JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем способ исследовать возможности растущего кончика растительных клеток, включая пыльцы трубы, корневые волоски и Мосс protonemata, чтобы растянуть через чрезвычайно узкие щели (~ 1 мкм) в устройство microfluidic.

Аннотация

В естественных условиях, подсказка выращивания растительных клеток необходимо преодолеть целый ряд физических барьеров; Однако исследователи отсутствие методологии для визуализации клеточных поведение таких ограничительных условий. Для решения этой проблемы, мы разработали роста камеры для растущего кончика растительных клеток, которые содержат ряд узких, микро сфабрикованы пробелов (~ 1 мкм) в субстрате поли dimethylsiloxane (PDMS). Этот прозрачный материал позволяет пользователю контролировать кончик удлинение процессы в отдельных клетках во время проникновения микро покадровой изображений. С помощью этой экспериментальной платформы, мы наблюдали морфологические изменения в пыльцы трубы, как они проникли микро. В ходе этого процесса мы захватили динамические изменения в форме дневно обозначенные вегетативные ядра и сперматозоиды в пробирке пыльцы. Кроме того мы продемонстрировали возможности корневой волосы и protonemata мох проникнуть 1 мкм разрыв. Эта платформа в vitro могут быть использованы для изучения как отдельные клетки реагируют на физически ограниченного пространства и может обеспечить понимание механизмов Совет роста.

Введение

После того, как зерна пыльцы прорастают на клеймо, каждое зерно производит один пыльцы труба, которая несет сперматозоиды яйцеклетка и центральная ячейка в яйцеклетку для Двойное оплодотворение. Пыльца трубы удлиненное через стиль и в конечном итоге достичь яйцеклетку путем зондирования несколько указания подсказки вдоль их способ1. Во время удлинения пыльца трубы сталкиваются ряд физических барьеров; передавая трек наполнен клетки, и пыльца трубы необходимо ввести минуту micropylar открытие яйцеклетку для достижения их целей (рис. 1A)2. Таким образом пыльца трубы должны иметь способность проникать физических препятствий, а терпимое отношение напряжений от их окружения. Корневые волоски являются еще одним типом растущего кончика растительной клетки, которые должны выдерживать физические препятствия в окружающей среде, в виде Упакованные почвенных частиц (рис. 1B).

Были изучены различные механические свойства труб пыльцы, включая тургор и жесткость клетки апикальной региона, которая может быть измерена с помощью зарождающегося плазмолиза метод3,4 и клеточных силовой микроскопии (CFM) 5 , 6, соответственно. Однако эти методы только не свидетельствуют ли пыльцы трубы способны удлинения через физические барьеры на пути их роста. Альтернативный метод, который позволяет удлинение трубки пыльцы наблюдаемого в естественных условиях — микроскопия два фотона7. Однако, с помощью этого метода, трудно наблюдать морфологические изменения в отдельных труб пыльцы глубоко внутри ткани яйцеклетку. Кроме того рост корня волос в почве могут быть визуализированы с помощью рентгеновская компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ)8, хотя и с низким разрешением. Здесь мы представляем метод, который может использоваться для приобретения изображения с высоким разрешением процесса деформации клетки на обычных микроскопа.

Общая цель метода, описанного здесь является для визуализации возможность удлинения подсказка выращивания растительных клеток, включая пыльцы трубы, корневые волоски и Мосс protonemata, в очень малых пространствах. Как микроприборов поли dimethylsiloxane (PDMS), представленные в этой рукописи оптически прозрачны и воздуха проницаемой, мы можем культура живых клеток внутри устройства и наблюдать за их поведением роста под микроскопом. Это также возможно для создания микро ~ нанометровом масштабе запрещено техника мягкой литографии9 с использованием формы. Эти функции позволяют нам изучить возможность удлинения подсказка выращивания растительных клеток в физически ограниченном среде.

В этой работе мы построен 1 мкм большой разрыв (4 мкм в высоту) в microfluidic приборы и изучил пыльцы трубок способность проникать эти искусственные препятствия, которые намного меньше, чем диаметр цилиндрических труб пыльцы (примерно 8 мкм). Эта экспериментальная платформа позволяет нам визуализировать пыльцы трубки ответ на microgaps и снимки промежуток времени ответа, которые отслеживать процесс деформации клетки. Мы также разработали Микроустройства, который может использоваться для изучения возможности проникновения корневой волосы и protonemata мох. Несколько микроприборов поступили на сегодняшний день, позволяющие визуализации корень10,11,12,13 и Мосс protonemata14 роста растений с высоким разрешением. В нашем устройстве ряд каналов корня волос роста связаны перпендикулярно к камере роста корня, и отдельные корневые волоски (примерно 7 мкм в диаметре) руководствуются аэрогидродинамических каналов с 1 мкм большой разрыв. Мы также выращиваются Мосс protonemata (примерно 20 мкм в диаметре) в микроустройств, содержащие microgaps для изучения их ответы на эти физические барьеры. Предлагаемый подход, основанный на microfluidic позволяет нам исследовать возможности клеток различных подсказка растущих растений удлиненное через чрезвычайно малых пространств, которые не могут быть рассмотрены любых других имеющихся в настоящее время методом.

протокол

1. Изготовление микроустройств PDMS для изучения выращивания пыльцы трубы и Мосс Protonemata

Примечание: Мы использовали maskless фотолитографии инструмент для подготовки PDMS плесени на кремниевых пластин. Детали относительно функционирования системы опущены в этой рукописи. Стандартный фотолитографии техника9 с помощью photomask может также использоваться для создания плесени PDMS, описанные в этой рукописи.

  1. Налить 11 g предварительной полимерной смеси PDMS (эластомер базы: Вулканизирующий агент в соотношении 10:1) в каждой 4-дюймовый плесень.
  2. Дега плесень, подготовленную на этапе 1.1 для 20 мин в вакуумной камере.
  3. После отверждения при 65 ° C 90 мин в не конвекционная печь, пил PDMS слой от плесени и Пробейте отверстия для доступа в оптимизированных каналы с помощью биопсии ударов.
    Примечание: Для пыльцы трубки устройства, размер отверстия должны быть скорректированы для отражения диаметр пестика. Это значение будет варьироваться от видов. В этом эксперименте мы ударил 1 мм отверстие для впускателей пестик и 1,5 мм отверстия для жидкого средних водохранилищ. Для устройства protonemata Мосс 4 мм отверстие был использован для образца водохранилище.
  4. Подвергать PDMS слой и блюдо дно стекла (3,5-5 см в диаметре) воздуха плазмы 50 s.
  5. Нажмите PDMS слой в блюдо дно стекла и тепла при 65 ° C на 30 мин в не конвекционная печь полностью отрезать microfluidic сети.

2. Изготовление микроустройств PDMS для корневых волосков

  1. Повторите шаги с помощью формы подготовить два слоя PDMS для корня и корневого волоска микроприборов 1.1-1.3.
    Примечание: Мы использовали отверстие 2 мм для жидкого средних водохранилищ в корневом микроустройств.
  2. Разоблачить оба PDMS слоя воздуха плазмы 50 s.
  3. Соберите два слоя PDMS под стереомикроскопом, используя заказные Обои каппу.
    Примечание: Микроканалов на этих слоях PDMS должны лицом друг к другу. Перед монтажом, убедитесь, что выравнивание марок на обоих слоёв совпадают.
  4. Тепло на 65 ° C для 30 мин в не конвекционная печь полностью отрезать microfluidic сети.
  5. Удалите крышку выскальзования из построенных микроустройств и поместите устройство на блюдо дно стекла, что составляет 5 см в диаметре.

3. Подготовка из среднего культуры In Vitro клеток пыльцы трубы (Torenia fournieri)

  1. Подготовьте модифицированных Нитша среднего как описано ранее,15 и автоклав среды при температуре 121 ° C 20 мин.
    Примечание: Состав среды доработанную нич-NH4не3 (80 мг/Л), KNO3 (125 мг/Л), Ca (№3)2‧4H2O (500 мг/Л), O (125 мг/Л), MgSO4‧7H2х2PO4 (125 мг/Л ), O (3 мг/Л), O (0,5 мг/Л), ZnSO4‧7H2H3MnSO4‧4H2Бо3 (10 мг/Л), CuSO4‧5H2O (0,025 мг/Л), Na2MoO4‧2H2O (0,025 мг/Л), сахароза (50 000 мг/Л) и казеина (500 мг/Л). Подготовленный среднего может храниться при температуре 4 ° C для 4 месяцев по крайней мере.
  2. Подготовить полиэтиленгликоль 26% (w/v), с помощью газобетона деионизированной воды и фильтров решение с фильтром поры 0,3 мкм.
    Примечание: Подготовленные среднего может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.
  3. Смешайте реактивы, подготовленную на этапе 3.1 и 3.2 в соотношении 1:1 (v/v).
    Примечание: Эта среда должны быть готовы свежие для каждого использования.

4. Подготовка В пробирке клеток питательной среды для корневых волосков (Arabidopsis thaliana)

  1. Приготовляют раствор сахарозы 0.215% (w/v) фотосинтетическую & Скуг средний, 0,05% (w/v) МЧС, 1% (w/v), и 1% (w/v) агар в деионизированной воде. Автоклав раствор при температуре 121 ° C 20 мин.

5. Подготовка In Vitro клеток питательной среды для Protonemata Мосс (Physcomitrella патента)

  1. Предварительно Инкубируйте protonemata Мосс в средние16 BCDAT в чашке Петри.
    Примечание: Состав BCDAT среды является 1 мм MgSO4, 10 мм KNO3, 45 мкм FeSO4, 1.8 мм х2PO4 (pH скорректирована до 6,5 с KOH), микроэлемента раствора (0.22 мкм CuSO4, 0.19 мкм ZnSO4, 10 мкм H3бо 3, 0,1 мкм Na2MoO4, 2 мкм НКД2, 0.23 мкм CoCl2и 0,17 мкм KI), CaCl 1 мм2и 5 мм Диаммонийфосфат (+)-Тартраты.
  2. Культура Мосс в BCDATG среде в микроустройств.
    Примечание: BCDATG среда является BCDAT средний с 0,5% (w/v) глюкозы. Подготовленный среднего может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц.

6. в пробирке Culturing т. fournieri пыльцы труб в микроустройств

  1. Микроустройств пыльцы трубки в вакуумной камере и Дега за 20 мин.
  2. Удаление микроустройств из вакуумной камеры и ввести среднего роста пестик входе с помощью микропипеткой с очень тонкой кончиком. Заполните оставшиеся скважин для их вершины с той же среде. Подождите несколько минут, пока все микроканалов заполнены с средний вакуум, созданный внутри микроканалов.
  3. Место некоторые влажной салфеткой в блюдо дно стекла поддерживать влажность в блюдо.
  4. Передача зерна пыльцы из дикого типа T. fournieri «синий и белый» цветок его стигмы, с помощью иглы рассечение.
    Примечание: Мы также провели этот эксперимент с трансгенных т. fournieri «Корона фиолетовый» цветок ( RPS5Ap::H2B-tdTomato линия17), с пыльцой пробирки, содержащие дневно обозначенные сперматозоиды и вегетативных ядер.
  5. Вырезать опыляются стиль (1 см длиной) с помощью лезвия.
  6. Вставьте вырезать стиль в входе устройства, как показано на рисунке 2.
  7. Поставьте крышку на блюдо и запечатать его с лентой.
  8. Поместите устройство в инкубаторе на 28 ° C за 5-6 ч в темноте.

7. в пробирке Culturing A. thaliana корневых волосков в микроустройств

Примечание: Шаги 7,1-7,9 (за исключением 7.3 и 7.5) должны быть выполнены в Ламинарный шкаф.

  1. Стерилизовать семена от A. thaliana Columbia (Col-0) и трансгенные линии UBQ10pro::H2B-mClover (содержащие маркер флуоресцентные ядерных) путем замачивания их в стерильной жидкости (5% (v/v) бытовой отбеливатель и 0,02% (v/v) X-100 Тритон) за 5 мин.
  2. Тщательно промойте стерилизованные семена газобетона водой.
  3. Храните промыть семена в воде в течение 2 дней при температуре 4 ° C в темноте.
  4. Стерилизуйте микроустройств под УФ света на ночь.
  5. Микроустройств в вакуумной камере и Дега за 20 мин.
  6. Представить скважин в устройстве с помощью микропипеткой среднего роста. Подождите несколько минут, пока вакуум заполнит все микроканалов со средой.
  7. Место газобетона намочите бумажное полотенце в блюдо дно стекла поддерживать влажность в блюдо.
  8. Перевод стерилизации семян на входе устройства.
  9. Поставьте крышку на блюдо и запечатать его с лентой.
  10. Поместите устройство вертикально в инкубаторе при 22 ° C под непрерывный белый свет.
  11. Проверьте рост корня волос после 4-10 дней инкубации. Получите яркой области и флуоресцентных изображений с помощью инвертированного микроскопа.

8. в пробирке Culturing P. патента (Мосс) Protonemata в устройстве Microfluidic

Примечание: Шаги 8.2-8,6 (за исключением 8.3) должна производиться в Ламинарный шкаф.

  1. Preculture P. patens штамм Gransden 200418 на носителе BCDAT покрыты целлофан в чашке Петри на одну неделю под непрерывный белый свет при 25 ° C.
  2. Стерилизуйте микроустройств под УФ светом ночь в Ламинарный шкаф.
  3. Микроустройств в вакуумной камере и Дега за 20 мин.
  4. Представить скважин с помощью микропипеткой среднего роста. Подождите несколько минут, пока вакуум заполнит все микроканалов со средой.
  5. Добавьте воду газобетона в блюдо, окружающих микроустройств поддерживать влажность в блюдо.
  6. Перевести небольшой кусочек ткани protonemata Мосс на входе микроустройств и культура ткани в инкубаторе при 25 ° C под непрерывный белый свет.
  7. Проверьте Мосс protonemata рост после 2-3 недели инкубации. Получите яркой области изображения с помощью микроскопа.

9. промежуток времени визуализации роста пыльцы трубка т. fournieri

  1. Место микроустройств на Перевернутый флуоресценции микроскопа, с изображением приобретение оборудования (например., CCD камера) и программного обеспечения. Найти места микро.
    Примечание: Для изображений приобретения программного обеспечения, мы использовали коммерчески доступных продукта (Таблица материалов). Микроскопия с открытым исходным кодом как µManager является также доступны онлайн (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Мы рекомендуем установить конденсатор Микроскоп на микроскопе для получения изображения более высокого разрешения.
  2. Захватить светлые области изображения каждые 10 сек с использованием микроскопа изображения приобретение программного обеспечения.
  3. Соблюдать дневно обозначенные сперматозоиды и вегетативные ядра в пыльцы трубе линии RPS5Ap::H2B-tdTomato , облучить образцы с 561 Нм лазер и использовать оптический фильтр полосовой (578/105 Нм).
    Примечание: Хотя промежуток времени изображения пыльцы трубки роста были захвачены часто, изображения не влияют на рост. Однако это всегда рекомендуется свести к минимуму лазерной интенсивности, времени экспозиции и промежуток времени интервала, чтобы свести к минимуму Фототоксичность и Фотообесцвечивание Флюорофор.
  4. Отрегулируйте яркость и контрастность изображений и подготовить видео файл с помощью ImageJ программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/).

Результаты

Как показано на рисунке 1, подсказка выращивания растительных клеток сталкиваются ряд физических барьеров на пути их роста в естественных условиях. Microfluidic в vitro клетки культуры платформ представлено в настоящем исследовании включено рассмот...

Обсуждение

Несколько важных шагов в протоколе необходимо следовать именно для получения результатов, представленных выше. Во-первых слой и стеклянных поверхностей нижней блюдо PDMS оба следует подходить плазмы для достаточное количество времени, прежде чем склеивания. В противном случае PDMS слой м...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим H. Цуцуи и D. Курихара за предоставление нам трансгенных растений, в том числе т. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato линия и линия A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , соответственно. Эта работа получила поддержку от института трансформативных био-молекул Нагойский университет и сеть науки Японии расширенный завод. Финансовую поддержку для этой работы была представлена грантами от Японии науки и технологии (проект ERATO Грант нет. JPMJER1004 для т.г.), субсидий для научных исследований в инновационных областях (Nos. JP16H06465 и JP16H06464 для т.г.) и Япония общества для поощрения науки (JSP) дотаций для сложных поисковых исследований (Грант № 26600061 для Нью-Йорк и Грант № 25650075 и 15 K 14542 для я.с.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PDMSDow Corning Co.Sylgard184
Murashige & Skoog MediumWako Pure Chemical392-00591
MESDojindo345-01625
SucroseWako Pure Chemical196-00015
50 mm glass-bottom dishMatsunami GlassD210402
35 mm glass-bottom dishIwaki 3971-035
Surgical bladeFeatherNo.11
biopsy punchesHarrisUni-Core
Gel loading tipsBio-Bik124-R-204
Inverted MicroscopeOlympusIX83
CSU-W1Yokogawa ElectricNo Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging softwareMolecular Devices

Ссылки

  1. Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
  2. Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
  3. Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
  4. Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
  5. Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
  6. Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
  7. Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
  8. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
  9. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  10. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  11. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
  13. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
  14. Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
  15. Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
  16. Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
  17. Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
  18. Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
  19. Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
  20. Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
  21. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135protonemata

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены