태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

요약

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

초록

보석 말 벌 Nasonia vitripennis 섹스 결정, haplo 2 중 섹스 결정, 독이 합성, 그리고 호스트 symbiont 상호 작용, 다른 사람의 사이에서 포함 하 여 프로세스의 연구에 대 한 효과적인 모델 시스템으로 떠오르고 있다. 이 유기 체와 협력의 주요 한계 감독된 게놈 수정 작업을 수행 하는 효과적인 프로토콜의 부족 이다. 게놈 수정의 중요 한 부분 시 약, CRISPR/Cas9 분자를 포함 하 여 microinjection 통해 배아로 편집의 배달입니다. Microinjection 많은 모형 유기 체에서 잘 설립,이 기술은 특히 도전 명. vitripennis 에서 그것의 작은 태아 크기 및 배아 개발이 완전히 내 발생 하는 사실 때문에 주로 수행 하는 개미의 blowfly 번데기입니다. 다음 절차는 호스트 pupae, 그들, microinjecting 개미의 말 벌 배아에서 효과적으로 제거 하기 위한 유선형, 영상 절차를 시연 하 고 호스트에 다시 신중 하 게 그들을 이식 하는 동안 이러한 중요 한 문제 극복 에 대 한 지속 개발. 이 프로토콜은 강하게이 유기 체에 있는 게놈 고급 수정 작업을 수행 하는 연구 그룹의 기능을 향상 시킵니다.

서문

보석 말 벌 명. vitripennis, Sarcophaga bullata¹등 파리를 먹고 육체의 ectoparasitoids는 Nasonia 속 내의 4 종 중 하나입니다. 그들의 빠른 세대 기간, 실험실, 그리고 독특하고 중요 한 생물 학적 특성의 범위에서 양육의 용이성으로 인해 명. vitripennis 전통적인 모형 유기 체에서 발견 하는 여러 실험 도구 개발에 대 한 집중 되었습니다. . 예를 들어 일부 독특한 생물 학적 특성 등 haplo-2 중 복제 시스템², 미생물 및 유전자 기생충^3,4, 관계는 supernumary (B) 염색체^{5,6 ,7}. 함께 찍은,이 게 명. vitripennis 독 생산^8, 를 포함 한 다른 사람 뿐만 아니라이 프로세스의 분자와 세포질 측면 elucidating 겨냥 하는 실험에 대 한 중요 한 실험 시스템 ⁹, 섹스 결정^10,11, 그리고 진화 그리고 개발 축 패턴 형성^12,,1314의. 또한, N의 생물학 연구 유전 툴키트. vitripennis 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다 또는 그래서,¹⁵고해상도 게놈 시퀀싱과 여러 유전자 발현 연구^16,,1718, 그리고 기능적으로 의존 하는 RNA 간섭 (RNAi)^19,20을 함께 향상 추적성 및 반전 유전학이 유기이 체에서 수행의 기능 하는 유전자 발현을 방해 하는 능력.

많은 중요 한 과학적인 전진 및 확장 된 툴킷이 유기이 체에,에 불구 하 고 현재의 지식으로 한 그룹은 성공적으로 수행 상속 게놈 수정²¹생성 하 미 발달 microinjections. 이것은 그들은 매우 연 약하고 작은, 되 고 ~2/3 초파리 melanogaster 태아, 그들 일반적으로 어렵게 조작할 수의 크기 명. vitripennis 의 배아를 사용의 어려움 때문에 주로 이다. 또한, 명 vitripennis 여성 embryogenesis, 애벌레, 번데기 개발의 전체 발생을 미리 쏘 blowfly pupae로 그들의 계란을 입금. 따라서, 성공적인 microinjections, 사전 blastoderm 단계에 대 한 배아 해야 효율적으로 수집 호스트 pupae, 신속 하 게 microinjected, 그리고 즉시 개발에 대 한 그들의 호스트에 다시 이식에서. 이 단계 정밀 및 microinjected 배아 또는 예외적으로 도전 하는 기술을 만드는 번데기 호스트의 손상을 방지 하려면 손 재주가 필요 합니다. 도 불구 하 고, 북 아 일 vitripennis 태아 microinjection²²를 설명 하는 10 년 전 동안 출판 한 짧은 프로토콜입니다. 그러나,이 절차 갓 누워 배아 포장해 될 필요, 그것은 microinjection를 위한 계란 앵커를 끈적끈적한 테이프를 사용 하 여 기술의 시각적 데모를 포함 하지 않습니다. 따라서, 상속 게놈을 생성 하기 위해 어떤 기본적인 연구소에 의해 따라 할 수 있는 북 아 일 vitripennis 태아 microinjections에 대 한 향상 된 단계별 프로토콜을 상세하게 비주얼 절차를 포함 하는 업데이트 및 수정 된 프로토콜은 여기에 설명 된 이 중요 한 모델 곤충에 수정입니다.

프로토콜

1. 북 아 일 Vitripennis 식민지 양육

1. 여러 식민지를 설정 (~ 3-5) 버그 기숙사 장에 200-500 북 아 일 vitripennis 성인 (여자: 남자의 3:1 비율)을 배치 하 여.
   참고: 버그 기숙사, 말 벌을 사용 하도 여러 개의 작은 유리 시험관 약 15-20 말 벌/유리병으로 목화와 함께 연결에서 전파 수 있습니다.
   1. 25 ± 1 ℃ 30% 상대 습도, 12시 12분 빛 어두운 주기에, 1:10 (v/v)의 작은 물방울으로 매일 그들을 먹이에 말 벌을 유지 자당/물 솔루션.
      주: 말 벌 식민지 및 전파 제어 습도; 없이 실내 온도에 지휘 될 수 있다 또한 그러나, 온도 25 ° C는 배아의 발달 타이밍을 낮출 것 이다 약간 보다 낮은.
2. 말 벌 주사 전에 적어도 4 일 동안 친구를 허용 합니다.
   1. 처음 2 일 동안 신선한 먹이를 성관계 여성 수 1:10 (v/v)의 작은 방울으로 서 S. bullata pupae, 자당/물 솔루션.
   2. 다음 2 일에 대 한 산란 사이트, 그들을 아주 벗 만들기의 여성 말 벌을 박탈 하 blowfly 번데기를 제거 합니다.

2. 수집 및 북 아 일 Vitripennis 전 blastoderm 단계 배아의 맞춤

1. Parasitize에 여성 말 벌 허용 (배아 oviposit) 젊은 주인 (S. bullata pupae)으로. 유지 하기 위해 호스트 신선한, 즉시 그들을 취득 후 4 ° C에서 호스트를 저장 하 고 필요할 때만 제거.
   참고: 젊은 호스트 이전 호스트 어두운 컬러 puparium (그림 1A) 반면 빨간 색된 puparium를 함으로써 확인할 수 있습니다.
   1. 개별 신선한 S. bullata 장소 번데기 크기의 구멍을 가진 거품 스 토퍼에 pupae 중심으로 잘라. 노출만 ~ parasitization와 쉽게 태아 컬렉션의 최대 농도 대 한 호스트의 앞쪽 끝 (선호 산란 사이트)의 0.2 cm.
      참고: 앞쪽 끝은 반올림, 후부 끝은 두꺼운 ' 분화구 같은 ' 오프닝 (그림 1B)를 포함 하는 동안.
   2. 으로이 배열에서 호스트 번데기 (100 벌 당 대략 5 호스트 pupae)을 놓고 말 벌 그들 (그림 2- ii) parasitize을 허용 하도록 대략 45 분을 기다려야 합니다.
      참고: 그것은 매우 중요 하다는 배아, 어린 이상적으로, 사전 blastoderm 단계에 다는 것을 보장 하기 위해 oviposited의 첫 번째 시간. 오래 된 배아 (> 1.5 h) 주입 수 없습니다.
   3. 손으로 고 부드럽게 칫 솔 질/외면 어떤 거주 말 벌 들을 검색 하 여 개미의 호스트를 제거 합니다. 후 신선한 호스트와 함께 그들을 대체 모든 ~ 15 분 일찍 주사 하는 동안 계란을 개최 수집 계속.
2. 케이지에서 손으로 갓 parasitized 호스트를 제거 합니다. 현미경으로 해, 겸 자를 사용 하 여 신중 하 게 멀리 명. vitripennis 계란 (그림 2- 3 세) 노출 외부 puparium (번데기 껍질)의 후부 끝 (0.4 cm) 껍질.
   참고: 합니다 주의 번데기 피부; puncturing 방지 이 경우는 hemolymph microinjection에 대 한 제거 하기 매우 어려울 것입니다 말 벌 배아 축 축 하 게 됩니다.
3. 액체 접착제를 사용 하 여 태아 맞춤 슬라이드 (그림 3)를 준비 하는 깨끗 한 유리 슬라이드에 coverslip 접착제.
   그러나 참고: 높은 성능 인스턴트 접착제 본드 강도 높이기 위해 사용 되 고 건조 속도,에서 슬라이드에 주위를 움직이고는 coverslip 유지할 수 있는 어떤 접착제는 허용.
4. 箱 호스트 로부터 신중 하 게 젖은 미세 팁 붓 호스트의 부드러운 번데기 피부를 손상 하지 않도록 만드는 배아.
   참고: ' 배아를 선택,'는 본질적으로 ultrafine 집게의 쌍의 절반을 붓 대신 사용할 수 있습니다.
5. 전송 ~ 20 배아 하나 하나에 슬라이드, 젖은 붓으로 coverslip의 측면에 인접 한. 태아의 뒤 끝은 같은 방향으로 (그림 2- 4) 지적을 커버 슬라이드의 가장자리에 대 한 배아의 앞쪽 끝을 방향을 정하십시오. 이것은 모든 배아 중 동일한 위치에 주입의 높은 정밀도 대 한 허용.
   참고:이 향상 된 기술은 배아^21,22위에서 설명한 대로 슬라이드를 해결 하기 위해 이중 면 끈끈한 테이프를 필요 하지 않습니다. 또한, 태아만 하거나 마십시오 주입 명. vitripennis 태아 microinjection²²위에서 설명한 대로 동안 halocarbon 기름으로 계란을 커버.

3. 바늘 준비 Microinjections

1. 장소에 바늘 끌어당기는 aluminosilicate 모 세관 유리.
   참고: 좋은 바늘은 성공적인 명. vitripennis 에 대 한 중요 한 태아 주사. 주사 바늘은 샤 프와는 chorion 통해 쉽게 침투 수 있도록 미세 팁 있어야 합니다. 석 영 및 붕 규 산 모 세관 바늘은 또한 일 수 있다 (그림 4)를 사용.
2. 605 하 열 , 속도 130, 80 지연 , 당겨 70, 및 500 압력 바늘 끌어당기는 사람에 설정 합니다.
   참고: 추가 바늘 끌어당기는 설정 석 영 및 붕 바늘을 당기는 표 1;에서 볼 수 있습니다. 매개 변수는 다른 pullers 및 필 라 멘 트에 대 한 달라질 수 있습니다.
3. 활성화를 만드는 올바른 바늘 바늘 끌어당기는 사람. 여러 개의 바늘의 생산을 위해 필요에 따라 반복 합니다.
   참고: 가져온된 바늘 여러 병렬 상업 모델러 클레이의 롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 배치 하 여 저장할 수 있습니다.
4. 다이아몬드 연마 플레이트 약 10에 팁으로 약간 바늘 팁을 경사 25 ° c (그림 2- 3 세) s.
   참고: 주사 바늘 동시에 바늘을 통해 regents의 흐름을 강화 하면서 최소한의 피해와 배아로 항목을 홍보 하 여 빗면에서 혜택.

4. 태아 Microinjection

1. 게놈 수정 시 약 (예: transposon + 도우미 transposase, 또는 CRIPSR 시 약 등),구성 된 주입 혼합물을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
2. Microloader 팁을 사용 하 여 주입 바늘 주입 혼합물의 2 µ L와 함께 로드 합니다.
   참고: 프로토콜에서 주입 혼합 단일 가이드 RNA (sgRNA) (s) 및 H₂o.에서에서 혼합 재조합 Cas9 단백질의 구성
3. 복합 현미경의 무대에 줄지어 배아와 유리 슬라이드를 놓습니다.
4. 조심 스럽게 25-35 °의 각도 수직으로 태아의 뒤 끝에 바늘을 삽입 합니다.

주사 주입 혼합물 (배아의 볼륨의 약 2-10%)의 1-5 pL 고 태아 혼합물 (그림 2- 4) 주입으로 약간 팽창에 나타나는지 확인 합니다.
참고: 너무 많은 주입 혼합 배아에 주입 하는 경우 그것은 수 있습니다 버스트 배아에서 세포질을 밝혀. 또한, 잘못 경사지 또는 바늘의 너무 큰 깨진 여 배아 파열을 일으킬 수 있습니다.

1. 막힘 발생 하는 경우 다시 경사지 바늘을 보십시오. 명. vitripennis 배아의 세포질은 비정상적으로 점성 및 스티커, 자주 바늘 (1/25 주사) 막힘에 이르게.
   참고: 그것은 드 이온된 수는 붓을 사용 하 여 정기적으로 추가 하 여 주입 기간 동안 태아를 축축한 유지 하는 것이 중요입니다. 브러시에 물 양은 배아를 이동 및 쉽게 정렬 키입니다. 너무 많은 물을 부동 및 너무 작은 물 그들 어려운 주위에 이동 하 게 하는 배아 발생 합니다.
2. 주사 ~ (약 10 분 소요 한다) 한 번에 20-40 알 다음 중지. 주입 된 달걀을 가볍게 만져 젖은 붓으로 주입 된 달걀을 전송 하 고 호스트에 그들을 배치. 달걀의 배치를 계획 사용 하 여 다시 신선한 새로 주입 계속 (> 1 시간 이전).
   참고: 이상적으로이 프로토콜은 가장 효과적인, 한 사람이 지속적으로 수집 하 고 달걀을 줄 경우 다른 사람 주입 게놈 수정 구성 요소 이며 호스트 pupae에 주입 된 배아를 이식 하는 동안.

5. Injected G₀ 명. vitripennis Pre-stung 호스트에 배아 이식

1. 이전 쏘 이다 S. bullata 에 주입 된 G₀ 배아를 신중 하 게 배치 microinjection 후 젖은 붓으로 번데기 (그림 2- 6).
   참고: microinjection에 대 한 배아를 수집 하는 데 사용 하는 호스트 pupae이이 목적을 위해 작동 합니다. 또한, 상당한 노력에도 불구 하 고 현재는 사용된²²수 있는 사용할 수 있는 인공 다이어트입니다.
   1. 인구 과잉과 애벌레 경쟁을 피하기 위해 단일 미리 쏘 호스트에 한 번에 40까지 주입 된 배아 하나를 놓습니다.
      참고: 주입은에 손상을 태아; 호스트 pupae에 주입 된 배아의 부주의 이식 주입 된 컴포넌트나, 노른자위를 짜 내 고 배아의 죽음으로 이어질 수 있습니다.
2. 호스트 pupae 젖은 필터 종이와 면봉, 페 트리 접시에 놓고 주입된 태아 (대략 1-2 일)이 부 화까지 약 70%의 습도와 25 ° C에서 그들을 품 어 (그림 2- 7 세).
   참고: 중요 한 것은, 호스트 남아 있을 수 있습니다는 벗 겨와 함께 puparium 고 명 vitripennis 계란 개발할 것입니다 일반적으로 너무 오랫동안 그들은 건조를 방지 하기 위해 습도 챔버 (젖은 필터 종이와 면봉 배양 접시)에서 알을 품는. 습도 제어할 수 없는 경우에 약화 면봉에서 습도 실 온에서 배양 하는 것은 충분 합니다.
3. G₀ 배아 해치 후 70%의 습도 25^°C에서 새로운 배양 접시에 호스트 pupae를 전송.
   1. 호스트 pupae와 주입된 G₀ 애벌레를 매일 모니터링 합니다. 만약 호스트 pupae 파울 냄새, 새로운 건강 pupae를 주입된 애벌레를 전송.

6. 게놈 수정에 대 한 심사

1. 좋은 붓 또는 배아 선택을 사용 하 여 호스트에서 각 명. vitripennis pupae를 제거 합니다. 주입 된 G₀ 애벌레 약 8 일 포스트 주입을 pupate 한다.
2. 목화와 함께 연결 된 격리 된 유리 유리병으로 각 제거 번데기를 배치 하 고 G₀ 성인, 빗금된 여성 된다는 것 처녀 다운스트림 유전 십자가 함께 도움이 될 것입니다 보장으로 등장 하도록 허용.
   참고: 여성 정렬할 수 있습니다 남성에서 날개 길이: 암컷 몸 프로필 옆에 설정 과거를 확장 하는 긴 날개를가지고. 모든 microinjected 여성 pupae 연결된 유리병에 함께 놓일 수 있다 그리고 같은 남성 pupae에 적용 됩니다.
3. 일수로, 어느 PCR 또는 시각적으로 후 화면 G₀ 개인 (phenotypic 유전자를 방해) 하는 경우. 예를 들어 CRISPR는 삭제 특정된 유전자에 방해 유전자 표시 형 수 여 하는 경우 다음 정렬 하 고 영향을 받는 형 (그림 2- 8 세)의 돌연변이 체 버전 개인 유지²¹. 그러나, 영향을 받는 유전자는 필수적인 유전자의 돌연변이 등 보이지 않는 표현 형에 대 한 인코딩 하는 경우 복구에 대 한 화면을 횡단 체계 (크로스 G₀ 와 야생 타입 여성, 남성 또는 교차 G₀ 에서 야생 유형으로 여성) 수행 시 금 치 또는 무 균을 통해 상속 돌연변이입니다.
   참고: D. melanogaster, N. vitripennis 성인과 유사한 CO₂ 간단 조작에 대 한 허용에 노출에 의해 움직일 수 있다. 또한, unmated 여성 줄 것 이다 상승 100% 단일 남성 broods, 따라서 돌연변이 unmated 여성 후속 분석을 위해 사용 될 수 있는 돌연변이 남성의 많은 수를 야기할 수 있는.
   노트: 필수 유전자에 돌연변이 살아남은 G₀ 주입 여성 (아마도 heterozygous 돌연변이 대 한) 야생 타입 남성;에 짝짓기에 의해 유지 되어야 할 것 이다 G₁ 여성 자손의의 치명적인 것이 특정 한 경우 G₁ 남성 자손의 절반 치명적인 돌연변이의 상속으로 인해 죽을 한다.
4. Outcross G₀ 성인과 화면 G₁ 자손 transgene 삽입 경우 목표는 transgenesis transgenesis 마커를 사용 하 여에 대 한. 현재 transgenesis 명. vitripennis에 설명 될 남아 있습니다.

결과

이 프로토콜 식민지 양육, 사전 blastoderm 배아 컬렉션, 정렬, microinjection, 및 주입 후 후속 이식에 대 한 자세한 지침을 제공 하 고 효율적인 게놈 엔지니어링 명. vitripennis에서 사용할 수 있습니다. 그림 2에서처럼 명. vitripennis 으로 성공적인 microinjection에 대 한 단계의 일반적인 순서 포함: (i) 남성과 여성의 성인 친구 허용 (~ 4 일)에 배치 (ii) 공급 신선한 호스트 비행 pupae (S. bullata)는 성관계 암컷과 산란에 대 한 허용 수정된 폼 플러그 (~ 45 분), (iii) 폭로 하 고 사전 blastoderm 단계 말 벌 배아를 수집 개미의 호스트 pupae 표 피 박 리 멀리 신중 하 게 (~ 15 분), 배아를 수집 (4) 정렬 (~ 15 분), (v) 배아로 microinjecting 게놈 수정 구성 요소 (~ 15 분), (vi) 신중 하 게 배치 주입된 태아 적절 한 개발을 위한 수 있도록 미리 쏘 호스트에 다시 (~ 15 분), (vii) 전송 하 여 주입된 태아/호스트의 탈수를 방지 하 고 약 70%의 상대 습도와 습도 챔버로 그들 (~ 15 분). 개미의 호스트 다음 명. vitripennis 배아의 완전 한 개발을 위한 수 있도록 약 14 일 동안 알을 품는. 일단 주입, 성인 (8 세) 호스트에서 등장, 격리, 친구, 고 예상된 돌연변이의 존재에 대 한 그들을 개별적으로 화면.

효과적인 바늘 침투와 북 아 일 vitripennis 배아로 microinjection에 대 한 여러 종류의 석 영, aluminosilicate, 그리고 붕 형식을 포함 하 여 필 라 멘 트와 모 세관 유리 바늘을 테스트 합니다. 그것은 바늘의 품질은 파손/주입, 동안 막힘 방지 및 두 배아 생존 및 변환 효율의 높은 속도 달성 하기 위한 중요 한 발견. 각 유리 유형에 대 한 효과적인 프로토콜 원하는 피하 같은 긴 팁 명. vitripennis 태아 microinjection 다른 micropipette pullers (P-1000, 및 P-2000)를 사용 하 여에 대 한 효과적인 위해서는 바늘을 개발 되었다 (표 1 그림 4).

절차를 최적화 하려면 생존 율 게놈 수정 부품의 다양 한 금액의 주입에 따라 측정 됩니다. 여기에 사용 된 게놈 수정 구성 요소 했다 혼합된 가이드 RNAs와 편집, CRISPR 중재 게놈에 대 한 Cas9 단백질 명. vitripennis²¹에서 잘 작동 하도록 이전 시연 했다. 무엇는 이전에 유사한 보고, 여기 단사 유전자 설계 및 합성 sgRNA 타겟팅. 대상으로이 유전자를 방해 함으로써, 쉽게 식별 phenotypic 변화 유기 체^19,21의 눈 색깔에 볼 수 있다. 다양 한 sgRNA의 농도 결합 하는 주입 혼합물 (0, 20, 40, 80, 160, 그리고 320 ng / µ L) Cas9 단백질 (0, 20, 40, 80, 160, 그리고 320 ng / µ L) 야생 타입 명. vitripennis의 배아에 주입 되 고. 주입 된 배아의 생존 율은 복용량-의존 (표 2)²¹발견 된다. 감소 생존 율 (표 2), 아마도 첨가제 오프 대상 효과 때문에 sgRNA와 Cas9 단백질의 증가 농도. 높은 습도 (~ 70%)은 낮은 습도로 호스트, 이식 후 배아 생존을 위해 중요 한 것 또한 발견 (~ 10%) 모든 삽입 된 배아를 100% 죽음 귀착되 었 다.

그림 1 . 호스트 pupae의 준비 (S. bullata) 에 대 한 명. vitripennis 배아 산란. (A) 영 하 고 오래 된 S. bullata 번데기입니다. 반면 젊은 번데기는 그들의 표 피에 더 붉은 색조 이전 pupae 어두운 표 피가 있다. 젊은 pupae 산란을 극대화에 대 한 선호 됩니다. 번데기의 후부와 앞쪽 끝도는 "분화구 같은 오프닝 후부에, 앞쪽 끝 둥근된 포인트를 제공 하는 반면에 의해 구별 될 수 있다. (B) 북 아 일 vitripennis 배아 산란. 에 대 한 호스트 (S. bullata) 번데기 준비 호스트 번데기는 번데기 했다 거품 플러그에 삽입 구멍을 크기. 앞쪽 끝의 0.2 cm 앞쪽 영역으로 산란의 최대 농도 대 한 허용 노출 플러그 내부 호스트 pupae 얼굴의 후부 측면을가지고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . 타임 라인을 만들기 위한 명. vitripennis microinjection에 의해 돌연변이. 명. vitripennis 배아 컬렉션, CRISPR/Cas9 microinjection, 및 포스트 주입 절차의 연대표 명. vitripennis 성인 산란 사이트의 부재에 (나)는 4 일에 대 한 친구 허용 되었다. 는 신선한, 육체 비행 호스트 pupae, S. bullata, 후부 끝의 0.5 c m만 노출로 거품 스 토퍼 안에 parasitization (ii) 수 있도록 45 분 벗 암컷에 도입 되었다. 동시에 microinjection 바늘 및 CRISPR/Cas9 구성 요소를 포함 하 여 주입 재료 (iii) 준비 되었다. 배아는 호스트 (iv)에서 수집, (v), 정렬 되었고 구성 요소 CRISPR/Cas9 (vi)와 주입. 주입 된 배아 신중 하 게 미리 쏘 호스트 (7 세)에 다시 전송 그리고 완전 개발된 (14 일) (8 세)까지 알을 품을. 성인 등장, 돌연변이 대상 유전자 (ix)의 예상된 CRISPR/Cas9 유발 돌연변이 들의 고기에 대 한 상영 했다. 전체 절차는 일반적으로 19 일 걸립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . 안 감에 배아 수정된 현미경 슬라이드. (A) A coverslip입니다. (B) 현미경 슬라이드입니다. (C)는 배아 줄 맞춤 장치.coverslip 주입 선 배아에 사용 되는 현미경 슬라이드에 붙어 있을 수 있습니다. coverslip의 목적은 쉽게 조작 및 배아의 수 있도록 가장자리 역할 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 . 주사 바늘 준비. 좋은 나쁜 aluminosilicate 유리 바늘의 (A) 예. (B) unbeveled, 올바르게 경사진 고 가난 하 게 경사진된 바늘의 팁. Aluminosilicate 유리 모 세관 튜브 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 뽑아 했다. 생산된 바늘 팁은 다음 부드럽게 열리고는 beveler를 사용 하 여 정제. 좋은 비스듬한 바늘은 매우 날카로운 팁, 그리고 나쁜 비스듬한 바늘은 무딘 팁. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

유리 모 세관 타입	셔터 바늘 끌어당기는 모델	열	필 라 멘 트	속도	지연	풀	압력
석 영	P-2000	750	4	40	150	165	-
Aluminosilicate	P-1000	605	-	130	80	70	500
붕 규 산	P-1000	450	-	130	80	70	500

표 1입니다. 바늘 끌어당기는 사람에 대 한 설정입니다.
주: 바늘 끌어당기는 설정이 다 기계에서 기계 각 실험실 그들의 자신의 바늘 끌어당기는 설정을 최적화 해야 합니다. 이 테이블 리 외 에서 수정 되었습니다. ²¹

sgRNA-1	Cas9	총 배아	이식 (10% 습도)	이식 (70% 습도)
			애벌레 생존자	애벌레 생존자	성인 생존자
			총 (%)	총 (%)	♂	♀	총 (%)
아니 주입	아니 주입	100	94 (94)	96 (96)	66	26	92 (92)
물	물	100	0 (0)	78 (78)	44	32	76 (76)
20 ng / µ l	20 ng / µ l	100	0 (0)	74 (74)	34	34	68 (68)
40 ng / µ l	40 ng / µ l	100	0 (0)	67 (67)	30	32	62 (62)
80 ng / µ l	80 ng / µ l	100	0 (0)	53 (53)	24	22	46 (46)
160 ng / µ l	160 ng / µ l	100	0 (0)	41 (41)	16	22	38 (38)
320 ng / µ l	320 ng / µ l	100	0 (0)	25 (25)	10	10	20 (20)

표 2입니다. 주입 및 이식 survivorship 및 mutagenesis 요금 sgRNA와 Cas9의 다른 농도의 주사에 따라. 이 테이블 리 외 에서 수정 되었습니다 ²¹

토론

명. vitripennis 게놈의 최근 시퀀싱은 기능적으로 하이 종²³내 알 수 없는 유전자 분자 도구에 대 한 중요 한 필요를 나 가길 기다립니다. CRISPR-Cas9 시스템, 그리고 많은 다른 유전자 편집 도구, 다양 한 유기 체²⁴에 대 한 유전자 기능 조사에 도움이 될을 입증 했다. 그러나, 상속 돌연변이 생성 하려면이 도구 태아 microinjections 수행 필요. 따라서, 여기는 효율적인 허용 하는 혁신의 번호를 포함 하는 자세한 시각적 기술 시연 명. vitripennis 태아 microinjections.

전반적으로,이 상세한 기술은 기존 방법²³에 관하여 중요 한 혁신의 번호를 제공 하는 수 있도록 효율적인 명. vitripennis 태아 microinjections. 예를 들어 태아의 급속 한 컬렉션을 촉진 하기 위하여 산란 도구 (거품 스 토퍼) 만들어지고 크게 내 수많은 배아의 수집을 용이 하 게 하는 호스트 (그림 1)의 후부 끝에 완전히 누워 계란을 제한 하는 데 사용 시간의 짧은 기간. 계란의 더 큰 숫자를 수집 하는 큰 숫자와 함께 말 벌 식민지를 양육에 대 한 기술도 개선 하 고 정의 된. 또한, 태아 맞춤 가속, 배아를 효율적으로 조정 하 고 이중 면 끈끈한 테이프를 사용 하 여 장소 (그림 3)에서 태아를 보호 하지 않고 주입을 허용 하는 배아 줄 맞춤 장치 개발 된다.

또한, 그것은 배아를 주입 하지 desiccating 배아 또는 기름으로 그들을 취재 하는 동안 물으로 촉촉한 유지 하 여 생존 율 향상을 발견. 또한, 여러 가지 모 세관 유리 종류는 시험 고 명 vitripennis microinjection (표 1, 그림 4)에 대 한 완벽 한 바늘을 구성 하는 매개 변수 결정 됩니다. 또한, 다음과 같은 microinjection, 배아 생존 요금은 미리 쏘 호스트에 주입 된 달걀 잠복기로 인해 증가할 수 높은 습도 (70%) 챔버에 배치. 이러한 혁신 명. vitripennis에 대 한 더 간소 하 고 성공적인 microinjection 절차에 대 한 수 있습니다.

주입 장치 및 절차를 양육 사소한 수정 사용자 환경 설정에 따라,이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계를 성공적으로 명. vitripennis에 돌연변이 생성 하기 위한 필수적인 것입니다. 예를 들어 작업 신속 하 게 삽입 된 배아는 > 1 h와 주사 바늘이 태아에 손상을 최소화 하기 위해 충분히 샤 프 둘 다 필수적인 것입니다. 이 프로토콜은 많은 (그렇지 않으면 모두) 유전자에 돌연변이 생성 하기 위한 효과적 이어야 한다, 하는 동안 한 가지 주요 한계는 대상 시퀀스를 쓰게 됩니다 팸 (NGG) 시퀀스를 대상으로 CRIPSR/Cas9 요구 사항입니다.

결론적으로,이 향상 된 기술은 게놈 수정, 삭제, 돌연변이 등의 많은 종류를 생성 하 고 어쩌면 유전자 변형 생성 하 CRIPSR/Cas9 기술²¹또는 심지어 transgene 삽입을 사용 하 여 삽입을 사용할 수 있습니다. 명. vitripennis는 크게이 유기 체 기능 연구를 가속 한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugdorm	Bugdorm	41515	Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes	Fisher Scientific	982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata	Carolina Insects	144440
Microelectrode Beveler	Sutter Instruments	BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)	Sutter Instruments	104E
Micromanipulator	World Precision Instruments	Kite R
Femtojet Express programmable microinjector	Eppendorf
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000 or P-2000
Stereo Microscope	Olympus	SZ51
Compound Microscope	Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)	Sutter Instruments	BF100-58-10	Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs	JAECE	L800-B	Foam plugs
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-A3
Micro Cover glass	VWR	48366045
Adhesive	Aron Alpha	AA471	For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush	ZEM	2595
Ultra-fine tip forcep	Fisher Scientific	16-100-121
Femtotips Microloader tips	Fisher Scientific	E5242956003