Протокол для острой и хронической экотоксичности тестирования бирюза Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri

Резюме

В этой работе мы описываем острых, хронических и поколениями биопроб для изучения воздействия одного и комбинированной стресс на бирюзовый Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri. Этот протокол предназначен для изучения истории жизни черты (смертности, рост, плодовитость, вес) и критических тепловой максимальный.

Аннотация

Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri является формирующейся модели организма в области экотоксикологии и продемонстрировал его применимость в острых и хронических экотоксичности тестирования. В целом чувствительность видов токсичных соединений находится в диапазоне с, или выше, чем у других видов модели.

Эта работа описывает протоколы для острых, хронических и поколениями bioassays стрессор одного и комбинированных эффектов на N. furzeri. Благодаря своей короткой созревания время и жизненный цикл эта позвоночных модель позволяет исследования конечных точек, таких как время созревания и плодовитость в течение четырех месяцев. Следующих полного жизненного цикла испытания воздействия могут быть выполнены в качестве лишь 8 месяцев. Поскольку этот вид производит яйца, которые засухоустойчивых и остаются жизнеспособными в течение лет, на месте культуры видов не нужна, но люди могут быть набраны при необходимости. Протоколы предназначены для измерения жизни история черты (смертности, рост, плодовитость, вес) и критических тепловой максимальный.

Введение

Чувствительность профили массива видов в стратегически выбранных токсикантов были описаны¹ для европейских достичь законодательства (регистрации, оценки, авторизации и ограничении химических веществ). Острый или краткосрочной токсичности тесты главным образом использовались для этой цели, как они дают краткое указание видов чувствительности. Однако в их естественной среде, организмы подвергаются более длительных периодов и полного жизненного цикла или даже несколько поколений может быть пострадавших². Кроме того в загрязненной среде организмов обычно подвергаются более чем одного стрессор в то время, которые могут взаимодействовать друг с другом, может привести к синергических эффектов³. Следовательно тесты на токсичность вычисляемые на основе острой, единый стрессор безопасной концентрации могут недооценивать фактические риски, введенных токсикантов в естественных условиях. Это, таким образом, целесообразно также изучить хронических и застроек эффекты сублетальные концентрации токсикантов в контексте экологически значимых как пропагандируемые Европейской Комиссии^4,5 и АООС США (Соединенные Агентство по охране окружающей среды государств)^6,7. Особенно в позвоночных исследований затрат труда, деньги и время являются высокими, при выполнении исследований хронической и застроек воздействия из-за относительно продолжительный позвоночных, по сравнению с моделью беспозвоночных организмов. Таким образом желательно выбрать наиболее подходящие модельный организм рыбы, в зависимости от исследования вопрос. Кроме того широкий спектр видов позвоночных должны быть доступны для того чтобы испытать общность ответов различных видов, чтобы иметь возможность адаптировать правила, основанные на наиболее чувствительных видов. В настоящее время существует необходимость разработки новых, эффективных протоколов с видов позвоночных модель характеризуется короткого жизненного цикла, снизить затраты на выполнение хронических и застроек воздействия на позвоночных^7,8.

Бирюзовый Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri представляет собой интересную модель рыб для использования в таких долгосрочных экспериментов воздействия из-за своей короткой созревания время и жизненного цикла (поколение время меньше, чем 4 недели⁹). Это означает, что экологически соответствующие конечные точки как время созревания и плодовитости могут быть изучены в короткие сроки по сравнению с другими рыбы модели⁷. Кроме того эти рыбы производят засухе, спящие яйца, которые остаются жизнеспособными в течение нескольких лет при хранении в стандартных условиях, тем самым устраняя необходимость непрерывной культуры⁹. В экотоксикологических исследований это также подразумевает что повторяют, что рыбы могут все быть вылупившихся в тот же момент, результате время одновременности для всех животных, даже среди партий яиц производится в разное время. Мы советуем использовать лаборатории штамм ГРЗ для выполнения экспериментов экспозиции. Этот штамм выполняет также в лабораторных условиях, гомозиготных (за исключением половых хромосом) и геном является хорошо характеризуется^10,11.

В экотоксикологических исследований важно выбрать соответствующий диапазон концентраций теста. Несколько дополнительных методов может использоваться для этой цели. Диапазон номинальной концентрации могут быть основаны на чувствительность смежных видов, таких как Nothobranchius guentheri¹². Кроме того диапазон может быть основан на чувствительности моделей стандартных рыб, таких как данио рерио (Danio рерио)² , которые имеют сопоставимые чувствительность для большинства ядовитых веществ (Филипп et al. (в обзоре)). В сочетании с обоими из этих вариантов диапазон поиска эксперимента должны проводиться для выбора диапазона Номинальная концентрация. Для острого тестирования, исследователи должны быть направлены для лечения концентрация с 100% смертности, промежуточные и 0% смертности после 24 часов воздействия токсикант. Для хронической тестирования, желательно для запуска диапазон поиска эксперимент на две недели, чтобы проверить, если личинок смертности в состоянии с самых высоких концентраций теста не превышает 10% за этот отчетный период.

Протокол может служить в качестве основы для выполнения острого и хронического воздействия загрязнителей, переносимых водой на N. furzeri, изучения потенциальных последствий стресса на индивидуальных и клеточном уровне. Он также может использоваться для выполнения исследований многолетних стрессор для размещения выше экологической значимости, смешивания различных токсичных соединений или изучая интерактивные эффекты между загрязнением и другие природные раздражители (например хищничества) или антропогенных стресс (например потепление вследствие изменения климата).

протокол

Все методы, описанные здесь были утверждены Комитетом по этическим KULeuven.

1. штриховки и общего обслуживания N. furzeri

1. Подготовить рыбу средних (рН 7) при температуре 14 ° C и добавить очищенной воды типа II, добавлены стандартизированные солями, проводимость 600 мкСм/см (24 ° C).
2. Выберите яйца от линии Лаборатория ГРЗ (гона-летящего-Чжоу), которые были сохранены при стандартных условиях¹³. Выберите яйца в DIII стадии (т.е. готовы люк), узнаваемые наличием Золотой глаз⁹ и аккуратно их передачи с мягкой парой пинцетов пластичный бак 2 Л (не более чем приблизительно 30 яиц в бак).
   Примечание: Для того чтобы иметь достаточное количество здоровых тест организмов, Люк дважды как много яиц, как количество требуемых мальков.
3. Добавить 1 см рыба средних 12 ° c и пусть температуру воды постепенно сходятся к комнатной температуре (24 ° C)⁹. Рыбы будут люк в течение первых 12 ч.
4. После 24 часов, кормить молодь концентрированной дозы недавно вылупившиеся Artemianauplii (для более подробно на частоту и количество пищи, обратитесь к протоколу размножения Polačik et al. 2016⁹) и увеличить глубину воды до 5 см, Добавление средних рыб.
5. После 36 h кормить молодь другой концентрированной дозы недавно вылупившиеся науплий артемии и добавить рыб среднего увеличить глубину до 10 см.
6. Инкубировать рыбы контейнерами (например в инкубатор, климат номер или ванна с подогревом воды) в условиях постоянной температуры под h 14 h:10 свет: Темный режим.
7. Перед началом эксперимента сложные рыбы контейнеров (без рыбы) с воздействием комплекса, заполнения их с самой высокой концентрацией воздействия среды и оставить его на ночь для того, чтобы ограничить передачу токсикантов в контейнер в фактическом эксперимент.
8. 48 ч после вылупления, выбрать Здоровое оживление личинки начать эксперимент экспозиции. Отказаться от так называемого живот ползунки, которые не смогли заполнить их пузырь и следовательно имеют нарушение плавучести (непрерывно опускаться на дно).

2. краткосрочные экспозиции протокол

Примечание: Исследователи должны стремиться по меньшей мере 20 реплицирует (20 рыб в отдельных банках) за лечение. В дополнение к полный контроль лечения растворителя управления должны быть включены, если раствор смеси подготовлен с помощью растворителя. Растворителя управления должен содержать количество растворителя, равная растворителя концентрация в самую высокую концентрацию воздействия.

1. Подготовьте экспериментальный контейнеры (0,5 Л стеклянных банок), снабдив их и заполнения их с соответствующей экспозиции среднего (различные токсиканта концентрации). Добавьте соединение для получения правильной концентрации.
2. Переноса личинок (48 ч после вылупления) индивидуально в контейнеры (1 рыбы в контейнер для индивидуального мониторинга).
   Примечание: Рыбы подвергаются индивидуально для сведения к минимуму потенциальных смешанные последствия социального взаимодействия, таких как конкуренция за питание и агрессии. Однако визуально взаимодействовать в соответствии с этическими стандартами для использования лабораторных животных разрешается рыба.
3. Последующие этот острого воздействия продолжительностью до 2 недель. В это время кормить рыб ad libitum с науплий артемии два раза в день, 7 дней в неделю.
4. Обновление среды каждый день для поддержания качества воды и сведения к минимуму потенциальных последствий составных деградации. Мониторинг ключевых воды переменных (растворенного кислорода должна превышать 80%, проводимость должна варьироваться между 600 и 700 мкСм/см, рН между 7,8 и 8.2 и твердость (как СаСО₃) между 350 и 450 мг/Л, которая находится в пределах оптимальных условий выращивания ⁹ н. furzeri ). Взять пробы воды до и после обновления среды для определения фактической составные концентрации.
5. Конечные точки
   1. Проверка рыбы для смертности, стресс (например аберрантное поведение: плавание вниз) или болезни ежедневно (утро, вечер). Обратитесь к публикации Шедда и др. (1999) ¹² сведения о наблюдении за смертности, стресса или болезни.
   2. Рассчитать LC₅₀ значения основаны на смертность, с использованием доза реакция кривых (Ритц и Streibig, 2005) в разное время точках. Используйте функцию drm в пакете ДРК в v3.2.3 R (R развития Core Team, 2016) или аналогичных статистических подходов.

3. хронического воздействия протокол

Примечание: Цель как минимум 25 рыбы/состояние в начале эксперимента, чтобы свести к минимуму шансы перекос соотношения полов и для размещения потенциальных фон смертности от естественных причин (т.е. Возрастная смертность).

1. Инкубационные (см. раздел 1)
2. Этап I (2 дней после вылупления-16 дней после вылупления)
   1. Следовать протоколу, как описано в 2.1-2.4
   2. Как на втором этапе эксперимента, носитель будет деградировать на протяжении недели (не буфет, см. ниже). Храните необходимое количество среднего за неделю в больших контейнерах инертным для того, чтобы разрешить подобные деградации соединения.
3. Этап II (16 дней после вылупления-конец)
   1. Приготовить 2 Л экспериментальной стеклянные баночки, комплексообразующие их с территории комплекса. Заполнить банки с правильной экспозиции среднего и добавить воздушную трубку для аэрации банку. Рыба в дом индивидуально в этих банках на оставшуюся часть эксперимента. Возможность визуального взаимодействия для размещения этических стандартов.
   2. Обновление среды один раз в неделю. Рыба с чистой передать новый jar, содержащий же среднего воздействия. Взять пробы воды каждый день на протяжении недели для мониторинга деградации комплекса в каждом лечения концентрация. Вычислить, что деградация кривую для каждого лечения, если несколько стресс тестирование (например , токсичность комплекса в различных температурных режимов). Мера абиотических параметров (рН, температура, % растворенного кислорода, проводимость) три раза в неделю.
   3. От 2 дней после вылупления (dph) до 23 dph корма рыбы два раза в сутки, 7 дней в неделю науплий артемии ad libitum . От 24 dph - 37 dph, дополняют объявление libitumArtemia диета с нарезанным Chironomus личинки. От 38 dph на корма рыбы два раза в сутки, 7 дней в неделю Ад Либитум замороженные Chironomus личинки.
4. Конечные точки
   1. Ежедневно проверяйте рыбы для¹²смертности, стресса или болезни.
   2. Для определения роста, измерьте размер тела на еженедельной основе (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) путем передачи рыбы на чашку Петри, наполненный среднего от их водохранилище. 4-5 размер калиброванные фотографии рыбы сверху (на фиксированную высоту) и анализировать их цифровой подписью с использованием пространственного измерения программы (например ImageJ).
      Примечание: Для взрослых рыб, используйте выше Петри блюдо для сведения к минимуму обработку стресс, сохраняя все рыбы, погруженной в течение всего процесса измерения.
   3. Для мужчин созревания осмотрите рыбы ежедневно для окраски от 15 dph года. Проверьте лопасти для первые признаки брачного цветностью (вторичные сексуальные характеристики). Используйте в первый день, на котором это видно как прокси для мужчин созревания время.
   4. Пара-сексуальны рыбы с мужчины той же группы лечения или не экспериментальный мужчин три раза в неделю с 30 dph начиная с тем, чтобы определить время женщины созревания (в день сдачи первое яйцо). Для этого используйте описанные в 3.4.5 нереста протокол.
   5. Для плодовитости, пара Зрелые самки с пожилые мужчины 3 раза / неделя с 30 dph, в пределах их лечения с использованием схемы пересечения.
      1. Подготовить нереста танк (1 Л) для каждой пары, с использованием среднего воздействия от мужской аквариум, дополнена нереста субстрата (мелкий песок < 500 мкм).
      2. Передача мужское и женское в нерестовый бак и позволяют им икру на два часа. Свести к минимуму человеческой деятельности или помеха вокруг нереста контейнеров в ходе этого процесса.
      3. После этого аккуратно передачи рыбы обратно в их оригинальный корпус контейнеров, без ненужных смешивания воды, которая будет кружиться вверх яйца в Нерестовый субстрат.
      4. Отфильтруйте яйца, поливая Нерестовый субстрат над сеткой 500 мкм. Количество яиц и передавать их (с помощью мягкой пинцет) на влажный торф верховой кипованный в Петри^9,14.
      5. Удалите мертвые яйца ежедневно. После того, как в неделю, печать Петри блюдо с пленки для запайки и хранить его в температуре контролируемых инкубатор на 28 ° C и в 14:10 h свет: темные цикла для немедленной разработки к этапу DIII (т.е. готовы люк после примерно трех недель). Для длительного хранения Храните яйца в 17 ° C в постоянной темноты на которой яйца Фаза покоя и оставаться жизнеспособным в течение нескольких лет. При наборе рыбы из этих спящих яйца для экспериментов, передать условий 28 ° C с 14:10 h свет: темные цикла примерно на три недели для разработки к этапу DIII спящие яйца.
   6. Измерьте критических тепловой максимальный (CTmax) (мера производительности¹⁵) взрослых рыб.
      1. Использовать ванну с водой, который подогревается с постоянной скоростью 0,33 ° C/мин и в которых непрерывно циркулирует вода. Добавьте несколько 1 Л аквариумов для каждого индивидуального рыбы.
         Примечание: Учитывая ограничения пространства на водяной бане, это необходимо для работы в нескольких серий. При выполнении статистического анализа, включив «серии» как случайный фактор следует учитывать потенциальные различия в условиях между серии.
      2. Начало судебного разбирательства путем добавления рыб в аквариум, когда вода в аквариуме достиг экспериментального выращивания температуры рыбы (как правило 28 ° C). Мониторинг температуры в 1 Л аквариумов CTmax ванны каждые 5 мин с использованием цифровой термометр (0,1 ° C шкала).
      3. Конце судебного разбирательства, когда рыба не удается поддерживать dorso вентрально вертикально или начинает дергаться сильно^16,17. Измерение температуры в 1 Л аквариум, который является критическим максимальная температура. Передача рыбу обратно в его экспериментального жилья для восстановления.
   7. Измерения веса (с точностью до 0,1 мг) рыбы в последний день эксперимента, погладив ее сухой и передачи его на лодке взвешивания. Примечание: Вся рыба должна измеряться четыре часа после последнего кормления стандартизировать вес пищи в желудочно-кишечном тракте.
   8. Усыпить рыбы с использованием 0,1% Tricaine.

4. следующим воздействия протокол

Примечание: Для измерения следующих воздействия загрязнителей на N. furzeri, следуйте хронического воздействия протокола, изложенные выше для первого поколения.

1. Два раза в неделю, проверьте развитие производства яиц (т.е. Второе поколение) хранится на 28 ° C 14:10 h свет: темные условия цикла, проверяя Петри для эмбрионов в фазе DIII (см. Polačik и др. ⁹2016). Когда более чем 50 реплицирует каждого родительского обращения полностью развиты, Люк их после протокол 1.1.
2. Разоблачить здорового, динамичного рыбы set-up и лечения как родительский рыбы.

Результаты

Результаты острого воздействия N. furzeri различных концентраций меди, рассчитывается как 2.5.2, показать cleardose-реакция (рис. 1). Существует увеличение смертности с увеличением концентрации токсиканта. LC₅₀ значения уменьшаться с течением времени, чт...

Обсуждение

Эта работа описывает новый биопроб, используя Nothobranchius furzeri, новые модели организма, для изучения личности и комбинированные долгосрочные последствия токсикантов и другие раздражители. Представлены протоколы были успешно применяется для измерения чувствительности видов ядовиты?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
purified water Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastic tank	SAVIC		Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning)	Avamoplast		Always separate material for control and toxicity treatments
nets	Aqua bilzen		Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		frozen
tricaine	Sigma aldrich
petri dishes	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
tweezers	FST
500 µm mesh sieve	/		self-made
microcentrifuge tube (2ml)	BRAND		To store fish in freezer
glass vials	Sigma aldrich		For water analysis
weighing boat	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
water bath	Gilac		for Ctmax
liquid nitrogen	Air liquide
digital thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
calibrated balance	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform for camera	/		self-made
Multiparameter kit	HACH
Freezer (-80°C)	Panasonic Ultra low temperature freezer
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fysio
homogenisation buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagent	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein dye	VWR
96-well microtiter plate	Greiner Bio-one
384 microtiter plates	Greiner Bio-one
2 ml glass tubes	Fiers		For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes	VWR
homogeniser	Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer	Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako