di un tappo di gomma piuma per esporre solo 0,5 cm dell'estremità posteriore, è stato introdotto per le femmine gravide per 45 min per consentire spesso (ii). Contemporaneamente iniezione materiali tra cui aghi di microinjection e componenti CRISPR/Cas9 sono stati preparati (iii). Gli embrioni sono stati raccolti dall'host (iv), allineati (v) e iniettati con componenti CRISPR/Cas9 (vi). Embrioni iniettati sono stati attentamente trasferiti un host pre-stung (vii) e incubati fino a completamente sviluppati (14 giorni) (viii). Quando gli adulti emersero, mutanti sono stati schermati per i fenotipi di previsto CRISPR/Cas9 indotto mutazioni nel gene dell'obiettivo (ix). L'intera procedura richiede generalmente 19 giorni per essere completato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Vetrino da microscopio modificate per fodera embrioni. (A) A vetrino coprioggetti. (B) un vetrino da microscopio. (C) un dispositivo di allineamento di embrione.Un vetrino coprioggetti possono essere incollato su un vetrino da microscopio attraverso il quale gli embrioni linea iniettabile. Lo scopo del coprivetrino è di agire come un bordo per consentire facile manipolazione e rivestimento degli embrioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 . Preparazione dell'iniezione dell'ago. (A) esempi di aghi di vetro alluminosilicato di buoni e cattivi. (B) i suggerimenti di un rilievo, correttamente smussato e scarsamente ago smussato. Tubi capillari di vetro alluminosilicato sono stati tirati utilizzando un estrattore micropipetta. Le punte dell'ago prodotte erano poi delicatamente aperto e raffinato utilizzando una Smussatrice. Il buon ago smussato ha una punta molto affilata, e l'ago smussato male ha una punta smussata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di vetro capillare	SUTTER ago estrattore modello	Calore	Filamento	Velocità	Ritardo	Tirare	Pressione
Quarzo	P-2000	750	4	40	150	165	-
Silicato di alluminio	P-1000	605	-	130	80	70	500
Borosilicato	P-1000	450	-	130	80	70	500

Tabella 1. Impostazioni per estrattore dell'ago.
Nota: Impostazione estrattore dell'ago variano da macchina a macchina quindi ogni laboratorio sarà necessario ottimizzare le proprie impostazioni di estrattore dell'ago. Questa tabella è stata modificata da Li et al. ²¹

sgRNA-1	Cas9	Totali embrioni	Trapianto (10% di umidità)	Trapianto (70% di umidità)
			Sopravvissuti larve	Sopravvissuti larve	Adulti sopravvissuti
			Totale (%)	Totale (%)	♂	♀	Totale (%)
Nessuna iniezione	Nessuna iniezione	100	94 (94)	96 (96)	66	26	92 (92)
Acqua	Acqua	100	0 (0)	78 (78)	44	32	76 (76)
20 ng / µ l	20 ng / µ l	100	0 (0)	74 (74)	34	34	68 (68)
40 ng / µ l	40 ng / µ l	100	0 (0)	67 (67)	30	32	62 (62)
80 ng / µ l	80 ng / µ l	100	0 (0)	53 (53)	24	22	46 (46)
160 ng / µ l	160 ng / µ l	100	0 (0)	41 (41)	16	22	38 (38)
320 ng / µ l	320 ng / µ l	100	0 (0)	25 (25)	10	10	20 (20)

Tabella 2. Iniezione e trapianto di sopravvivenza e mutagenesi tariffe basate su iniezioni delle concentrazioni differenti di sgRNA e Cas9. Questa tabella è stata modificata da Li et al. ²¹

Discussione

Il recente sequenziamento del genoma di N. vitripennis ha scatenato un bisogno importante per strumenti molecolari per la caratterizzazione funzionale di geni sconosciuto all'interno di questa specie²³. Il sistema di CRISPR-Cas9 e molti altri strumenti di editing gene, hanno dimostrato di essere utile per indagare le funzioni del gene per un certo numero di organismi²⁴. Tuttavia, per generare mutazioni ereditabili, questi strumenti richiedono prestazioni microiniezioni di embrione. Pertanto, dimostrato qui è una tecnica visiva dettagliata che include una serie di innovazioni che consentono di efficiente microiniezioni embrione N. vitripennis .

Nel complesso, questa tecnica dettagliata offre una serie di innovazioni significative, rispetto alle attuali metodi²³, che consentano di efficiente microiniezioni embrione N. vitripennis . Ad esempio, per facilitare la rapida raccolta degli embrioni, uno strumento di deposizione delle uova (tappo di gomma piuma) è creato e utilizzato per limitare la deposizione interamente all'estremità posteriore dell'host (Figura 1), che facilita notevolmente la raccolta di numerosi embrioni all'interno delle uova un breve periodo di tempo. Tecniche per l'allevamento di colonie di Vespa con un gran numero di raccogliere un numero maggiore di uova sono anche migliorati e definiti. Inoltre, per accelerare l'allineamento dell'embrione, è sviluppato un dispositivo di allineamento di embrione che consente per gli embrioni di essere allineati in modo efficiente e iniettato senza dover utilizzare nastro adesivo su due lati per proteggere gli embrioni in posizione (Figura 3).

Inoltre, si è accertato che mantenendo gli embrioni umido con acqua durante l'iniezione e non essiccare gli embrioni o coprendole con olio migliorato i tassi di sopravvivenza. Inoltre, diversi tipi di vetro capillare sono testati e sono determinati parametri per costruire gli aghi perfetti per il microinjection N. vitripennis (tabella 1, Figura 4). Inoltre, seguenti microiniezione, sopravvivenza dell'embrione tariffe sono in grado di aumentare in modo significativo a causa di incubazione uova iniettate in pre-stung host collocati in camere di alto-umidità (70%). Queste innovazioni consentono una procedura più snella e successo di microiniezione per N. vitripennis.

Piccole modifiche in termini di apparato di iniezione e procedure di allevamento possono essere fatto al presente protocollo, a seconda delle preferenze dell'utente. Tuttavia, un numero di passaggi critici sarà essenziale per la generazione di mutanti con successo in N. vitripennis. Ad esempio, lavorando rapidamente affinché embrioni iniettati sono > vecchio h 1 e assicurando che gli aghi per iniezione sono abbastanza nitide minimizzare i danni per l'embrione sia sarà essenziale. Mentre questo protocollo dovrebbe essere efficace per la generazione di mutazioni nei geni di molti (se non tutti), uno dei principali limiti è il requisito di CRIPSR/Cas9 di destinazione una sequenza di PAM (NGG) che detterà alla sequenza di destinazione.

In conclusione, questa tecnica migliorata può essere utilizzata per generare molti tipi di modificazioni del genoma, come mutazioni, delezioni e forse anche inserimenti utilizzando CRIPSR/Cas9 tecnologie²¹, o persino transgene inserimenti per generare transgenici N. vitripennis, che dovrebbe accelerare notevolmente la ricerca funzionale in questo organismo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugdorm	Bugdorm	41515	Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes	Fisher Scientific	982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata	Carolina Insects	144440
Microelectrode Beveler	Sutter Instruments	BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)	Sutter Instruments	104E
Micromanipulator	World Precision Instruments	Kite R
Femtojet Express programmable microinjector	Eppendorf
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 or P-2000
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Compound Microscope	Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)	Sutter Instruments	BF100-58-10	Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs	JAECE	L800-B	Foam plugs
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3
Micro Cover glass	VWR	48366045
Adhesive	Aron Alpha	AA471	For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush	ZEM	2595
Ultra-fine tip forcep	Fisher Scientific	16-100-121
Femtotips Microloader tips	Fisher Scientific	E5242956003