Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

Resumo

Nós descrevemos um método para investigar a capacidade de crescimento dica células de vegetais, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, para alongar através de aberturas muito estreitas (~ 1 µm) em um dispositivo microfluidic.

Resumo

In vivo, células de planta ponta-crescendo precisam superar uma série de barreiras físicas; no entanto, os pesquisadores faltam a metodologia para visualizar o comportamento celular em tais condições restritivas. Para resolver esse problema, nós desenvolvemos câmaras de crescimento para células vegetais crescimento dica que contêm uma série de aberturas estreitas, microfabricada (~ 1 µm) em um substrato de poli-dimetilssiloxano (PDMS). Este material transparente permite que o usuário monitorar processos de alongamento de ponta em células individuais durante a penetração de microgap pela imagem latente de lapso de tempo. Usando esta plataforma experimental, observamos mudanças morfológicas em tubos de pólen como penetraram o microgap. Nós capturamos as mudanças dinâmicas em forma de um núcleo vegetativo fluorescente etiquetada e espermatozoides em um tubo de pólen durante este processo. Além disso, temos demonstrado a capacidade dos cabelos de raiz e musgo protonemata para penetrar a 1 µm lacuna. Esta plataforma em vitro pode ser usada para estudar como individual células respondem aos espaços fisicamente restrito e pode fornecer insights sobre mecanismos de ponta-crescimento.

Introdução

Depois de grãos de pólen germinam em um estigma, cada grão produz um único tubo de pólen que transporta os espermatozoides para a célula-ovo e a célula central no óvulo para fertilização dupla. Tubos de pólen alongar através do estilo e eventualmente atingir o óvulo por sensoriamento várias pistas de orientação ao longo de seu caminho¹. Durante o alongamento, tubos de pólen encontram uma série de barreiras físicas; a faixa de transmissão está repleto de células, e tubos de pólen deve entrar a abertura micropylar minuto do óvulo para chegar a seu destino (figura 1A)². Portanto, tubos de pólen devem ter a capacidade de penetrar obstáculos físicos, enquanto tolerando o esforço compressivo de seus arredors. Pelos radiculares são outro tipo de célula de planta ponta-crescente que deve suportar os obstáculos físicos no ambiente, na forma de partículas de solo compactado (figura 1B).

Diversas propriedades mecânicas do tubo pólen têm sido estudadas, incluindo a pressão de turgor e rigidez da região apical da célula, que pode ser medido usando o método de Plasmólise incipiente^3,4 e microscopia de força celular (CFM) ^{5 , 6}, respectivamente. No entanto, estes métodos sozinhos não revelar se os tubos de pólen são capazes de prolongar-se por meio de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento. Uma técnica alternativa que permite o alongamento de pólen tubo ser monitorado na vivo é dois fótons microscopia⁷. No entanto, com este método, é difícil de observar as mudanças morfológicas em tubos de pólen individuais dentro do tecido do ovule. Além disso, crescimento de pelos radiculares no solo pode ser visualizado usando tomografia de radiografia computadorizada (CT) e ressonância magnética (MRI)⁸, embora com baixa resolução. Aqui, apresentamos um método que pode ser usado para adquirir imagens de alta resolução do processo de deformação da célula em um microscópio convencional.

O objectivo geral do método descrito aqui é para visualizar a capacidade de alongamento das células vegetais crescendo de ponta, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, em espaços extremamente pequenos. Como os poli-dimetilssiloxano (PDMS) microdevices apresentados neste manuscrito são opticamente transparentes e ar permeável, podemos cultura de células vivas no interior do aparelho e observar seus comportamentos de crescimento sob um microscópio. Também é possível criar micro ~ espaços de escala nanométrica pelo macio litografia técnica⁹ , com o uso de moldes. Esses recursos nos permitem estudar a capacidade de alongamento das células de planta ponta-crescendo em um ambiente fisicamente confinado.

Neste trabalho, nós construído 1 µm Largura lacunas (4 µm de altura) em dispositivos microfluídicos e examinada a capacidade dos tubos de pólen de penetrar esses obstáculos artificiais que são muito menores do que o diâmetro do tubo cilíndrico pólen (aproximadamente 8 µm). Esta plataforma experimental nos permite visualizar a resposta do tubo pólen para microgaps e capturar imagens lapso de tempo de resposta, que acompanhar o processo de deformação da célula. Também desenvolvemos o microdevices que pode ser usado para investigar a capacidade de penetração de pelos radiculares e musgo protonemata. Foram relatados vários microdevices para data que permitem a visualização da raiz^10,11,12,13 e musgo protonemata¹⁴ crescimento da planta em alta resolução. Em nosso dispositivo, uma série de canais de crescimento de pelos radiculares perpendicularmente estão ligados a uma câmara de crescimento de raiz, e cabelos de raiz individuais (aproximadamente 7 µm de diâmetro) são guiados para canais fluídico com 1 µm larga distância. Nós também cultivadas musgo protonemata (aproximadamente 20 µm de diâmetro) em um microdevice contendo microgaps para examinar suas respostas a estas barreiras físicas. A abordagem proposta microfluidic-baseado nos permite explorar a capacidade de várias células vegetais crescimento dica para alongar através de espaços extremamente pequenos, que não podem ser analisados por qualquer outro método atualmente disponível.

Protocolo

1. fabricação do Microdevice PDMS para examinar crescendo tubos de pólen e musgo Protonemata

Nota: Usamos um instrumento photolithography maskless preparar moldes PDMS em pastilhas de silício. Os detalhes sobre a operação do sistema são omitidos neste manuscrito. Uma técnica de fotolitografia padrão⁹ usando uma Fotomáscara também pode ser usado para criar os moldes PDMS descritos neste manuscrito.

1. Despeje a 11 g de mistura de pré-polímero PDMS (elastômero base: cura agente na proporção de 10:1) em cada molde de 4 polegadas.
2. Desgaseifica o molde preparado no passo 1.1 por 20 min em uma câmara de vácuo.
3. Após a cura a 65 ° C por 90 min em um forno de convecção não, descasque a camada PDMS fora do molde e fazem furos de acesso nos canais de fluídico usando socos de biópsia.
   Nota: Para o dispositivo de tubo de pólen, o tamanho do furo deve ser ajustado para refletir o diâmetro do pistilo. Este valor irá variar, portanto, por espécie. Neste experimento, nós socou um furo de 1 mm para as entradas de pistilo e furos de 1,5 mm para reservatórios de líquido médios. Para o dispositivo de protonemata de musgo, utilizou-se um buraco de 4mm para o reservatório de amostra.
4. Expor a camada PDMS e um prato fundo de vidro (3,5 a 5 cm de diâmetro) para ar de plasma de 50 s.
5. Pressione a camada PDMS em prato de vidro inferior e calor a 65 ° C por 30 min em um forno de convecção não para selar completamente fora da rede microfluidic.

2. fabricação do Microdevice PDMS para cabelos de raiz

1. Repita os passos usando os moldes para preparar duas camadas PDMS para a raiz e a raiz do cabelo microdevices 1.1-1.3.
   Nota: Utilizamos um buraco de 2 milímetros para os reservatórios médios líquidos em microdevice a raiz.
2. Expor as duas camadas PDMS para ar plasma para 50 s.
3. Monte as duas camadas PDMS sob um estereomicroscópio usando um alinhador de área de trabalho sob medida.
   Nota: Os microcanais sobre essas camadas PDMS devem enfrentar uns aos outros. Antes da montagem, certifique-se de que as marcas de alinhamento em ambas as camadas igualar-se.
4. Aqueça a 65 ° C por 30 min em um forno de convecção não para selar completamente fora da rede microfluidic.
5. Remova o microdevice construído o deslizamento da tampa e coloque o aparelho sobre um prato fundo de vidro que é de 5 cm de diâmetro.

3. preparação do meio de cultura In Vitro e celular para tubos de pólen (Torenia fournieri)

1. Prepare a meio do Nitsch modificados conforme descrito anteriormente,¹⁵ e autoclave o suporte a 121 ° C por 20 min.
   Nota: A composição do meio do Nitsch o modificado é NH₄não₃ (80 mg/L), KNO₃ (125 mg/L), Ca (NO₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂PO₄ (125 mg/L ), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), O (0,5 mg/L), ZnSO₄‧7H₂H₃BO₃ (10 mg/L), O (0,025 mg/L), at₂MoO₄‧2H₂O (0,025 mg/L), CuSO₄‧5H₂ sacarose (50.000 mg/L) e a caseína (500 mg/L). O médium preparado pode ser armazenado a 4 ° C por 4 meses pelo menos.
2. Preparar o glicol de polietileno 26% (p/v) usando água destilada esterilizada e filtrar a solução com um filtro de porosidade de 0,3 µm.
   Nota: O meio preparado pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês.
3. Misture os reagentes preparados na etapa 3.1 e 3.2 na proporção de 1:1 (v/v).
   Nota: Este meio deve ser preparado fresca para cada uso.

4. preparação de meio de cultura In Vitro celular para cabelos de raiz (Arabidopsis thaliana)

1. Prepare uma solução de sacarose a 1% (p/v) Murashige & Skoog médio, 0,05% (p/v) MES, 0.215% (p/v) e ágar de 1% (p/v) em água desionizada. Autoclave a solução a 121 ° C por 20 min.

5. preparação do meio de cultura In Vitro e celular para Protonemata Moss (Physcomitrella patens)

1. Pre-incube a protonemata de musgo no médio BCDAT¹⁶ em uma placa de Petri.
   Nota: A composição do meio BCDAT é 1 mM de MgSO₄, 10mm KNO₃, 45 µM Filipa₄, 1.8 mM KH₂PO₄ (pH ajustado para 6.5 com KOH), oligoelemento solução (0,22 µM CuSO₄, 0,19 µM ZnSO₄, 10 µM H₃BO ₃, 0.1 µM Na₂MoO₄, 2 µM MnCl₂, 0.23 µM CoCl₂e 0.17 µM KI), 1 mM CaCl₂e 5 mM diamónio (+)-tartarato.
2. O musgo no meio de BCDATG na microdevice de cultura.
   Nota: O meio BCDATG é médio BCDAT com glicose 0,5% (p/v). O médium preparado pode ser armazenado a 4 ° C para 1 mês.

6. Culturing in Vitro de T. fournieri tubos de pólen na Microdevice

1. Coloque o tubo do pólen microdevice em uma câmara de vácuo e desgaseificar por 20 min.
2. Remover o microdevice da câmara de vácuo e introduzir o meio de crescimento para a entrada de pistilo utilizando uma micropipeta com uma ponta muito fina. Encha os poços restantes para as blusas com o mesmo meio. Espere por alguns minutos até que todos os microcanais são preenchidos com o médio pelo vácuo criado dentro de microcanais.
3. Coloque uma toalha de papel molhada no prato fundo vidro para manter a umidade no prato.
4. Transferir os grãos de pólen de um selvagem-tipo T. fournieri 'azul e branco' flor seu estigma usando uma agulha de dissecação.
   Nota: Também realizamos esta experiência com um transgénico T. fournieri 'Coroa violet' flor (o RPS5Ap::H2B-tdTomato linha¹⁷), com tubos de pólen, contendo células de esperma fluorescente etiquetadas e núcleos vegetativos.
5. Corte o estilo polinizado (1 cm de comprimento) com uma lâmina.
6. Insira o corte estilo na entrada do dispositivo, como mostrado na Figura 2.
7. Colocar uma tampa sobre o prato e selá-lo com fita adesiva.
8. Coloque o dispositivo em uma incubadora a 28 ° C durante 5-6 h na escuridão.

7. Culturing in Vitro de cabelos de raiz da . thaliana na Microdevice

Nota: Os passos 7.1-7,9 (exceto 7.3 e 7.5) devem ser realizados numa vizinhança de fluxo laminar.

1. Esterilizar as sementes da . thaliana Columbia (Col-0) e os transgênicos linha UBQ10pro::H2B-do amor (que contém o marcador fluorescente nuclear), embebendo-os no líquido estéril (5% (v/v) de alvejante doméstico e 0,02% (v/v) Triton X-100) por 5 min.
2. Lave as sementes esterilizadas com água esterilizada.
3. Armazene as sementes enxaguadas em água por 2 dias a 4 ° C na escuridão.
4. Esterilize o microdevice sob luz UV durante a noite.
5. Coloque o microdevice em uma câmara de vácuo e desgaseificar por 20 min.
6. Introduza o meio de crescimento para os poços no dispositivo usando uma micropipeta. Aguarde alguns minutos até que o vácuo preenche todos os microcanais com o meio.
7. Toalha de papel molhada autoclavado de lugar no prato fundo vidro para manter a umidade no prato.
8. Transferi uma semente esterilizada na entrada do dispositivo.
9. Colocar uma tampa sobre o prato e selá-lo com fita adesiva.
10. Coloque o dispositivo na vertical em uma incubadora a 22 ° C, sob luz branca contínua.
11. Verifica o crescimento da raiz do cabelo depois de 4-10 dias de incubação. Obter campo brilhante e imagens fluorescentes, utilizando um microscópio invertido.

8. Culturing in Vitro de patenas p. (musgo) Protonemata no dispositivo Microfluidic

Nota: Passos 8,2-8,6 (exceto 8.3) devem ser realizados em uma capa de fluxo laminar.

1. Preculture p. patenas estirpe Gransden 2004¹⁸ na BCDAT médio coberto com papel celofane em uma placa de Petri para uma semana sob luz branca contínua a 25 ° C.
2. Esterilize o microdevice sob a luz UV durante a noite em uma capa de fluxo laminar.
3. Coloque o microdevice em uma câmara de vácuo e desgaseificar por 20 min.
4. Introduza o meio de crescimento para os poços utilizando uma micropipeta. Aguarde alguns minutos até que o vácuo preenche todos os microcanais com o meio.
5. Adicione água esterilizada para o prato em torno do microdevice para manter a umidade no prato.
6. Transferir uma pequena porção de musgo protonemata tecido para a entrada da microdevice e a cultura do tecido em uma incubadora a 25 ° C, sob luz branca contínua.
7. Verifica o crescimento de protonemata de musgo após 2-3 semanas de incubação. Obter imagens de campo claro, usando um microscópio.

9. Time-Lapse por imagens do crescimento de pólen tubo T. fournieri

1. Coloque o microdevice em um microscópio de fluorescência invertido equipado com hardware de aquisição de imagens (ex., uma câmera CCD) e software. Encontre os locais de microgap.
   Nota: Para o software de aquisição de imagem, foi utilizado um produto comercialmente disponível (Tabela de materiais). Software open source de microscopia como µManager também está disponível on-line (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Recomendamos a instalação de um condensador de microscópio no microscópio para obter imagens de alta resolução.
2. Capturar imagens de campo claro cada 10 s usando software de aquisição de imagem de microscópio.
3. Para observar as células de esperma fluorescente etiquetadas e núcleo vegetativo no tubo do pólen da linha RPS5Ap::H2B-tdTomato , a amostra a irradiação com laser de nm 561 e usar um filtro ótico de passa-banda (578/105 nm).
   Nota: Embora as lapso de tempo imagens de pólen tubo crescimento foram capturadas com frequência, imagem não pareceu afetar o crescimento. No entanto, é sempre recomendável para minimizar a intensidade do laser, tempo de exposição e intervalo de lapso de tempo, para minimizar a fototoxicidade e fotobranqueamento do fluoróforo.
4. Ajustar o brilho e o contraste das imagens e preparar um arquivo de vídeo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Resultados

Conforme ilustrado na Figura 1, células de planta ponta-crescendo encontram uma série de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento em vivo. As microfluidic em vitro celular cultura plataformas apresentadas neste estudo permitiu o exame a cultura dica do processo em três tipos de células vegetais (tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata) através de aberturas artificiais de 1 µm (Figu...

Discussão

Vários passos críticos no protocolo precisam ser seguido precisamente para obter os resultados apresentados acima. Em primeiro lugar, as superfícies PDMS camada e vidro fundo prato devem ambos ser tratadas com plasma para uma quantidade suficiente de tempo antes de ligação. Caso contrário, a camada PDMS localmente pode desanexar da superfície de vidro enquanto ponta crescimento células estão atravessando o microgaps. Mais um passo crucial no protocolo de protonemata de pelos radiculares e moss é a esterilizaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices