Protocolo de aguda y crónica pruebas de ecotoxicidad de los killis turquesa Nothobranchius furzeri

Resumen

En este trabajo describimos un bioensayo agudo, crónico y multigeneracional para estudiar los efectos de los estresores individuales y combinados en los killis turquesa Nothobranchius furzeri. Este protocolo está diseñado para estudiar características de historia de vida (mortalidad, crecimiento, fecundidad, peso) y máximo térmico crítico.

Resumen

Los killis Nothobranchius furzeri es un organismo modelo emergente en el campo de la ecotoxicología y ha demostrado su aplicabilidad en las pruebas de ecotoxicidad aguda y crónica. En general, la sensibilidad de las especies a los compuestos tóxicos es en la gama, o más, que otras especies modelo.

Este trabajo describe los protocolos de bioensayos agudos, crónicos y multigeneracionales de efectos individuales y combinados estresor en N. furzeri. Debido a su tiempo de maduración corta y ciclo de vida, este modelo vertebrado permite el estudio de como tiempo de maduración y fecundidad dentro de cuatro meses. Ensayos de exposición de todo el ciclo de vida transgeneracional se pueden realizar en tan poco como 8 meses. Puesto que esta especie produce huevos que son resistentes a la sequía y permanecer viable durante años, el cultivo in situ de las especies no es necesario pero los individuos pueden ser reclutados cuando sea necesario. Los protocolos están diseñados para medir rasgos de historia de vida (mortalidad, crecimiento, fecundidad, peso) y máximo térmico crítico.

Introducción

Perfiles de sensibilidad de una gran variedad de especies a sustancias tóxicas estratégicamente seleccionados han sido descritos¹ para la legislación de alcance europeo (registro, evaluación, autorización y restricción de productos químicos). Pruebas de toxicidad aguda o a corto plazo se utilizan principalmente para este propósito ya que dan una indicación rápida de la sensibilidad de una especie. Sin embargo, en su ambiente natural, los organismos están expuestos durante períodos mucho más prolongados y ciclo de vida completo o incluso varias generaciones podrían ser afectado². Además, organismos en ambientes contaminados por lo general están expuestos a más de un factor estresante a la vez, que puede interactuar con los demás, posiblemente dando por resultado efectos sinérgicos³. Por lo tanto, concentraciones seguro calculado estresor agudo, solo en base a las pruebas de toxicidad pueden subestimar los riesgos reales impuestos por sustancias tóxicas en ambientes naturales. Por lo tanto, es conveniente también estudiar los efectos crónicos y multigeneracionales de concentraciones subletales de sustancias tóxicas en un contexto ambientalmente relevante como defendido por la Comisión Europea^4,5 y la USEPA (United Agencia de protección ambiental de los Estados)^6,7. Especialmente en la investigación vertebrada, los costes en términos de mano de obra, tiempo y dinero son altos cuando se realizan estudios de exposición crónica y múltiples generaciones debido a la vida útil relativamente larga de los vertebrados frente a los organismos modelo de invertebrado. Por lo tanto, es aconsejable elegir el organismo de modelo más apropiado de pescado, dependiendo de la pregunta de investigación. Además, una amplia gama de especies de vertebrados debe estar disponible para poner a prueba la generalidad de las respuestas a través de especies para poder adaptar reglamentos basados en las especies más sensibles. Por ahora, hay una necesidad de desarrollar nuevos protocolos eficientes con especies de vertebrados modelo caracterizados por ciclos de vida cortos para bajar los costos de realizar exposiciones crónicas y multigeneracionales en vertebrados^7,8.

Los killis turquesa Nothobranchius furzeri es un interesante modelo de pescado para utilizar en tales experimentos de exposición a largo plazo debido a su tiempo de maduración corta y ciclo de vida (tiempo de generación menor de 4 semanas⁹). Esto significa que se pueden estudiar dentro de un marco de tiempo corto comparado con otros modelos de pescado⁷extremos ecológicamente relevantes como tiempo de maduración y fecundidad. Además, estos peces producen huevos resistentes a la sequía, latentes que permanecen viables durante varios años cuando se almacena bajo condiciones estándar, eliminando así la necesidad de una cultura continua⁹. En estudios ecotoxicológicos, esto también implica replicar peces pueden todos ser tramados en el momento exacto de la misma, resultando en sincronía de tiempo para todos los animales, incluso entre lotes de huevos producidos en diferentes épocas. Aconsejamos utilizar el laboratorio cepa GRZ para realizar experimentos de exposición. Esta variedad funciona bien bajo condiciones de laboratorio, es homocigótica (excepto los cromosomas sexuales) y el genoma es bien caracterizado^10,11.

En estudios ecotoxicológicos, es importante seleccionar el rango de concentraciones de ensayo apropiado. Varios métodos complementarios pueden utilizarse para este fin. La gama de concentración nominal puede basarse en la sensibilidad de una especie relacionada, como Nothobranchius guentheri¹². Por otra parte, la gama puede basarse en la sensibilidad de los modelos estándar de peces, como el pez cebra (Danio rerio)² que tiene una sensibilidad comparable a la mayoría de sustancias tóxicas (Philippe et al. (en revisión)). En combinación, con dos de estas opciones, deberá realizarse un experimento Rangefinding para seleccionar el rango de la concentración nominal. Para el análisis agudo, investigadores deberían apuntar para los tratamientos de concentración con 100% de mortalidad, mortalidad intermedia y 0% de mortalidad después de 24 h de exposición a la sustancia tóxica. Para pruebas crónicas, es recomendable ejecutar el Rangefinding experimento durante dos semanas verificar si mortalidad larvaria en la condición con las concentraciones más altas de la prueba no exceda del 10% durante este período de referencia.

El protocolo puede servir como base para realizar la exposición aguda y crónica a contaminantes transmitidas por el agua en N. furzeri, examinar los posibles efectos de los estresores a nivel individual y celular. También puede ser utilizado para realizar investigaciones multi-estresor para dar cabida a una mayor relevancia ecológica, mezcla de diferentes compuestos tóxicos o estudiar los efectos interactivos entre la contaminación y otros factores de estrés naturales (p. ej. depredación) o antropogénico factores de estrés (p. ej. calentamiento debido al cambio climático).

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de ética de KULeuven.

1. eclosión y mantenimiento General de furzeri N.

1. Preparar pescado mediano (pH 7) a una temperatura de 14 ° C y añadir agua purificada del tipo II, con añadido sales estandarizados, a una conductividad de 600 μS/cm (24 ° C).
2. Seleccione los huevos de la línea de laboratorio GRZ (Gona-Rhe-Zhou) que han sido almacenadas bajo condiciones estandarizadas¹³. Seleccione los huevos en la etapa DIII (es decir, listo para eclosionar), reconocible por la presencia de ojos dorados⁹ y suavemente transferirlos con un suave pinzas a un tanque plástico de 2 L (a no más de unos 30 huevos por tanque).
   Nota: Para tener un número suficiente de organismos de prueba sana, incuban huevos dos veces tantas como el número de larvas de peces requiere.
3. Añadir 1 cm del medio pescado a 12 ° C y deje que la temperatura del agua gradualmente convergen a temperatura ambiente (24 ° C)⁹. Peces eclosionan dentro de las primeras 12 h.
4. Después de 24 h, alimentación de las crías una dosis concentrada de recién nacidos Artemianauplii (para más detalles sobre la frecuencia y cantidad de alimentos, consulte el protocolo de cría de Polačik et al. 2016⁹) y aumentar la profundidad del agua a 5 cm de Añadir el medio pescado.
5. Después de 36 h, alimentar a las crías otra dosis concentrada de recién nacidos nauplios de Artemia y añadir medio de peces para aumentar la profundidad del agua a 10 cm.
6. Incubar los envases de pescado bajo condiciones de temperatura constante (por ejemplo, en una incubadora, sala de clima o baño de agua caliente) bajo un 14 h:10 h régimen de luz: oscuridad.
7. Antes del inicio del experimento, contenedores de pescado complejo (sin peces) con la exposición compuesta por relleno con la más alta concentración del medio de exposición y dejarla toda la noche para limitar a la transferencia de sustancias tóxicas en el contenedor en el real experimento.
8. 48 h después de la eclosión, seleccione sanas larvas flotantes para comenzar el experimento de exposición. Descartar llamados deslizadores de vientre que no pudieron llenar su vejiga natatoria y por lo tanto tener una flotabilidad deteriorada (continuamente se hunda hasta el fondo).

2. corta duración exposición protocolo

Nota: Los investigadores deberían orientarse para por lo menos 20 repeticiones (20 peces en recipientes separados) por tratamiento. Además de un tratamiento de control total, un control de solvente debe incluirse si la solución del compuesto es preparada usando un solvente. El control solvente debe contener la cantidad de disolvente la concentración de solvente en la mayor concentración de la exposición del mismo.

1. Preparar los envases experimentales (tarros de cristal de 0,5 L) por los de etiquetado y llenado con el medio de exposición adecuado (diferentes concentraciones de sustancias tóxicas). Añadir el compuesto para obtener la concentración correcta.
2. Transferencia de larvas (48 h después de la trama) individualmente a los contenedores (1 pez por el envase para el seguimiento individual).
   Nota: Los peces exponen individualmente para minimizar los posibles efectos de confusión de la interacción social como la competencia por alimento y agresión. Sin embargo, peces pueden interactuar visualmente de acuerdo a normas éticas para el uso de animales de laboratorio.
3. Seguimiento de la exposición aguda de hasta 2 semanas de duración. Durante ese tiempo, alimentar a los peces ad libitum con nauplios de Artemia dos veces al día, 7 días a la semana.
4. Actualizar el medio día para mantener la calidad del agua y para minimizar los efectos potenciales de la degradación de compuestos. Monitorear variables de agua (niveles de oxígeno disuelto deben superar el 80%, conductividad debe estar comprendida entre 600 y 700 μS/cm, pH entre 7.8 y 8.2 y dureza (como CaCO₃) entre 350 y 450 mg/L, que se encuentra dentro del rango de condiciones óptimas de crianza para furzeri N. ⁹). Tomar muestras de agua antes y después de refrescar el medio para determinar las concentraciones reales de compuesto.
5. Criterios de valoración
   1. Ver peces para mortalidad, estrés (e.g. comportamiento aberrante: natación boca abajo) o enfermedad diariamente (mañana, tarde). Consulte la publicación de Shedd et al. (1999) ¹² para más detalles sobre la observación de la mortalidad, el estrés o la enfermedad.
   2. Calcular LC₅₀ valores basados en la mortalidad usando curvas de dosis-respuesta (Ritz y Streibig, 2005) en diferentes puntos temporales. Utilice la función de drm en el paquete de República Democrática del Congo en R v3.2.3 (equipo de núcleo de desarrollo R, 2016) o métodos estadísticos similares.

3. crónica de la exposición protocolo

Nota: Apuntar a un mínimo de 25 peces o condición en el inicio del experimento, para reducir al mínimo las posibilidades de una proporción de sexos sesgada y para acomodar la mortalidad potencial de fondo debido a causas naturales (es decir. mortalidad relacionada con la edad).

1. Eclosión (ver sección 1)
2. Fase I (2 días post eclosión-16 días post eclosión)
   1. Seguir el protocolo como se describe en 2.1-2.4
   2. Como durante la segunda fase del experimento, el medio se degrada a lo largo de la semana (no refresco, ver más abajo). Almacenar la cantidad necesaria del medio durante una semana en grandes contenedores inertes para permitir similar degradación del compuesto.
3. Fase II (16 días post eclosión-final)
   1. Preparar L 2 les frascos de vidrio experimental por formación de complejos con el compuesto. Llene los frascos con el medio de la exposición correcta y agregar un tubo de aire para airear la jarra. Pescado de casa individual en estos frascos para el resto del experimento. Permiten la interacción visual dar cabida a normas éticas.
   2. Actualizar el medio una vez por semana. Transferencia de los peces con una red a un nuevo frasco conteniendo el mismo medio de exposición. Tomar muestras de agua cada día durante una semana para controlar la degradación del compuesto en cada tratamiento de concentración. Calcular una curva de degradación para cada tratamiento si son estresores múltiples pruebas (por ejemplo, la toxicidad de un compuesto en diferentes temperaturas). Medir parámetros abióticos (pH, temperatura, oxígeno % disuelto, conductividad) tres veces por semana.
   3. De 2 días post eclosión (dph) hasta 23 dph, alimentar a los peces dos veces al día, 7 días a nauplios de Artemia ad libitum de la semana. Del dph 24 - 37 dph, complementar la dieta ad libitumArtemia con larvas de Chironomus picaditas. De 38 dph en, alimentar a los peces dos veces al día, 7 días por semana ad libitum congelado larvas de Chironomus .
4. Criterios de valoración
   1. Compruebe diariamente pescado de mortalidad, el estrés o la enfermedad¹².
   2. Para determinar el crecimiento, medir el tamaño del cuerpo sobre una base semanal (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) mediante la transferencia de peces a una placa Petri con medio de su depósito. Tomar 4-5 fotos de tamaño calibrado de los peces desde arriba (a una altura fija) y analizar digitalmente utilizando un programa de medición espacial (e.g. ImageJ).
      Nota: Para peces adultos, utilice una placa de Petri superior para minimizar el estrés de manejo manteniendo todos los peces sumergidos durante todo el proceso de medición.
   3. Para la maduración hombre, visualmente peces diariamente para la coloración de dph 15 adelante. Compruebe las aletas para primeros signos de coloración nupcial (característica sexual secundaria). Uso el primer día en que esto es visible como un proxy para el tiempo de maduración hombre.
   4. Pareja peces no sexadas con machos del mismo grupo de tratamiento o no experimental varones tres veces por semana de 30 dph a partir para determinar el tiempo de maduración femenina (el día que se deposita el primer huevo). Para ello, utilizar el protocolo de desove en 3.4.5.
   5. De fecundidad, pareja madura las hembras con los machos maduros 3 veces / semana desde 30 dph, dentro de sus tratamientos mediante un esquema de cruce.
      1. Preparar un tanque de desove (1 L) para cada pareja, por medio de la exposición del hombre acuario con sustrato de desove (arena fina < 500 μm).
      2. Transferir el macho y la hembra en el tanque de desove y que puedan desovar durante dos horas. Minimizar la actividad humana o perturbación alrededor de los recipientes de desove durante este proceso.
      3. Luego, suavemente transferencia de peces hacia sus envases originales de la vivienda, sin mezcla innecesaria del agua, que se giran los huevos en el sustrato de desove.
      4. Filtrar los huevos por el sustrato de desove que vierte sobre una malla de 500 μm. Contar los huevos y transferirlas (usando pinzas suaves) a húmedo musgo de turba en platos de Petri^9,14.
      5. Retirar los huevos muertos diariamente. Después de una semana, seal el Petri dish con película y almacenar en una temperatura controlada incubadora a 28 ° C y una 14:10 h luz: oscuridad del ciclo de desarrollo inmediato a la fase DIII (es decir, listo para eclosionan después de aproximadamente tres semanas). Para el almacenamiento a largo plazo, almacenar los huevos a 17 ° C en oscuridad constante que huevos de entran en la fase latente y permanecerán viables durante varios años. Cuando reclutamiento de peces de estos huevos latentes para experimentos, transferir los huevos latentes a 28 ° C condiciones con 14:10 h luz: oscuridad del ciclo durante aproximadamente tres semanas permitir el desarrollo a la fase DIII.
   6. Medir el máximo térmico crítico (CTmax) (una medida de rendimiento¹⁵) de peces adultos.
      1. Utilizar un baño de agua que se calienta a un ritmo constante de 0,33 ° C/min y en la que se circula continuamente el agua. Añadir varios acuarios de 1 litro para cada pez individual.
         Nota: Dadas las limitaciones de espacio en el baño de agua, es necesario trabajar en varias series. Diferencias de potencial en condiciones entre series deben tenerse en cuenta al realizar el análisis estadístico mediante la inclusión de 'series' como un factor aleatorio.
      2. Iniciar el juicio mediante la adición de los peces del acuario cuando el agua en el acuario haya alcanzado la temperatura experimental de cría de los pescados (generalmente 28 ° C). Controlar la temperatura en los acuarios de 1 L de la bañera CTmax cada 5 minutos usando un termómetro digital (escala de 0.1 ° C).
      3. Termina el juicio cuando el pez es incapaz de mantener una posición dorso-ventral o comienza crispando mucho^16,17. Medir la temperatura en el acuario de 1 L, que es la temperatura máxima crítica. Transferir el pescado a su vivienda experimental para la recuperación.
   7. Medir el peso (precisión de 0,1 mg) de los peces en el último día del experimento acariciando seca y transfiriendo en un barco de pesaje. Nota: Todos los peces deben medirse cuatro horas después de la última alimentación para normalizar el peso del alimento en el tracto intestinal.
   8. Eutanasia el pescado utilizando 0.1% Tricaine.

4. Protocolo de exposición transgeneracional

Nota: Para medir los efectos transgeneracionales de contaminantes en N. furzeri, siga el protocolo de la exposición crónica se ha señalado anteriormente para la primera generación.

1. Dos veces por semana, comprobar el desarrollo de los huevos producidos (es decir, la segunda generación) a 28 ° C 14:10 condiciones de ciclo de h luz: oscuridad mediante la inspección de las cajas Petri para los embriones en la fase DIII (ver Polačik et al. 2016⁹). Cuando más de 50 repeticiones de cada tratamiento los padres están completamente desarrolladas, portilla les siguiendo el protocolo en 1.1.
2. Exponer el pescado sano, boyante a exactamente la misma configuración y tratamiento como el pez de paterno.

Resultados

Los resultados de la exposición aguda de N. furzeri a diferentes concentraciones de cobre, calcula como 2.5.2, mostrar las relaciones cleardose-respuesta (figura 1). Hay un aumento en la mortalidad con el aumento de concentración de sustancias tóxicas. Valores de LC₅₀ disminuyen con el tiempo, lo que significa que con la disminución de las concentraciones, más tiempo pasa antes de 50% de la matriz de repeticiones. Para los resultados ...

Discusión

Este trabajo describe un nuevo bioensayo usando Nothobranchius furzeri, un organismo modelo emergente, para estudiar al individuo y combina efectos a largo plazo de sustancias tóxicas y otros estresores. Los protocolos presentados fueron aplicados con éxito para medir la sensibilidad de las especies a una gran variedad de sustancias tóxicas (cobre, cadmio, 3, 4-dicloroanilina y clorpirifos). Debido a su rápido ciclo de vida, este modelo vertebrado permite evaluación de subletales y efectos transgeneracional...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
purified water Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastic tank	SAVIC		Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning)	Avamoplast		Always separate material for control and toxicity treatments
nets	Aqua bilzen		Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		frozen
tricaine	Sigma aldrich
petri dishes	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
tweezers	FST
500 µm mesh sieve	/		self-made
microcentrifuge tube (2ml)	BRAND		To store fish in freezer
glass vials	Sigma aldrich		For water analysis
weighing boat	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
water bath	Gilac		for Ctmax
liquid nitrogen	Air liquide
digital thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
calibrated balance	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform for camera	/		self-made
Multiparameter kit	HACH
Freezer (-80°C)	Panasonic Ultra low temperature freezer
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fysio
homogenisation buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagent	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein dye	VWR
96-well microtiter plate	Greiner Bio-one
384 microtiter plates	Greiner Bio-one
2 ml glass tubes	Fiers		For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes	VWR
homogeniser	Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer	Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako