Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños

Resumen

Se describe un método para investigar la capacidad de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata, para alargar a través de espacios estrechos (~ 1 μm) en un dispositivo de microfluidos.

Resumen

In vivo, células de la planta creciendo de punta necesitan superar una serie de barreras físicas; sin embargo, los investigadores carecen de la metodología para visualizar el comportamiento celular en esas condiciones restrictivas. Para solucionar este problema, hemos desarrollado cámaras de crecimiento de la punta de crecimiento de células de vegetales que contienen una serie de brechas estrechas, fabricado de micro (~ 1 μm) en un sustrato de poly-dimethylsiloxane (PDMS). Este material transparente permite al usuario monitorizar procesos de alargamiento de punta en celdas individuales durante la penetración de microespacios por proyección de imagen de Time-lapse. Usando esta plataforma experimental, observamos cambios morfológicos en los tubos de polen como penetraron los microespacios. Capturamos los cambios dinámicos en la forma de un núcleo vegetativo fluorescencia etiquetada y espermatozoides en un tubo de polen durante este proceso. Además, hemos demostrado la capacidad de pelos radicales y musgo protonemata para penetrar el espacio μm 1. Esta plataforma en vitro puede utilizarse para estudiar cómo individuales las células responden a espacios físicamente limitados y puede proporcionar penetraciones en los mecanismos de crecimiento de la punta.

Introducción

Después de los granos de polen germinan en un estigma, cada grano produce un solo tubo de polen que transporta espermatozoides el óvulo y la célula central en el óvulo para la fertilización doble. Tubos de polen alargado a través del estilo y eventualmente alcanzar el óvulo detectando múltiples señales de orientación a lo largo de la manera¹. Durante la elongación, tubos de polen se encuentran una serie de barreras físicas; la pista que está llena de células y tubos de polen debe entrar en el minuto abertura micropilar del óvulo para llegar a su destino (figura 1A)². Por lo tanto, tubos de polen deben tener la capacidad de penetrar obstáculos físicos, mientras se tolera el esfuerzo de compresión de su entorno. Pelos de la raíz son otro tipo de célula vegetal crece en punta que debe soportar obstáculos físicos en el ambiente, en forma de partículas de suelo compacto (figura 1B).

Se han estudiado diversas propiedades mecánicas del tubo polínico, incluyendo presión de turgencia y rigidez de la región apical de la célula, que puede ser medida usando el método de plasmólisis incipiente^3,4 y microscopía de fuerza celular (CFM) ^{5 , 6}, respectivamente. Sin embargo, estos métodos solos no revelan si los tubos de polen son capaces de alargar a través de barreras físicas a lo largo de sus trayectorias de crecimiento. Una técnica alternativa que permite el alargamiento del tubo polínico ser monitoreado en vivo es de microscopia de dos fotones⁷. Sin embargo, con este método, es difícil de observar los cambios morfológicos en los tubos de polen dentro del tejido del óvulo. Además, crecimiento de pelos en el suelo puede ser visualizado usando el tomography de la radiografía computada (CT) y resonancia magnética (MRI)⁸, aunque con baja resolución. Aquí, presentamos un método que puede utilizarse para adquirir imágenes de alta resolución del proceso de deformación de las células en un microscopio convencional.

El objetivo general del método descrito aquí es visualizar la capacidad de elongación de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz, y musgo protonemata, en espacios muy pequeños. Los microdispositivos de poly-dimethylsiloxane (PDMS) presentadas en este manuscrito son ópticamente transparentes y de aire permeable, podemos cultura células vivas dentro del aparato y observar sus comportamientos de crecimiento bajo un microscopio. También es posible crear micro ~ espacios de escala nanométrica por la técnica de litografía blanda⁹ con el uso de moldes. Estas características nos permiten estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en un entorno físicamente confinado.

En este trabajo, había construido 1 μm ancho vacíos (a 4 μm de altura) en dispositivos microfluídicos y examinó la capacidad de los tubos de polen para penetrar estos obstáculos artificiales que son mucho más pequeños que el diámetro del tubo polínico cilíndrico (aproximadamente 8 μm). Esta plataforma experimental nos permite visualizar ante del tubo polen microgaps y capturar imágenes de lapso de tiempo de la respuesta, que proceso de deformación de la célula. También desarrollamos los microdispositivos que pueden utilizarse para investigar la capacidad de penetración de pelos radicales y musgo protonemata. Microdispositivos varios se han divulgado hasta la fecha que permiten la visualización de las plantas raíz^10,11,12,13 y musgo protonemata¹⁴ en alta resolución. En nuestro dispositivo, una serie de canales de crecimiento del pelo de la raíz perpendicular está conectado a una cámara de crecimiento de la raíz, y los pelos de la raíz (aproximadamente 7 μm de diámetro) son guiados a canales fluídicos con una brecha amplia de 1 μm. También cultiva musgo protonemata (aproximadamente 20 μm de diámetro) en una microdevice que contiene microgaps para examinar sus respuestas a estas barreras físicas. El enfoque propuesto de microfluidos nos permite explorar la capacidad de varias células de plantas de cultivo de punta de alargar por espacios extremadamente pequeños, que no pueden ser examinadas por cualquier otro método disponible actualmente.

Protocolo

1. fabricación de la Microdevice PDMS para examinar el crecimiento tubos de polen y musgo Protonemata

Nota: Se utilizó un instrumento Fotolitografía maskless para preparar moldes PDMS en obleas de silicio. Los detalles sobre el funcionamiento del sistema se omiten en este manuscrito. Una técnica de fotolitografía estándar⁹ usando un photomask puede usarse para crear los moldes PDMS se describe en este manuscrito.

1. Vierta 11 g de mezcla de los polímero PDMS (elastómero base: curado agente a una relación de 10:1) en cada molde de 4 pulgadas.
2. Desgasificar el molde preparado en el paso 1.1 durante 20 minutos en una cámara de vacío.
3. Después de curar a 65 ° C durante 90 minutos en un horno, pelar la capa PDMS del molde y perforar los orificios de acceso en los canales fluídicos utilizando punzones de biopsia.
   Nota: Para el dispositivo del tubo polínico, el tamaño del agujero debe ajustarse para reflejar el diámetro del pistilo. Este valor por lo tanto variará según las especies. En este experimento, perfora un agujero de 1 mm para las entradas de pistilo y orificios de 1,5 mm para los embalses de medio líquidos. Para el dispositivo de musgo protonemata, un agujero de 4 mm fue utilizado para el depósito de la muestra.
4. Exponer la capa PDMS y un plato de fondo de vidrio (3.5-5 cm de diámetro) para plasma de 50 de aire s.
5. Presione la capa PDMS en el plato de fondo de cristal y el calor a 65 ° C por 30 min en un horno de convección no sellar completamente desconectado de la red de microfluidos.

2. fabricación de la Microdevice PDMS para pelos radicales

1. Repita los pasos 1.1-1.3 usando los moldes para preparar dos capas PDMS para la raíz y microdispositivos de pelo de la raíz.
   Nota: Se utilizaron un agujero de 2 mm para los embalses de medio líquidos en el microdevice de raíz.
2. Exponer ambas capas PDMS para plasma de 50 de aire s.
3. Montar las dos capas PDMS bajo un estereomicroscopio con un alineador de escritorio a medida.
   Nota: Los microcanales en estas capas PDMS tienen cara. Antes de ensamblar, asegúrese de que coinciden las marcas de alineación en ambas capas.
4. Calentar a 65 ° C por 30 min en un horno de convección no sellar completamente desconectado de la red de microfluidos.
5. Quite el cubreobjetos la microdevice construida y coloque el dispositivo sobre un plato de fondo de cristal que es de 5 cm de diámetro.

3. preparación de medio de cultivo celular In Vitro para los tubos de polen (Torenia fournieri)

1. Preparar medio de Nitsch modificada como se describe anteriormente¹⁵ y autoclave el medio a 121 ° C por 20 min.
   Nota: La composición del medio de Nitsch de modificado es NH₄NO₃ (80 mg/L), KNO₃ (125 mg/L), Ca (NO₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂PO₄ (125 mg/L ), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), ZnSO₄‧7H₂O (0, 5 mg/L), H₃BO₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0.025 mg/L), Na₂MoO₄‧2H₂O (0.025 mg/L), sacarosa (50.000 mg/L) y caseína (500 mg/L). El medio preparado puede almacenarse a 4 ° C por 4 meses por lo menos.
2. Preparar polietilenglicol 26% (w/v) usando autoclave agua desionizada y filtrar la solución con un filtro de poro 0.3 μm.
   Nota: El medio preparado puede almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.
3. Mezclar los reactivos preparados en el paso 3.1 y 3.2 en una proporción de 1:1 (v/v).
   Nota: Este medio debe ser preparado fresco para cada uso.

4. preparación de medio de cultivo celular In Vitro para pelos radicales (Arabidopsis thaliana)

1. Preparar una solución de 0,215% (w/v) Murashige & Skoog medio, 0.05% (w/v) MES, 1% (p/v) de sacarosa y 1% (p/v) de agar en agua desionizada. Autoclave de la solución a 121 ° C por 20 min.

5. preparación de medio de cultivo In Vitro de células de musgo Protonemata (Physcomitrella patens)

1. Incubar previamente la protonemata musgo en medio BCDAT¹⁶ en una placa Petri.
   Nota: La composición del medio BCDAT es 1 mM MgSO₄, 10 mM KNO₃, 45 μm FeSO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ (pH a 6.5 con KOH), solución de elementos traza (0,22 μm CuSO₄, 0.19 μm ZnSO₄y 10 μm H₃BO ₃, 0.1 μm Na₂MoO₄, 2 μm MnCl₂, 0.23 μm CoCl₂y 0,17 μm KI), 1 mM CaCl₂y 5 mM diamónico (+)-tartrato.
2. El musgo en el medio BCDATG en el microdevice de la cultura.
   Nota: El medio BCDATG es medio BCDAT con glucosa 0,5% (p/v). El medio preparado puede almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.

6. cultivo in Vitro de T. fournieri tubos de polen en el Microdevice

1. Colocar el tubo polínico microdevice en una cámara de vacío y desgasificación durante 20 minutos.
2. Retire el microdevice de la cámara de vacío e introducir el medio de crecimiento a la entrada de pistilo mediante una micropipeta con punta muy fina. Llenar los pozos restantes a sus tapas con el mismo medio. Espere unos minutos hasta que los microcanales se llenan con el medio por el vacío creado dentro de los microcanales.
3. Colocar algunas toallas de papel mojado en el plato de fondo de cristal para mantener la humedad en el plato.
4. Transferencia de los granos de polen de un tipo salvaje T. fournieri flor 'azul y blanca' a su estigma utilizando una aguja de disección.
   Nota: También se realizó este experimento con un transgénico T. fournieri 'Corona violeta' flor ( RPS5Ap::H2B-tdTomato línea¹⁷), con tubos de polen que contienen fluorescencia etiquetadas espermatozoides y los núcleos vegetativos.
5. Corte el estilo polinización (1 cm de largo) usando una cuchilla.
6. Introduzca el estilo de corte en la entrada del dispositivo como se muestra en la figura 2.
7. Ponga una tapa en el plato y séllelo con cinta.
8. Coloque el dispositivo en una incubadora a 28 ° C durante 5-6 h en la oscuridad.

7. cultivo in Vitro de a. thaliana pelos de la raíz en el Microdevice

Nota: Los pasos 7.1 7.9 (a excepción de 7.3 y 7.5) deben realizarse en una campana de flujo laminar.

1. Esterilizar las semillas de a. thaliana Columbia (Col-0) y los transgénicos línea UBQ10pro::H2B-mClover (contiene el marcador nuclear fluorescente) por inmersión en líquido estéril (cloro 5% (v/v) y 0,02% (v/v) Triton X-100) durante 5 minutos.
2. Enjuague bien las semillas esterilizadas con agua esterilizada.
3. Almacenar las semillas enjuagadas en agua durante 2 días a 4 ° C en oscuridad.
4. Esterilizar microdevice bajo luz UV durante la noche.
5. Colocar el microdevice en una cámara de vacío y desgasificación durante 20 minutos.
6. Introducir el medio de crecimiento para los pozos en el dispositivo utilizando una micropipeta. Espere unos minutos hasta que el vacío llena todos los microcanales con el medio.
7. Coloque toalla de papel húmeda esterilizado en el plato de fondo de cristal para mantener la humedad en el plato.
8. Transferencia de una semilla esterilizada en la entrada del dispositivo.
9. Ponga una tapa en el plato y séllelo con cinta.
10. Coloque el dispositivo en posición vertical en una incubadora a 22 ° C bajo luz blanca continua.
11. Controlar el crecimiento del cabello de la raíz después de 4 a 10 días de incubación. Obtener campo brillante y fluorescentes imágenes usando un microscopio invertido.

8. cultivo in Vitro de p. patens (moss) Protonemata en el dispositivo de microfluidos

Nota: Medidas 8.2-8.6 (excepto 8.3) deben realizarse en una campana de flujo laminar.

1. Preculture p. patens cepa Gransden 2004¹⁸ en medio BCDAT cubierta con celofán en caja Petri durante una semana bajo luz blanca continua a 25 ° C.
2. Esterilizar microdevice bajo luz UV durante la noche en una campana de flujo laminar.
3. Colocar el microdevice en una cámara de vacío y desgasificación durante 20 minutos.
4. Introducir el medio de crecimiento en los pozos utilizando una micropipeta. Espere unos minutos hasta que el vacío llena todos los microcanales con el medio.
5. Agregue el agua esterilizada en el plato alrededor de la microdevice para mantener la humedad en el plato.
6. Transferencia de una pequeña pieza de musgo protonemata tejido a la entrada de la microdevice y el tejido en una incubadora a 25 ° C bajo luz blanca continua de la cultura.
7. Controlar el crecimiento de musgo protonemata después de 2-3 semanas de incubación. Obtener imágenes de campo claro utilizando un microscopio.

9. proyección de imagen de Time-lapse del crecimiento del tubo polínico de T. fournieri

1. Coloque el microdevice en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con hardware de adquisición de imagen (por ej., una cámara CCD) y el software. Encontrar los lugares de microespacios.
   Nota: Para el software de adquisición de imagen, hemos utilizado un producto comercialmente disponible (Tabla de materiales). Software libre de la microscopia como µManager también está disponible en línea (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Recomendamos instalar un condensador del microscopio en el microscopio para obtener imágenes de mayor resolución.
2. Capturar imágenes de campo claro cada 10 s con software de adquisición de imágenes de microscopio.
3. Para observar la fluorescencia etiquetadas espermatozoides y núcleo vegetativo en el tubo de polen de la línea RPS5Ap::H2B-tdTomato , irradiar la muestra con 561 nm láser y utilizar un filtro óptico de paso de banda (578/105 nm).
   Nota: Aunque con frecuencia se capturaron las imágenes de Time-lapse del crecimiento del tubo polínico, la proyección de imagen no parece afectar el crecimiento. Sin embargo, es siempre aconsejable para reducir al mínimo la intensidad del láser, el tiempo de exposición y el intervalo de Time-lapse, para minimizar la fototoxicidad y fotoblanqueo de fluoróforo.
4. Ajustar el brillo y el contraste de las imágenes y preparar un archivo de vídeo utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Resultados

Como se ilustra en la figura 1, las células vegetales creciendo de punta encuentran una serie de barreras físicas a lo largo de sus trayectorias de crecimiento in vivo. Microfluídicos en vitro de la célula cultura plataformas presentadas en este estudio permitió la examinación el cultivo de punta de procesos en tres tipos de células de la planta (tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata) a través de las lagunas artificia...

Discusión

Varios pasos críticos en el protocolo deben seguirse exactamente para obtener los resultados presentados arriba. En primer lugar, el PDMS vidrio y capa inferior plato las superficies deben ambos ser tratadas con plasma una suficiente cantidad de tiempo antes de la adhesión. De lo contrario, la capa PDMS localmente puede separarlo de la superficie de cristal mientras que la punta de crecimiento de las células atraviesan el microgaps. Otro paso crucial en el protocolo de pelos y musgo protonemata es la esterilización d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices