פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

Summary

אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.

Abstract

In vivo, תאי צמחים הגדלים טיפ צריך להתגבר על סדרה של מכשולים פיזיים; עם זאת, החוקרים חוסר המתודולוגיה להמחיש התנהגות הסלולר בתנאים מגבילים כאלה. כדי לטפל בבעיה זו, פותחו תאי צמיחה עבור עצה גידול הצמח תאים המכילים סדרה של פערים צר, מפוברק-מיקרו (~ 1 מיקרומטר) במצע פולי-dimethylsiloxane (PDMS). חומר שקוף זה מאפשר למשתמש לעקוב אחר עצה התארכות התהליכים תאים בודדים בזמן החדירה microgap על ידי הדמיה בצילום מואץ. באמצעות פלטפורמה ניסיוני זו, נצפו שינויים מורפולוגיים אבקה צינורות כפי שהם חדרו את microgap. אנחנו נתפס השינויים הדינמיים בצורה של גרעין וגטטיבי fluorescently שכותרתו ותאי הזרע צינור אבקה בתהליך זה. יתר על כן, אנו הפגינו את היכולת של שערות השורש, מוס protonemata לחדור הפער 1 מיקרומטר. פלטפורמה זו במבחנה ניתן ללמוד תאים מסוימים, להגיב מקומות מוגבל פיזית, עשוי לספק תובנות לגבי מנגנוני עצה-צמיחה.

Introduction

לאחר גרגרי אבקה לנבוט על סטיגמה, כל גרגיר מייצרת צינור אבקה יחיד שנושאת תאי זרע לתא הביצה, התא המרכזי להפרייה לדישון כפול. אבקה צינורות להאריך באמצעות הסגנון ולהגיע בסופו של דבר ביצית על ידי חישה רמזים הדרכה מרובים לאורך הדרך שלהם¹. במהלך התארכות, אבקה צינורות נתקל סדרה של מכשולים פיזיים; המסלול שידור מלא תאים, אבקה צינורות עליך להזין הפתח micropylar דקה של ביצית להגיע שלהם היעד (איור 1 א')². לכן, אבקה צינורות צריכה להיות יכולת לחדור מכשולים פיזיים, תוך כדי לנקוט הלחץ compressive של סביבתם. שערות השורש הינם סוג נוסף של גידול עצה תא צמח זה חייבים לעמוד חסימות בסביבת, בצורה של חלקיקי הקרקע ארוז (איור 1B).

תכונות מכאניות שונות הנביטה נחקרו, כולל לחץ טורגור הנוקשות של אזור הפסגה של התא, אשר ניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ כוח הסלולר פלסמוליזה התחלתית שיטה^3,4 (CFM) ^{5 , 6}, בהתאמה. עם זאת, שיטות אלה לבד אינם מגלים אם צינורות אבקה מסוגלים מתארך דרך מחסומים פיזיים לאורך נתיבים הצמיחה שלהם. טכניקה חלופית המאפשר התארכות הנביטה בפיקוח ויוו היא מיקרוסקופ שני הפוטונים⁷. עם זאת, בשיטה זו, קשה לצפות את שינויים מורפולוגיים צינורות בודדים אבקה עמוק בתוך הרקמה ביצית. בנוסף, צמיחת השיער שורש בקרקע, ניתן לאבחן באמצעות טומוגרפיה הממחושבת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ודימות תהודה מגנטית (MRI)⁸, אמנם עם רזולוציה נמוכה. כאן, אנו מציגים שיטה שבה ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תהליך דפורמציה של התא במיקרוסקופ רגיל.

המטרה הכוללת של השיטה המתוארת כאן היא להמחיש את היכולת התארכות של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, מוס protonemata, בחללים קטנים מאוד. כמו microdevices פולי-dimethylsiloxane (PDMS) הציג כתב יד זה שקופים שטיחות והאוויר חדיר, אנחנו יכולים התרבות תאים חיים בתוך המכשיר ובדוק אם צוינו והתנהגותם צמיחה תחת מיקרוסקופ. אפשרי גם ליצירת מיקרו ~ ננומטר רווחים בקנה מידה על ידי טכניקת הדפס אבן רכה⁹ עם השימוש בתבניות. תכונות אלה מאפשרות לנו ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בסביבה מוגבלת פיזית.

בעבודה זו, אנו נבנה 1 מיקרומטר רחב פערים (4 מיקרומטר בגובה) במכשירים microfluidic, בחן את היכולת של אבקה צינורות לחדור מכשולים מלאכותיים אלה, כי הם הרבה יותר קטן מאשר הקוטר של הצינור אבקה גלילי (כ 8 מיקרומטר). פלטפורמה ניסיוני זו מאפשרת לנו לדמיין של הנביטה בתגובה microgaps, ללכוד תמונות בצילום מואץ של התגובה, אשר לעקוב אחר תהליך דפורמציה של התא. פיתחנו גם את microdevices יכול לשמש כדי לחקור את יכולת החדירה של שערות השורש, מוס protonemata. מספר microdevices דווחו עד היום המאפשרים את החזיית שורש^10,11,12,13 ו מוס protonemata¹⁴ צימוח ברזולוציה גבוהה. במכשיר שלנו, סדרה של שורש השיער הצמיחה ערוצי מחוברות בניצב לתא צמיחה שורש, שורש בודדים שערות (כ 7 מיקרומטר בקוטר) מודרכים ערוצי fluidic עם פער רחב 1 מיקרומטר. אנחנו גם תרבותי מוס protonemata (כ 20 מיקרומטר בקוטר) ב- microdevice המכיל microgaps לבחון את התגובות שלהם את המחסומים הפיזיים. הגישה המוצעת מבוססת-microfluidic מאפשר לנו לבחון את היכולת של תאי צמחים שונים הגדלים עצה להאריך דרך חללים קטנים מאוד, אשר לא יכול להיבדק על ידי כל שיטה אחרת זמין כרגע.

Protocol

1. ייצור של Microdevice PDMS כדי לבחון גדל אבקה צינורות וטחב Protonemata

הערה: השתמשנו מכשיר פוטוליתוגרפיה maskless להכין בתבניות PDMS על שבבי סיליקון. הפרטים לגבי המבצע של המערכת מושמטים בכתב היד. טכניקת פוטוליתוגרפיה תקן⁹ באמצעות photomask עשוי לשמש גם ליצירת התבניות PDMS המתואר בכתב היד.

1. יוצקים 11 גרם של פולימר טרום PDMS תערובת (elastomer הבסיס: אשפרה הסוכן ביחס של 10:1) לתוך כל עובש 4 אינץ.
2. דגה כייר מוכן בשלב 1.1 עבור 20 דקות בתוך תא ואקום.
3. לאחר ריפוי-65 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות בתנור שאינו הסעת חום, לקלף את השכבה PDMS את העובש, מנקבים חורים גישה לתוך הערוצים fluidic באמצעות ביופסיה אגרופים.
   הערה: עבור ההתקן הנביטה, גודל החור חייב להיות מותאם כדי לשקף את הקוטר של העלי. ערך זה ישתנה ולכן על ידי מינים. בניסוי זה, אנחנו מנוקב חור 1 מ"מ עבור פתחי הכניסה העלי וחורים 1.5 mm עבור המאגרים בינוני נוזלי. עבור ההתקן protonemata מוס, חור 4 מ מ שימשה המאגר הדגימה.
4. לחשוף את השכבה PDMS ואת צלחת תחתית זכוכית (3.5-5 ס מ קוטר) לשידור פלזמה 50 s.
5. הקש את השכבה PDMS לתוך צלחת תחתית זכוכית חום-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שחומם ללא הסעה לאטום לגמרי את הרשת microfluidic.

2. ייצור של Microdevice PDMS של שערות השורש

1. חזור על שלבים 1.1-1.3 באמצעות התבניות כדי להכין שתי שכבות PDMS השורש ואת שורש השיער microdevices.
   הערה: השתמשנו חור 2 מ מ עבור המאגרים בינוני נוזלי ב microdevice השורש.
2. לחשוף את שתי שכבות PDMS האווירית, פלזמה 50 s.
3. שתי השכבות PDMS תחת stereomicroscope באמצעות aligner שולחן בהזמנה אישית להרכיב.
   הערה: microchannels את שכבות אלה PDMS להתייצב אחד את השני. לפני הרכבת, ודא כי הסימנים היישור על שתי שכבות התאמה.
4. חום-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שחומם ללא הסעה לאטום לגמרי את הרשת microfluidic.
5. הסר תגית כיסוי microdevice שלא נבנה ומניחים את המכשיר על צלחת תחתית זכוכית הוא 5 ס מ בקוטר.

3. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני אבקה צינורות (Torenia fournieri)

1. להכין בינוני של Nitsch ששונה כפי שתואר לעיל,¹⁵ והחיטוי המדיום ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   הערה: ההרכב של בינוני של Nitsch modifed הוא מלון NH₄₃ (80 mg/L), יודע₃ (125 מ ג/ליטר) Ca (₃)₂‧4H₂O (500 מ ג/ליטר), MgSO₄‧7H₂O (125 מ"ג/ליטר), ח'₂PO₄ (125 מ ג/ליטר ), MnSO₄‧4H₂O (3 מ ג/ליטר), ZnSO₄‧7H₂O (0.5 מ ג/ליטר), H₃בו₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0.025 mg/L), נה₂MoO₄‧2H₂O (0.025 mg/L), סוכרוז (50,000 mg/L), קזאין (500 mg/L). המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 ° C 4 חודשים לפחות.
2. להכין 26% (w/v) פוליאתילן גליקול באמצעות מים יונים בלוק ולסנן את הפתרון עם מסנן נקבובית מיקרומטר 0.3.
   הערה: המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
3. מערבבים את נוגדנים מוכנה בשלב 3.1 ו- 3.2 ביחס 1:1 (v/v).
   הערה: בינוני להכין טרי כל שימוש.

4. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני שערות השורש (תודרנית לבנה)

1. להכין פתרון של 0.215% (w/v) Murashige & Skoog בינוני, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) סוכרוז, ו- 1% (w/v) אגר במים יונים. אוטוקלב הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

5. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני מוס Protonemata (Physcomitrella patens)

1. מראש תדגור על protonemata מוס BCDAT בינוני¹⁶ בצלחת פטרי
   הערה: ההרכב של BCDAT בינוני הוא 1 מ MgSO₄, 10 מ מ יודע₃, 45 מיקרומטר מכל₄, מ מ 1.8 ח'₂PO₄ (pH להתאים ל- 6.5 עם קו), פתרון יסוד קורט (0.22 מיקרומטר CuSO₄, ZnSO מיקרומטר 0.19₄, 10 מיקרומטר H₃בו ₃, 0.1 מיקרומטר נה₂MoO₄, 2 מיקרומטר MnCl₂, מיקרומטר 0.23 CoCl₂ו- 0.17 מיקרומטר קי), 1 מ מ CaCl₂ו- 5 מ מ דיאמוניום (+)-tartrate.
2. תרבות האיזוב במדיום BCDATG, microdevice.
   הערה: המדיום BCDATG היא BCDAT בינונית עם 0.5% (w/v) גלוקוז. המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.

6. Culturing במבחנה של צינורות אבקה טי fournieri Microdevice

1. במקום microdevice את האבקה בתוך תא ואקום, דגה כעשרים דקות.
2. להסיר את microdevice מן החדר ואקום, להציג את מדיום הגידול לים פיסטיל באמצעות micropipette עם טיפ מצוין. למלא הבארות הנותרים על גגותיהם עם המדיום אותו. חכו מספר דקות עד כל microchannels את מלאים המדיום על ידי הוואקום שנוצר בתוך microchannels.
3. מניחים מגבת נייר רטובה קצת בצלחת התחתונה זכוכית כדי לשמור על הלחות בצלחת.
4. להעביר את גרגרי אבקה מפראי-סוג פרח "כחול ולבן" טי fournieri לסטיגמה שלה באמצעות מחט לנתיחה.
   הערה: גם ערכנו ניסוי זה עם הטרנסגניים טי fournieri 'כתר סגול' פרח ( RPS5Ap::H2B-tdTomato קו¹⁷), עם צינורות אבקה המכילה תאי זרע fluorescently שכותרתו, גרעינים וגטטיבי.
5. גזור הסגנון pollinated (1 ס"מ) באמצעות סכין.
6. הכנס את הסגנון לחתוך לתוך הים של המכשיר כמוצג באיור2.
7. לשים מכסה על המנה, לאטום אותו עם סרט.
8. למקם את המכשיר בתוך אינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך 5-6 h בחשכה.

7. Culturing במבחנה של שערות השורש לבנה א ב Microdevice

הערה: השלבים 7.1-7.9 (למעט 7.3 ו- 7.5) צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.

1. לעקר את הזרעים מקולומביה לבנה א (Col-0), הטרנסגניים קו UBQ10pro::H2B-מק'לאבר (המכיל את סמן גרעיני פלורסנט) בהשריה בנוזל סטרילי (מלבין ביתי 5% (v/v) ו- 0.02% (v/v) טריטון X-100) למשך 5 דקות.
2. לשטוף ביסודיות את הזרעים סטיריליים במים בלוק.
3. לאחסן זרעים שטופים במים במשך יומיים ב 4 ° C בחשכה.
4. לחטא את microdevice תחת אור UV בן לילה.
5. מניחים את microdevice תא ואקום, דגה כעשרים דקות.
6. להציג את מדיום הגידול לבארות את ההתקן באמצעות של micropipette. המתן מספר דקות עד הריק ממלא כל microchannels את המדיום.
7. מניחים מגבת נייר רטובה בלוק בצלחת התחתונה זכוכית כדי לשמור על הלחות בצלחת.
8. העברת זרע סטיריליים לתוך הים של המכשיר.
9. לשים מכסה על המנה, לאטום אותו עם סרט.
10. מניחים את המכשיר אנכית בתוך אינקובטור ב 22 ° C תחת אור לבן רציף.
11. בדוק צמיחת שורש השיער לאחר 4-10 ימי דגירה. להשיג את השדה החיובי והן פלורסנט תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.

8. Culturing במבחנה של patens פ (מוס) Protonemata את ההתקן Microfluidic

הערה: השלבים 8.2-8.6 (למעט 8.3) צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.

1. Preculture patens פ זן Gransden 2004¹⁸ באמצעי BCDAT מכוסה צלופן בצלחת פטרי לשבוע אחד תחת אור לבן רציף ב 25 º C.
2. לחטא את microdevice תחת אור UV ללון בתוך תא למינארי.
3. מניחים את microdevice תא ואקום, דגה כעשרים דקות.
4. להציג מדיום הגידול הבארות באמצעות של micropipette. המתן מספר דקות עד הריק ממלא כל microchannels את המדיום.
5. מוסיפים מים בלוק לתוך המנה המקיפים את microdevice כדי לשמור על הלחות בצלחת.
6. להעביר חתיכה קטנה של אזוב protonemata רקמות לים של microdevice ואת התרבות הרקמה באינקובטור 25 ° c תחת אור לבן רציף.
7. בדוק את הצמיחה protonemata מוס לאחר 2-3 שבועות של דגירה. להשיג תמונות שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ.

9. זמן לשגות הדמיה של צמיחה הנביטה טי fournieri

1. מניחים את microdevice על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם התמונה רכישת חומרה (למשל., מצלמת CCD) ותוכנות. למצוא את מיקומי microgap.
   הערה: עבור התוכנה רכישת התמונה, השתמשנו מוצר זמין מסחרית (טבלה של חומרים). תוכנת קוד פתוח מיקרוסקופ כגון µManager הוא גם זמין באינטרנט (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). אנו ממליצים להתקין את הקבל מיקרוסקופ על המיקרוסקופ להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה.
2. לכידת תמונות שדה בהיר כל 10 s באמצעות מיקרוסקופ תמונה רכישת תוכנה.
3. כדי לבחון את תאי הזרע fluorescently שכותרתו ואת גרעין וגטטיבי בצינור אבקה של קו RPS5Ap::H2B-tdTomato , להאיר את הדגימה. עם 561 ננומטר לייזר ולהשתמש מסנן אופטי bandpass (578/105 ננומטר).
   הערה: למרות תמונות בצילום מואץ של האבקה הצמיחה בה נתפסים לעתים קרובות הדמיה לא נראה להשפיע על הגדילה. עם זאת, תמיד מומלץ כדי למזער את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, מרווח זמן לשגות, כדי למזער את phototoxicity ואת photobleaching של fluorophore.
4. להתאים את הבהירות והחדות של התמונות והכן קובץ וידאו באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

תוצאות

כמופיע באיור1, תאי צמחים הגדלים עצה נתקלים סדרה של מחסומים פיזיים לאורך נתיבים שלהם צמיחה בתוך vivo. Microfluidic במבחנה תא תרבות פלטפורמות שהוצגו במחקר זה מופעל הבדיקה גידול עצה תהליך בשלושה סוגים של תאי צמחים (אבקה צינורות שערות השורש, מוס protonemata) באמצ?...

Discussion

מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול צריך להיות מלווה בדיוק כדי להשיג את התוצאות שהוצגו לעיל. ראשית, PDMS שכבת זכוכית התחתון מאכל משטחים שניהם להתייחס עם פלזמה עבור כמות מספקת של זמן לפני מליטה. אחרת, השכבה PDMS עשוי באופן מקומי ניתוק ממשטח הזכוכית בעוד תאי גידול עצה חוצה את microgaps. עוד צעד קריטי בפרוטו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices