Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um die Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, untersuchen und Moos Protonemata, zu verlängern, durch extrem schmale Lücken (~ 1 µm) in einem mikrofluidischen Gerät.

Zusammenfassung

In Vivo, Spitze wachsenden pflanzlichen Zellen müssen eine Reihe von physischen Barrieren zu überwinden; Allerdings fehlen Forscher die Methodik um zelluläre Verhalten in solchen restriktiven Bedingungen zu visualisieren. Um dieses Problem zu beheben, haben wir Klimakammern für Tipp-wachsende Pflanzenzellen, die eine Reihe von schmalen, Mikro-fabrizierten Lücken (~ 1 µm) enthalten in einem Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) Substrat entwickelt. Das transparente Material ermöglicht dem Benutzer, Tipp Dehnung Prozesse in einzelnen Zellen während der Mikrospalt Penetration durch Time-Lapse-Bildgebung zu überwachen. Mit Hilfe dieser experimentelle Plattform, beobachteten wir morphologische Veränderungen in pollenschläuche, wie sie der Mikrospalt eingedrungen. Die dynamischen Veränderungen in der Form eines eindringmittel beschrifteten vegetativen Kerns und Spermien in einem Pollen Rohr eingefangen wir während dieses Prozesses. Darüber hinaus haben wir die Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata, 1 µm Spalt durchdringen. Dieser in-vitro- Plattform verwendet werden, wie die einzelnen Zellen reagieren auf körperlich eingeschränkte Räume zu studieren und vielleicht geben Einblicke in Tipp-Wachstum-Mechanismen.

Einleitung

Nachdem Pollenkörner auf ein Stigma Keimen, produziert jedes Korn ein Pollen Rohr, die Spermien in die Eizelle und die zentrale Zelle in das Ovulum für doppelte Befruchtung führt. Pollenschläuche verlängern durch den Stil und erreichen schließlich das Ovulum durch Sensierung mehrere Anleitungen Hinweise entlang ihrem Weg¹. Während die Dehnung auftreten pollenschläuche eine Reihe von physischen Barrieren; die übertragende Strecke ist mit Zellen gefüllt und pollenschläuche müssen die Minute micropylar Eröffnung das Ovulum, erreichen ihr Ziel (Abbildung 1A)²eingeben. Daher müssen die pollenschläuche die Fähigkeit, physische Hindernisse, eindringen, während die Druckspannung aus ihrer Umgebung zu tolerieren. Wurzelhaare sind eine andere Art von Spitze wachsenden Pflanzenzelle, die physische Hindernisse in der Umgebung in Form von verpackten Bodenteilchen (Abbildung 1 b) standhalten muss.

Verschiedenen mechanische Eigenschaften des Rohres Pollen sind untersucht worden, darunter Turgor Druck und Steifigkeit der apikalen Region der Zelle, die mit dem beginnenden Plasmolyse Methode^3,4 und zelluläre Rasterkraftmikroskopie gemessen werden kann, (CFM) ^{5 , 6}, beziehungsweise. Diese Methoden allein zeigen jedoch nicht ob pollenschläuche durch physische Hindernisse entlang ihrer Wachstumspfade verlängern werden. Eine alternative Technik, mit dem Pollen Rohr Dehnung überwachten in Vivo zu kann ist zwei-Photonen-Mikroskopie-⁷. Mit dieser Methode ist jedoch schwierig zu beobachten, die morphologischen Veränderungen in einzelnen pollenschläuche tief in das Ovulum Gewebe. Darüber hinaus kann Root Haarwachstum im Boden mit visualisiert werden berechnet Röntgen-Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT)⁸, wenn auch mit geringer Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die verwendet werden, um hochauflösende Bilder von einer Zelle Verformung Prozess auf einem herkömmlichen Mikroskop zu erwerben.

Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist es, die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, zu visualisieren und Moos Protonemata, in sehr kleinen Räumen. Da die Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) abformverfahren präsentiert in dieser Handschrift optisch transparent sind und durchlässig, wir können Kultur lebenden Zellen im Inneren des Gerätes und ihr Wachstum Verhalten unter einem Mikroskop zu beobachten. Es ist auch möglich, Mikro erstellen ~ Nanometer Skala Räume durch die weiche Lithographie-Technik⁹ mit der Verwendung von Formen. Diese Funktionen ermöglichen es uns, die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in einer physisch beengten Umgebung zu studieren.

In dieser Arbeit, die wir gebaut 1 µm Breite Lücken (4 µm in der Höhe) in mikrofluidischen Geräten und untersucht die Fähigkeit der pollenschläuche, diese künstliche Hindernisse durchdringen, die viel kleiner sind als der Durchmesser des zylindrischen Pollen Rohr (ca. 8 µm). Diese experimentelle Plattform ermöglicht uns zu visualisieren die Pollen Rohr Reaktion auf Mikropausen und Zeitraffer-Bilder der Antwort, die die Zelle Verformung Prozess verfolgen zu erfassen. Wir haben auch die abformverfahren, die verwendet werden können, zu untersuchen, die Penetration Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata entwickelt. Mehrere abformverfahren wurden gemeldet, bis heute, die es ermöglichen die Visualisierung der Wurzel^10,11,12,Moos und¹³ Protonemata¹⁴ Pflanzenwachstum mit hoher Auflösung. In unserem Gerät eine Reihe von Wurzelhaare Wachstum Kanäle senkrecht zu einer Wurzel Wachstum Kammer verbunden sind, und einzelne Wurzelhaare (etwa 7 µm im Durchmesser) orientieren sich fluidische Kanäle mit einer 1 µm breite Lücke. Wir kultiviert auch Moos Protonemata (ca. 20 µm im Durchmesser) in einer mikroapparat mit Mikropausen um ihre Reaktionen auf diese physischen Barrieren zu untersuchen. Der vorgeschlagene mikrofluidischen basierenden Ansatz erlaubt uns, erkunden die Fähigkeit der verschiedenen Tipp wachsenden Pflanzenzellen zu verlängern durch extrem kleine Räume, die von keiner anderen derzeit verfügbaren Methode geprüft werden kann.

Protokoll

1. Herstellung von PDMS Mikroapparat, wachsen Pollenschläuche zu untersuchen und Moos Protonemata

Hinweis: Wir verwendet ein Instrument maskless Photolithographie PDMS Formen auf Silizium-Wafer vorzubereiten. Die Details zur Bedienung des Systems werden in dieser Handschrift ausgelassen. Ein standard Photolithographie Technik⁹ mit einer Fotomaske kann auch verwendet werden, um die PDMS Formen beschrieben in dieser Handschrift zu erstellen.

1. 11 g Pre-Polymer PDMS Mischung Gießen (Elastomer Basis: Härtemittel im Verhältnis 10:1) in jedem 4-Zoll-Form.
2. Entgasen Sie den Schimmel in Schritt 1.1 für 20 min in einer Vakuumkammer vorbereitet.
3. Nach der Aushärtung bei 65 ° C für 90 min in einem Umluftofen, schälen der PDMS-Schicht aus der Form und Zugang Löcher in die fluidische Kanäle mit Biopsie-Stanzen Stanzen.
   Hinweis: Für die Pollen Rohr Gerät, muss die Größe des Lochs angepasst werden den Durchmesser des Stempels. Dieser Wert variiert daher von Arten. In diesem Experiment gestanzt wir ein 1 mm Loch für die Stempel-Eingänge und 1, 5 mm Löcher für die flüssigen Mittel Stauseen. Für das Moos Protonemata Gerät wurde ein 4 mm Loch für das Probe-Reservoir verwendet.
4. Aussetzen der PDMS-Schicht und einer Glasschale unten (3,5-5 cm im Durchmesser) Luft-Plasma für 50 s.
5. Drücken Sie die PDMS-Schicht in die untere Glasschale und Wärme bei 65 ° C für 30 min in einem nicht-Umluftofen, mikrofluidischen Netzwerk komplett abzuschotten.

2. Herstellung von PDMS Mikroapparat für Wurzelhaare

1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.3 mit den Formen zwei PDMS-Schichten für die Wurzel und der Wurzelhaare abformverfahren vorzubereiten.
   Hinweis: Wir haben ein 2 mm Loch für den flüssigen mittlere Stauseen in der Wurzel mikroapparat.
2. Setzen Sie beide PDMS-Layer, um Luft-Plasma für 50 s.
3. Montieren Sie die beiden PDMS-Schichten unter einem Stereomikroskop mit einem maßgeschneiderten Desktop-Aligner.
   Hinweis: Die Mikrokanäle auf diese PDMS-Schichten müssen zueinander zeigen. Stellen Sie vor der Montage sicher, dass die Ausrichtungsmarken auf beiden Ebenen zusammenpassen.
4. Erwärmen Sie auf 65 ° C für 30 min in einem nicht-Umluftofen, mikrofluidischen Netzwerk komplett abzuschotten.
5. Entfernen Sie das Deckglas aus der konstruierten mikroapparat und stellen Sie das Gerät auf einer Glasschale unten, die 5 cm im Durchmesser ist.

3. Vorbereitung der In vitro- Zellkulturmedium Pollenschläuche (Torenia Fournieri)

1. Bereiten Sie modifizierte Nitsch Medium wie zuvor beschrieben¹⁵ und Autoklaven das Medium bei 121 ° C für 20 min.
   Hinweis: Die Zusammensetzung des Mediums der veränderten Nitsch ist NH₄NO₃ (80 mg/L), KNO₃ (125 mg/L), Ca (NO₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂PO₄ (125 mg/L ), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), ZnSO₄‧7H₂O (0,5 mg/L), H₃BO₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0,025 mg/L), Na₂MoO₄‧2H₂O (0,025 mg/L) Saccharose (50.000 mg/L) und Kasein (500 mg/L). Das vorbereitete Medium kann mindestens 4 Monate bei 4 ° C gespeichert werden.
2. 26 % (w/V) Polyethylenglykol mit autoklaviert deionisiertes Wasser bereiten und die Lösung mit einem 0,3 µm-Poren-Filter filtern.
   Hinweis: Das vorbereitete Medium kann bei 4 ° C für 1 Monat gespeichert werden.
3. Mischen der Reagenzien in Schritt 3.1 und 3.2 im Verhältnis 1:1 (V/V) vorbereitet.
   Hinweis: Dieses Medium sollte frisch für jeden Gebrauch vorbereitet werden.

4. Vorbereitung der In vitro- Zellkulturmedium Wurzelhaare (Arabidopsis Thaliana)

1. Bereiten Sie eine Lösung aus 0.215 % (w/V) Murashige & Skoog Medium, 0,05 % (w/V) MES, 1 % (w/V) Saccharose und 1 % (w/V) Agar in entionisiertem Wasser. Autoklaven die Lösung bei 121 ° C für 20 Minuten.

5. Vorbereitung der In vitro- Zellkulturmedium für Moss Protonemata (Physcomitrella Patens)

1. Pre-inkubieren Sie Moos Protonemata BCDAT mittlere¹⁶ in einer Petrischale.
   Hinweis: Die Zusammensetzung des BCDAT Mediums ist 1 mM MgSO₄, 10 mM KNO₃, 45 µM FeSO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ (pH 6,5 mit KOH angepasst), Spurenelement-Lösung (0,22 µM CuSO₄, 0,19 µM ZnSO₄, 10 µM H₃BO ₃, 0,1 µM Na₂MoO₄, 2 µM MnCl₂, 0,23 µM CoCl₂und 0,17 µM KI), 1 mM CaCl₂und 5 mM Diammonium (+)-Tartrat.
2. Kultur das Moos im BCDATG Medium in den mikroapparat.
   Hinweis: Das BCDATG Medium ist BCDAT Medium mit 0,5 % (w/V) Glucose. 1 Monat kann die vorbereitete Medium bei 4 ° C aufbewahrt werden.

6. in-vitro- Culturing von T. Fournieri Pollenschläuche in der Mikroapparat

1. Legen Sie die Pollen Rohr mikroapparat in einer Vakuumkammer und für 20 min entgasen.
2. Entfernen Sie die mikroapparat aus der Vakuumkammer und stellen Sie das Wachstumsmedium Stempel Einlauf mit einer Mikropipette mit einer sehr feinen Spitze. Füllen Sie die restlichen Brunnen, ihre Spitzen mit dem gleichen Medium. Warten Sie einige Minuten, bis die Mikrokanäle mit dem Medium durch das Vakuum im Inneren der Mikrokanäle gefüllt sind.
3. Legen Sie einige feuchten Papiertuch in untere Glasschale halten die Feuchtigkeit in der Schale.
4. Übertragen Sie die Pollenkörner von Wildtyp- T. Fournieri "blau und weiß" Blüte auf die Narbe mit einer Dissektion Nadel.
   Hinweis: Wir haben auch dieses Experiment mit einer transgenen T. Fournieri 'Crown violett' Blume ( RPS5Ap::H2B-TdTomato Linie¹⁷), mit pollenschläuche, eindringmittel beschrifteten Samenzellen und vegetative Kerne enthält.
5. Schnitt der bestäubten Stil (1 cm lang) mit Hilfe einer Klinge.
6. Einfügen Sie die geschliffenen Stil in den Einlass des Geräts, wie in Abbildung 2dargestellt.
7. Setzen Sie einen Deckel auf die Schüssel und mit Klebeband versiegeln.
8. Stellen Sie das Gerät in einem Inkubator bei 28 ° C für 5-6 h in der Dunkelheit.

7. in-vitro- Culturing von A. Thaliana Wurzelhaare in der Mikroapparat

Hinweis: Schritte 7.1-7.9 (mit Ausnahme von 7.3 und 7.5) sollten in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.

1. Samen von A. Thaliana Columbia (Col-0) zu sterilisieren und die transgene Linie UBQ10pro::H2B-mClover (mit den nuklearen fluoreszierenden Marker) durch Einweichen in sterile Flüssigkeit (5 % (V/V) haushaltsbleiche und 0,02 % (V/V) Triton x-100) für 5 Minuten.
2. Spülen Sie die sterilisierten Samen mit autoklaviert Wasser.
3. Speichern Sie die gespülten Samen in Wasser für 2 Tage bei 4 ° C in der Dunkelheit.
4. Sterilisieren Sie die mikroapparat unter UV-Licht über Nacht.
5. Legen Sie die mikroapparat in einer Vakuumkammer und für 20 min entgasen.
6. Die Brunnen in das Gerät mit einer Mikropipette stellen Sie das Wachstumsmedium vor. Warten Sie einige Minuten, bis das Vakuum die Mikrokanäle mit dem Medium füllt.
7. Legen Sie autoklaviert feuchten Papiertuch in untere Glasschale halten die Feuchtigkeit in die Schüssel.
8. Übertragen Sie eine sterilisierte Saat in den Einlass des Geräts.
9. Setzen Sie einen Deckel auf die Schüssel und mit Klebeband versiegeln.
10. Stellen Sie das Gerät vertikal in einem Inkubator bei 22 ° C unter weißes Dauerlicht.
11. Überprüfen Sie Root Haarwachstum nach 4-10 Tagen Inkubationszeit. Erhalten Sie Hellfeld und fluoreszierende Bilder mit einem inversen Mikroskop.

8. in-vitro- Culturing von p. Patens (Moos) Protonemata in mikrofluidischen Gerät

Hinweis: Schritte 8,2-8,6 (mit Ausnahme von 8,3) sollten in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.

1. Preculture p. Patens Stamm Gransden 2004¹⁸ auf BCDAT Medium bedeckt mit Cellophan in einer Petrischale für eine Woche unter weißes Dauerlicht bei 25 ° C.
2. Sterilisieren Sie die mikroapparat unter UV-Licht über Nacht in einer Laminar-Flow-Haube.
3. Legen Sie die mikroapparat in einer Vakuumkammer und für 20 min entgasen.
4. Der Brunnen mit einer Mikropipette stellen Sie das Wachstumsmedium vor. Warten Sie einige Minuten, bis das Vakuum die Mikrokanäle mit dem Medium füllt.
5. Fügen Sie autoklaviert Wasser in die Schüssel rund um die mikroapparat um die Feuchtigkeit in die Schüssel zu halten.
6. Ein kleines Stück Moos Protonemata Gewebe mit dem Einlass der mikroapparat übertragen und Kultur das Gewebe in einem Inkubator bei 25 ° C unter weißes Dauerlicht.
7. Überprüfen Sie das Moos Protonemata Wachstum nach 2-3 Wochen nach der Inkubation. Hellfeld-Bilder unter Verwendung eines Mikroskops zu erhalten.

9. Zeitraffer Bildgebung von T. Fournieri Pollen Rohr Wachstum

1. Legen Sie die mikroapparat auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit Bild Datenerfassungshardware ausgestattet (zB., einer CCD-Kamera) und Software. Finden Sie die Mikrospalt Positionen.
   Hinweis: Für die Bild-Datenerfassungs-Software verwendeten wir ein handelsübliches Produkt (Table of Materials). Open-Source-Mikroskopie-Software wie µManager ist auch online verfügbar (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Wir empfehlen die Installation eines Mikroskop-Kondensators am Mikroskop Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten.
2. Hellfeld-Aufnahmen alle 10 s mit Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software.
3. Um das eindringmittel beschrifteten Spermien und vegetativen Kern in der Pollen-Röhre der Linie RPS5Ap::H2B-TdTomato zu beobachten, die Probe mit 561 nm Laser zu bestrahlen und verwenden einen optischen Bandpassfilter (578/105 nm).
   Hinweis: Obwohl die Zeitraffer-Bilder der Pollen Rohr Wachstum häufig erfasst wurden, Bildgebung schien nicht zu Wachstum beeinflussen. Es wird jedoch immer empfohlen zur Minimierung der Laserintensität, Belichtungszeit und Zeitraffer-Intervall, Phototoxizität und Immunofluoreszenz der Fluorophor zu minimieren.
4. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der Bilder und bereiten Sie eine Videodatei mit ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/ij/).

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1dargestellt, stoßen Spitze wachsenden Pflanzenzellen eine Reihe von physischen Barrieren entlang deren Wachstum Pfade in Vivo. Mikrofluidische in-vitro- Zelle Kultur Plattformen präsentiert in dieser Studie ermöglicht die Prüfung der Tipp-wachsender Prozess in drei Arten von Pflanzenzellen (pollenschläuche Wurzelhaare und Moos Protonemata) durch künstliche Lücken 1 µm (Abbildung 3,

Diskussion

Mehrere wichtige Schritte im Protokoll müssen befolgt werden, um genau die oben dargestellten Ergebnisse zu erzielen. Erstens müssen die PDMS Schicht und Glas Schüssel Bodenflächen sowohl mit Plasma für eine ausreichende Menge an Zeit vor der Verklebung behandelt werden. Andernfalls kann die PDMS-Schicht lokal von der Glasoberfläche lösen, während Tipp erzeugenden Zellen die Mikropausen kreuzen. Ein weiterer entscheidender Schritt in der Wurzelhaare und Moos Protonemata-Protokoll ist die Sterilisation von der mik...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices