Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

Riepilogo

Descriviamo un metodo per indagare la capacità di crescita punta di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, allunga attraverso lacune estremamente strette (~ 1 µm) in un dispositivo microfluidico.

Abstract

In vivo, punta-coltivazione di cellule vegetali hanno bisogno di superare una serie di barriere fisiche; Tuttavia, i ricercatori mancano la metodologia per visualizzare il comportamento cellulare in tali condizioni restrittive. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato camere di crescita per punta-crescita cellule vegetali che contengono una serie di lacune strette, micro-fabbricato (~ 1 µm) in un substrato di poli-dimetilsiloxano (PDMS). Questo materiale trasparente consente all'utente di monitorare i processi di allungamento di punta in singole celle durante la penetrazione di microspazi da formazione immagine di time-lapse. Utilizzando questa piattaforma sperimentale, abbiamo osservato i cambiamenti morfologici in tubetti pollinici come hanno penetrato i microspazi. Abbiamo catturato i cambiamenti dinamici nella forma di un nucleo vegetativo fluorescente contrassegnato e cellule dello sperma in un tubo di polline durante questo processo. Inoltre, abbiamo dimostrato la capacità dei peli radicali e muschio protonemata di penetrare il 1 gap µm. Questa piattaforma in vitro può essere usata per studiare come singole cellule rispondono agli spazi fisicamente vincolati e può fornire le comprensioni nei meccanismi di crescita di punta.

Introduzione

Dopo i grani di polline germinano a uno stigma, ogni grano produce un singolo tubo di polline che trasporta spermatozoi verso la cellula uovo e la cella centrale nell'ovulo per doppia fertilizzazione. Tubetti pollinici allungare attraverso lo stile e alla fine raggiungere l'ovulo rilevando più segnali di guida lungo la loro strada¹. Durante l'allungamento, tubetti pollinici incontrano una serie di barriere fisiche; la pista trasmettente è pieno di cellule e tubetti pollinici deve immettere l'apertura micropylar minuto dell'ovulo per raggiungere il loro obiettivo (Figura 1A)². Di conseguenza, tubetti pollinici deve avere la capacità di penetrare ostacoli fisici, pur tollerando la sollecitazione di compressione dal loro ambiente. Capelli di radice sono un altro tipo di cellula vegetale punta crescente che dovrà resistere a ostacoli fisici nell'ambiente, sotto forma di particelle di suolo imballato (Figura 1B).

Sono state studiate varie proprietà meccaniche del tubo polline, tra cui turgore e rigidità della regione apicale della cellula, che può essere misurata utilizzando il metodo incipiente Plasmolisi^3,4 e microscopia a forza cellulare (CFM) ^{5 , 6}, rispettivamente. Tuttavia, questi metodi da solo non rivelano se tubetti pollinici sono in grado di allungamento attraverso gli ostacoli lungo i loro percorsi di crescita. Una tecnica alternativa che permette l'allungamento del tubetto pollinico di essere monitorati in vivo è due fotoni microscopia⁷. Tuttavia, con questo metodo, è difficile da osservare i cambiamenti morfologici nei singoli tubetti pollinici profondo all'interno del tessuto dell'ovulo. Inoltre, crescita dei capelli di radice nel suolo possa essere visualizzato usando la tomografia radiografia computata (CT) e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)⁸, seppur con bassa risoluzione. Qui, presentiamo un metodo che può essere utilizzato per acquisire immagini ad alta risoluzione del processo di deformazione di una cella su un microscopio convenzionale.

L'obiettivo generale del metodo descritto qui è di visualizzare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, in spazi estremamente ridotti. Come i microdispositivi poli-dimetilsiloxano (PDMS) presentati in questo manoscritto sono otticamente trasparente e aria permeabile, possiamo coltura di cellule viventi all'interno del dispositivo e osservare i loro comportamenti di crescita sotto un microscopio. È anche possibile creare micro ~ interamente scala nanometrica dalla litografia soft tecnica⁹ con l'uso di stampi. Queste caratteristiche ci permettono di studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in un ambiente fisicamente confinato.

In questo lavoro, abbiamo costruito 1 µm ampie lacune (4 µm in altezza) in dispositivi microfluidici ed abbiamo esaminato la capacità dei tubetti pollinici di penetrare questi ostacoli artificiali che sono molto più piccoli rispetto al diametro del tubo cilindrico di polline (circa 8 µm). Questa piattaforma sperimentale permette di visualizzare la risposta del tubetto pollinico a microgaps e catturare immagini time-lapse della risposta, che traccia il processo di deformazione della cella. Inoltre, abbiamo sviluppato il microdispositivi che possono essere utilizzato per indagare la capacità di penetrazione di peli radicali e muschio protonemata. Microdispositivi diversi sono stati segnalati fino ad oggi che permettono la visualizzazione radice^10,11,12,13 e muschio protonemata¹⁴ della crescita delle piante ad alta risoluzione. Nel nostro dispositivo, una serie di canali di crescita dei capelli di radice perpendicolarmente sono collegati ad una camera di crescita di radice e singoli peli radicali (circa 7 µm di diametro) sono guidati ai canali fluidici con un divario di 1 µm. Abbiamo coltivato anche muschio protonemata (circa 20 µm di diametro) in un microdevice contenente microgaps per esaminare le loro risposte a queste barriere fisiche. L'approccio basato su microfluidici proposto ci permette di esplorare la capacità di varie cellule vegetali crescita punta di allungare attraverso spazi estremamente ridotti, che non possono essere esaminati con qualsiasi altro metodo attualmente disponibile.

Protocollo

1. fabbricazione del PDMS Microdevice per esaminare tubetti pollinici in crescita e muschio Protonemata

Nota: Abbiamo usato uno strumento di quelle fotolitografia per preparare stampi PDMS su wafer di silicio. I dettagli riguardanti il funzionamento del sistema sono omessi in questo manoscritto. Una tecnica di fotolitografia standard⁹ utilizzando un photomask può anche essere utilizzato per creare gli stampi PDMS descritti in questo manoscritto.

1. Versare 11 g di miscela di pre-polimero PDMS (elastomero base: indurimento agente a un rapporto di 10:1) in ogni stampo di 4 pollici.
2. Degassare la muffa preparata al punto 1.1 per 20 min in una camera a vuoto.
3. Dopo l'indurimento a 65 ° C per 90 min in forno non ventilato, sbucciare lo strato PDMS rimossa la muffa e aprire varchi di accesso nei canali fluidici con punzoni di biopsia.
   Nota: Per il dispositivo del tubetto pollinico, la dimensione del foro deve essere adeguata per riflettere il diametro del pistillo. Questo valore varierà di conseguenza di specie. In questo esperimento, abbiamo perforare un foro di 1 mm per le insenature di pistillo e fori di 1.5 mm per i serbatoi liquidi medi. Per il dispositivo di protonemata di muschio, un foro di 4 mm è stato utilizzato per il serbatoio di campione.
4. Esporre lo strato PDMS e un piatto di fondo di vetro (3,5-5 cm di diametro) per aria al plasma per 50 s.
5. Premere lo strato PDMS nel piatto fondo di vetro e calore a 65 ° C per 30 min in forno non ventilato a sigillare completamente la rete di microfluidica.

2. fabbricazione del PDMS Microdevice per peli radicali

1. Ripetere i passaggi da 1.1-1.3 utilizzando gli stampi per preparare due strati PDMS per la radice e la radice dei capelli microdispositivi.
   Nota: Abbiamo usato un foro di 2 mm per i serbatoi liquidi medi in microdevice la radice.
2. Esporre entrambi gli strati PDMS per aria al plasma per 50 s.
3. Assemblare i due strati PDMS sotto un microscopio stereoscopico utilizzando un allineatore desktop su misura.
   Nota: I microcanali su questi strati PDMS devono affrontare l'altro. Prima del montaggio, assicurarsi che gli indicatori di allineamento su entrambi gli strati coincidano.
4. Scaldare a 65 ° C per 30 min in forno non ventilato a sigillare completamente la rete di microfluidica.
5. Rimuovere il vetrino coprioggetto dal microdevice costruito e collocare il dispositivo su un piatto fondo di vetro che è di 5 cm di diametro.

3. preparazione del terreno di coltura cellulare In Vitro per tubetti pollinici (Torenia fournieri)

1. Preparare mezzo di Nitsch modificate come descritto in precedenza¹⁵ ed autoclave il supporto a 121 ° C per 20 min.
   Nota: La composizione del mezzo di Nitsch modifed è NH₄NO₃ (80 mg/L), KNO₃ (125 mg/L), Ca (NO₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂PO₄ (125 mg/L ), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), ZnSO₄‧7H₂O (0,5 mg/L), H₃BO₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0,025 mg/L), Na₂MoO₄‧2H₂O (0,025 mg/L), saccarosio (50.000 mg/L) e la caseina (500 mg/L). Il mezzo preparato può essere memorizzato a 4 ° C per 4 mesi almeno.
2. Preparare il 26% (p/v) polietilene glicole utilizzando acqua deionizzata in autoclave e filtrare la soluzione con un filtro di poro di 0,3 µm.
   Nota: Il mezzo preparato possa essere memorizzato a 4 ° C per 1 mese.
3. Mescolare i reagenti preparati al punto 3.1 e 3.2 in un rapporto di 1:1 (v/v).
   Nota: Questo mezzo dovrebbe essere preparato fresco per ogni utilizzo.

4. preparazione del terreno di coltura cellulare In Vitro per peli radicali (Arabidopsis thaliana)

1. Preparare una soluzione di saccarosio di 1% (p/v) di Murashige e Skoog medio, 0,05% (p/v) MES, 0,215% (p/v) e 1% (p/v) agar in acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 20 min.

5. preparazione del terreno di coltura cellulare In Vitro per Moss Protonemata (Physcomitrella patens)

1. Pre-Incubare il protonemata di muschio in BCDAT medio¹⁶ in una capsula di Petri.
   Nota: La composizione del mezzo BCDAT è 1 mM MgSO₄, 10mm KNO₃, 45 µM FeSO₄, 1.8 mM KH₂PO₄ (pH regolato a 6.5 con KOH), soluzione di oligoelementi (0,22 µM CuSO₄, 0.19 µM ZnSO₄, 10 µM H₃BO ₃, 0.1 µM Na₂MoO₄, 2 µM MnCl₂, 0,23 µM CoCl₂e 0,17 µM KI), 1 mM CaCl₂e 5 mM diammonio (+)-tartrato.
2. Cultura il muschio nel medio BCDATG nel microdevice.
   Nota: Il mezzo BCDATG è BCDAT medio con 0,5% (p/v) di glucosio. Il mezzo preparato possa essere memorizzato a 4 ° C per 1 mese.

6. in Vitro Culturing dei tubetti pollinici T. fournieri nel Microdevice

1. Inserire il tubetto pollinico microdevice in una camera a vuoto e degassare per 20 min.
2. Rimuovere il microdevice dalla camera a vuoto e introdurre il mezzo di crescita verso l'ingresso di pistillo utilizzando una micropipetta con una punta molto fine. Riempire i pozzetti rimanenti al loro cime con lo stesso mezzo. Attendere alcuni minuti fino a quando tutti i microcanali sono riempiti con il mezzo di vuoto creato all'interno i microcanali.
3. Posto qualche tovagliolo di carta bagnato nel piatto di fondo di vetro per mantenere l'umidità nel piatto.
4. Trasferire i grani di polline da un selvaggio-tipo T. fournieri 'blu e bianco' fiore a suo stigma utilizzando un ago di dissezione.
   Nota: Inoltre abbiamo condotto questo esperimento con un transgenico T. fournieri 'Corona viola' fiore ( RPS5Ap::H2B-tdTomato linea¹⁷), con tubetti pollinici contenenti nuclei vegetativi e fluorescente identificati delle cellule dello sperma.
5. Taglio lo stile impollinato (1 cm di lunghezza) con una lama.
6. Inserire lo stile di taglio nell'ingresso del dispositivo, come mostrato nella Figura 2.
7. Mettere un coperchio sul piatto e sigillare con nastro adesivo.
8. Collocare il dispositivo in un incubatore a 28 ° C per 5-6 h nell'oscurità.

7. in Vitro Culturing di a. thaliana di peli radicali nel Microdevice

Nota: Procedura 7.1-7.9 (ad eccezione di 7,3 e 7,5) dovrebbe essere eseguita in una cappa a flusso laminare.

1. Sterilizzare i semi di a. thaliana Columbia (Col-0) e il transgenici linea UBQ10pro::H2B-mClover (contenente il marcatore fluorescente nucleare) da li ammollo in liquido sterile (5% (v/v) di candeggina e 0,02% (v/v) X-100 Triton) per 5 min.
2. Sciacquare i semi sterilizzati con acqua in autoclave.
3. Conservare i semi sciacquati in acqua per 2 giorni a 4 ° C al buio.
4. Sterilizzare il microdevice sotto luce UV durante la notte.
5. Posizionare il microdevice in una camera a vuoto e degassare per 20 min.
6. Introdurre il mezzo di crescita per i pozzi nel dispositivo utilizzando una micropipetta. Attendere alcuni minuti fino a quando il vuoto si riempie tutti i microcanali con il mezzo.
7. Asciugamano di carta bagnata in autoclave posto nel piatto fondo di vetro per mantenere l'umidità nel piatto.
8. Trasferire un seme sterilizzato nell'ingresso del dispositivo.
9. Mettere un coperchio sul piatto e sigillare con nastro adesivo.
10. Posizionare l'apparecchio verticalmente in un incubatore a 22 ° C in continuo luce bianca.
11. Controllare la crescita dei capelli di radice dopo 4-10 giorni di incubazione. Ottenere sia campo luminoso e immagini fluorescenti utilizzando un microscopio invertito.

8. in Vitro Culturing di p. Patene (muschio) Protonemata nel dispositivo microfluidico

Nota: Procedura 8.2-8.6 (ad eccezione di 8,3) dovrebbe essere eseguita in una cappa a flusso laminare.

1. Preculture p. Patene ceppo Gransden 2004¹⁸ su supporto BCDAT coperto con cellophane in una capsula Petri per una settimana sotto luce bianca continua a 25 ° C.
2. Sterilizzare il microdevice sotto luce UV durante la notte in una cappa a flusso laminare.
3. Posizionare il microdevice in una camera a vuoto e degassare per 20 min.
4. Introdurre il mezzo di crescita per i pozzetti con una micropipetta. Attendere alcuni minuti fino a quando il vuoto si riempie tutti i microcanali con il mezzo.
5. Aggiungere acqua in autoclave nel piatto che circonda la microdevice per mantenere l'umidità nel piatto.
6. Trasferire un piccolo pezzo di tessuto protonemata moss e la presa della microdevice e cultura del tessuto in un incubatore a 25 ° C in continuo luce bianca.
7. Controllare la crescita di protonemata moss dopo 2-3 settimane di incubazione. Ottenere immagini luminose del campo usando un microscopio.

9. Time-lapse Imaging di crescita del tubetto pollinico di T. fournieri

1. Posizionare il microdevice su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di hardware di acquisizione immagini (ad es., una telecamera CCD) e software. Trova la località di microspazi.
   Nota: Per il software di acquisizione immagine, abbiamo usato un prodotto disponibile in commercio (Tabella materiali). Software di microscopia di open source come µManager è anche disponibile online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Si consiglia di installare un condensatore del microscopio il microscopio per ottenere immagini ad alta risoluzione.
2. Catturare immagini luminose del campo ogni 10 s utilizzando software di acquisizione immagine microscopio.
3. Per osservare le cellule spermatiche fluorescente contrassegnate e nucleo vegetativo nel tubo di polline della linea RPS5Ap::H2B-tdTomato , irradiare il campione con 561 nm del laser e utilizzare un filtro ottico passa-banda (578/105 nm).
   Nota: Anche se le immagini time-lapse di crescita del tubetto pollinico furono catturate frequentemente, la formazione immagine non sembra influenzare la crescita. Tuttavia, si consiglia sempre di ridurre al minimo l'intensità del laser, tempo di esposizione e intervallo di time-lapse, per ridurre al minimo la fototossicità e photobleaching del fluoroforo.
4. Regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e preparare un file video utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Risultati

Come illustrato nella Figura 1, punta-coltivazione di cellule vegetali incontrano una serie di barriere fisiche lungo i loro percorsi di crescita in vivo. Microfluidica in vitro delle cellule cultura piattaforme presentate in questo studio abilitato l'esame la punta crescente processo in tre tipi di cellule vegetali (tubetti pollinici, peli radicali e muschio protonemata) attraverso le lacune artificiale di 1 µm (Figura...

Discussione

Diversi passaggi critici nel protocollo devono essere seguite con precisione per ottenere i risultati presentati qui sopra. In primo luogo, le superfici PDMS piatto fondo di vetro e strato devono entrambi essere trattate con il plasma per un sufficiente lasso di tempo prima dell'incollaggio. In caso contrario, lo strato PDMS localmente può staccare dalla superficie del vetro mentre punta crescita cellule sono attraversando il microgaps. Un altro passo cruciale nel protocollo di protonemata dei capelli di radice e muschi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices