급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

요약

이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

초록

송사리 Nothobranchius furzeri ecotoxicology의 분야에서 신흥 모델 유기 체 이며, 급성 및 만성 ecotoxicity 테스트에 그것의 적용은 입증 되었습니다. 전반적으로, 독성 화합물을 종족의 감도, 또는 이상, 다른 모델의 범위입니다.

이 작품 명. furzeri에 대 한 단일 및 결합 된 스트레스 효과의 급성, 만성, 및 대가족제 생물 검정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 짧은 성숙 시간 및 주기,이 척추 모델 4 개월 이내 끝점 성숙 시간과 통치 등의 연구를 수 있습니다. Transgenerational 전체 수명 주기 노출 시험 빠르면 8 개월만에 수행할 수 있습니다. 이 종 가뭄 방지 계란을 생산 하 고 있기 때문에 가능한 오랫동안 유지, 종족의 현장 문화 필요 하지 않습니다 하지만 개인 필요할 때 채용 될 수 있습니다. 프로토콜은 측정 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 설계 되었습니다.

서문

전략적으로 선택한 유독 종족의 감도 프로필 유럽 도달 법안 (등록, 평가, 승인, 및 화학 물질의 제한)에 대 한 설명된¹ 되었습니다. 급성 또는 단기 독성 테스트 그들은 종족의 감도의 빠른 알려주지이 목적을 위해 주로 사용 했다. 그러나, 그들의 자연 환경에서 유기 체는 더 이상 기간 동안 노출 하 고 전체 수명 주기 또는 심지어 여러 세대 수 있습니다 영향을 받는²키를 누릅니다. 또한, 오염 된 환경에 있는 유기 체는 일반적으로 노출 이상의 스트레스를 한 번에, 서로 상호 작용 수 있는 시너지 효과³발생할. 따라서, 안전한 농도 계산된에 따라 급성, 단일 스트레스 독성 테스트 이용과 자연 환경에 의해 부과 된 실제 위험을 과소 평가 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 또한 유럽 위원회^4,5 와 USEPA (미국에 의해 주 창으로 환경 관련 컨텍스트에서 이용과의 sublethal 농도의 만성 및 대가족제 효과 공부 하는 것이 좋습니다. 미국 환경 보호국)^6,7. 특히 척추 연구, 노동, 돈, 그리고 시간 비용에 높은 척추 동물 무척 추 동물 모형 유기 체에 비해 상대적으로 긴 수명으로 인해 만성 및 대가족제 노출 연구를 수행할 때. 따라서, 그것은 가장 적절 한 물고기 모델 유기 체, 연구 질문에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 또한, 광범위 한 척 추가 있는 종 규정 가장 민감한 종에 따라 적응 수 종에 걸쳐 응답의 보편성을 테스트 하기 위해 사용할 수 있어야. 지금, 새로운, 척추 모델 종 척추 동물^7,8에 만성와 대가족제 노출 수행의 비용을 줄이고 짧은 주기가 특징으로 효율적인 프로토콜을 개발 하는 필요가 있다.

청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 는 짧은 성숙 시간과 라이프 사이클 (생성 시간 4 주⁹미만) 때문에 같은 장기 노출 실험에 사용 하는 재미 있는 물고기 모델입니다. 즉, 성숙 시간과 통치 등 생태 관련 끝점 다른 물고기 모델⁷에 비해 짧은 시간 프레임 내에서 공부 될 수 있다. 또한,이 물고기 유지 함으로써 지속적인 문화⁹에 대 한 필요성을 제거 하는 표준 조건 하에서 저장 될 때 몇 년 동안 가능한 가뭄 방지, 휴면 계란 생산. Ecotoxicological 연구에서이 또한 물고기 수 모두 해치 할 정확한 동일한 순간에 서로 다른 시간에 생산 하는 계란의 배치 중 에서도 모든 동물에 대 한 시간 synchrony에 결과 복제를 의미 합니다. GRZ 스트레인 실험실을 사용 하 여 노출 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 이 긴장 실험실 조건 하에서 잘 수행, homozygous (성 염색체)를 제외 하 고는 게놈은 잘 성격 나타낸된^10,11.

Ecotoxicological 연구에서 그것은 시험 농도의 적절 한 범위를 선택 하는 것이 중요입니다. 여러 가지 보완적인 방법을이 끝을 사용할 수 있습니다. 공칭 농도 범위 Nothobranchius guentheri¹²등 관련된 동물의 감도 기반으로 수 있습니다. 또는, 범위는 표준 어 모델, 대부분 유독 (필립 외 에 비해 감도가 zebrafish (Danio rerio)² 의 감도에 근거 할 수 있다 (에서 검토)). 함께, 이러한 옵션을 모두 찾는 실험 범위 명목상 농도 범위를 선택 하 실시 한다. 급성 테스트에 대 한 연구는 toxicant에 노출의 24 시간 후 100% 사망률, 중간 사망률 0% 사망률과 집중 치료에 대 한 목표로 한다. 테스트용 만성, 그것은 찾는 경우 높은 테스트 농도 조건에서 애벌레 사망률이 기준 기간 동안 10%를 초과 하지 않는 확인 하려면 2 주 동안 실험 범위를 실행 하는 것이 좋습니다.

프로토콜은 스트레스 두 개인 및 세포 수준에서의 잠재적인 효과 조사 waterborne 오염 물질에 급성 및 만성 노출 명. furzeri에 수행 하는 기준으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 높은 생태 관련성, 다른 유독한 화합물을 혼합 또는 오염 및 다른 자연 스트레스 (예: 포식) 간의 대화형 효과 공부에 맞게 멀티 스트레스 연구를 수행 하 사용 될 수 있습니다 또는 anthropogenic 스트레스 (예: 기후 변화로 인해 지구 온난화).

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 KULeuven의 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 화 명 furzeri 의 일반 유지 보수

1. 준비 물고기 14 ° C의 온도에서 매체 (pH 7)와 600 µS/c m (24 ° C)의 전도도에 추가 표준화 된 소금, 정제 타입 II 물을 추가.
2. 표준화 된 조건¹³에서 저장 된 GRZ (Gona-토크쇼-Zhou) 연구소 라인에서 계란을 선택 합니다. (즉 해치 준비), DIII 단계에서 계란을 선택 인식할 수 있는 황금 눈⁹ 의 그리고 부드럽게 존재에 의해 그들 핀셋의 부드러운 쌍을 전송 플라스틱 2 리터 탱크 (탱크 당 더 이상 약 30 알).
   참고: 하기 위해서는 건강 한 시험 생물의 충분 한 수, 필요한 물고기 애벌레의 수로 두 번 많은 계란 해치.
3. 12 ° C에서 물고기 매체의 1 cm를 추가 하 고 물 온도 실내 온도 (24 ° C)⁹점차 수렴 하 게. 물고기는 처음 12 h 이내 해치 것입니다.
4. 24 시간 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemianauplii 집중된 투여 (대 한 음식의 양과 주파수에 자세히 Polačik 외. 2016⁹번 식 프로토콜을 참조)에 의해 5 cm에 물 깊이 증가 물고기 매체 추가.
5. 36 h 후 피드는 파묻혀 갓 부 화 Artemia nauplii 의 다른 집중된 투여 하 고 물고기 매체 물 깊이 10 cm를 증가 추가 합니다.
6. 14 h:10 h에서 일정 한 온도 조건 (예: 보육, 기후 실 또는 온수 물 목욕) 물고기 컨테이너를 품 어 빛: 다크 정권.
7. 실험을 시작 하기 전에 복잡 한 물고기 컨테이너 (물고기) 노출 노출 매체의 높은 농도 함께 그들을 작성 하는 것 그것을 떠날 하 여 복합 하룻밤 실제 컨테이너에 유독의 전송을 제한 하려면 실험입니다.
8. 해칭, 후 48 h 노출 실험을 시작 하는 건강 한 부 력 애벌레를 선택 합니다. 무시 하 고 결과적으로 장애인된 부 력 그들의 수영 방광을 채우기 할 수 없었던 소위 배 슬라이더 (지속적으로 바닥에 싱크).

2. 단기 노출 프로토콜

참고: 연구원 치료 당 적어도 20 복제 (별도 항아리에 20 물고기)에 대 한 목표로 한다. 용 매를 사용 하 여 화합물의 재고 솔루션을 준비 하는 경우 모든 권한 치료 뿐만 아니라 용 매 제어는 포함 되어야 합니다. 솔벤트 컨트롤 최고 노출 농도에서 용 매 농도 인 용 매의 양을 포함 해야 합니다.

1. 그들 하 고 적절 한 노출 매체 (다른 toxicant 농도)와 그들을 작성 하는 것에 의해 실험 용기 (0.5 L 유리 항아리)를 준비 합니다. 정확한 농도 얻기 위해 화합물을 추가 합니다.
2. 컨테이너 (개별 모니터링에 대 한 컨테이너 당 1 물고기)에 애벌레 (48 h 후 부 화)를 개별적으로 전송 합니다.
   참고: 물고기 음식과 침략에 대 한 경쟁 등 사회적 상호 작용의 잠재적인 혼란 효과 최소화 하기 위해 개별적으로 노출 됩니다. 그러나, 물고기 실험 동물 사용에 대 한 윤리 기준에 따라에서 시각적으로 상호 작용할 수 있습니다.
3. 최대 2 주 동안이 급성 노출 후속. 그 시간 동안, 물고기 먹이 광고 libitum Artemia nauplii 두 번 하루, 7 일/주를.
4. 새로 고침 매체 매일 수 질을 유지 하 고 복합 저하의 잠재적인 영향을 최소화 합니다. 주요 물 변수 모니터링 (용 존된 산소 수준 80%를 초과 한다, 전도도 해야 600 그리고 700 µS/c m, pH 7.8와 8.2, 고 경도 (CaCO₃)로 사이 350와 450 mg/L, 최적의 양육 조건의 범위 내 명. furzeri ⁹)에 대 한. 전과 후 실제 화합물 농도 결정 하는 매체 물 샘플을 가져가 라.
5. 끝점
   1. 물고기 사망, 스트레스에 대 한 확인 (예: 탈 선 행동: 거꾸로 수영) 또는 질병 매일 (아침, 저녁). Shedd 외 의 게시를 참조 하십시오 (1999) 사망률, 스트레스 또는 질병의 관찰에 대 한 내용은 ¹² .
   2. LC 계산 복용량 응답 곡선 (리츠와 Streibig, 2005)를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 사망률에 따라₅₀ 값. Drm 함수를 사용 하 여 R v3.2.3 (연구 개발 핵심 팀, 2016) drc 패키지에서 또는 유사한 통계 접근.

3. 만성 노출 프로토콜

참고: 상태 생선/25 비뚤어진된 섹스 률의 가능성을 최소화 하 고 자연적인 원인으로 인 한 잠재적인 배경 사망률에 맞게 실험의 발병의 최소 목표 (즉. 연령 관련 사망률).

1. (참조 1) 부 화
2. 차 전 (2 일 후-16 일 후 부 화 부 화)
   1. 2.1-2.4에 설명 된 대로 프로토콜을 따라
   2. 실험의 두 번째 단계 동안 매체 주 (없음 다, 아래 참조)에 걸쳐 떨어집니다. 화합물의 비슷한 저하를 허용 하기 위하여 큰 불활성 용기에 1 주일에 대 한 매체의 필요한 양을 저장 합니다.
3. 단계 II (16 일 후 부 화-끝)
   1. 2 L 준비 실험 유리 항아리 complexing에 의해 그들 화합물으로. 정확한 노출 매체와 항아리와 항아리 공기에 쐬는 공기 튜브를 추가. 실험의 나머지 부분에 대 한 이러한 항아리에 개별적으로 집 물고기. 윤리 기준에 맞게 시각적 상호 작용을 허용 합니다.
   2. 주 당 한 번 매체를 새로 고칩니다. 동일한 노출 매체를 포함 하는 새 항아리에 그물과 물고기를 전송. 각 농도 처리에서 화합물의 저하를 모니터링 하는 데 1 주일 동안 매일 물 샘플을 가져가 라. 각 치료 경우 여러 스트레스에 대 한 저하 곡선 테스트 (예: 다른 온도 정권에서 화합물의 독성)를 계산 합니다. 주 당 세 번 abiotic 매개 변수 (pH, 온도, 용 존 % 산소, 전도도)를 측정 합니다.
   3. 2 일 후 부 화 (dph) 23 dph까지, 하루에 두 번, 주 ad libitum Artemia nauplii 당 7 일 물고기를 먹이. 24 dph-37 dph에서에서 다진된 Chironomus 애벌레와 광고 libitumArtemia 다이어트를 보완. 에 38 dph에서 두 번 하루, 7 일 주일 광고 libitum Chironomus 애벌레 냉동 물고기를 먹이.
4. 끝점
   1. 매일 물고기 사망, 스트레스 또는 질병¹²에 대 한 확인 합니다.
   2. 결정 성장, 페 트리 접시에 생선을 전송 하 여 (9 dph-16 dph-21 dph-...) 주간 기준 본문 크기를 측정 하는 그들의 저수지에서 매체 가득 합니다. (고정된 높이)에서 4-5 위에서 물고기의 보정 크기 사진을가 고 디지털 공간 측정 프로그램 (예: ImageJ)를 사용 하 여 그들을 분석.
      참고: 성인 물고기에 대 한 전체 프로세스를 측정 하는 동안 잠긴 모든 물고기를 유지 하 여 처리 스트레스를 최소화 하기 위해 높은 페 트리 접시를 사용 합니다.
   3. 남성 성숙에 대 한 시각적으로 매일 15 dph 이후부터 채색에 대 한 물고기를 검사 합니다. 결혼식 채색 (2 차 성적 특성)의 첫 번째 징후에 대 한 지 느 러 미를 확인 하십시오. 이 표시 됩니다 프록시 남성 성숙으로 첫 날을 사용 합니다.
   4. 커플 비 sexed 물고기 같은 치료 그룹의 남성 또는 주당 3 회 실험 비 남성 30 dph에서 이후 여성 성숙 시간 (첫 번째 계란 입금 일)을 결정 하기 위하여. 이 위해, 3.4.5에 설명 된 산란 프로토콜을 사용 합니다.
   5. 통치에 대 한 몇 가지 성숙한 성숙한 남성과 여성 3 회 / 30 dph 주 이후, 그들의 처리에서 사용 하 여 횡단 계획.
      1. 산란 탱크 (1 L) 기판 산란 보충 남성 수족관에서 노출 매체를 사용 하 여 각 커플에 대 한 준비 (미세 모래 < 500 µ m).
      2. 산란 탱크에 남성과 여성 모두 전송 및 2 시간 동안 산란 하도록 허용. 인간의 활동 또는이 프로세스 동안 산란 컨테이너 주위 방해를 최소화 합니다.
      3. 그 후, 부드럽게 물고기 다시 전송 그들의 원래 주택 컨테이너 산란 기판에 달걀을 소용돌이 물의 불필요 한 혼합 없이.
      4. 500 µ m 메쉬 위에 산란 기질을 붓는 의해 계란을 필터링. 계란을 계산 하 고 그들을 전송 (사용 하 여 부드러운 핀셋) 접시^9,14에서 축축한 물 이끼를.
      5. 매일 죽은 계란을 제거 합니다. 후 주, 물개는 페 트리 필름 밀봉 된 접시와 온도에 저장 제어 28 ° C에서 인큐베이터와 14시 10분 h 빛: 다크 DIII 단계 (즉, 약 3 주 후 해치 준비)을 즉시 개발 주기. 장기 보관을 위해 따라 계란 휴면 단계를 입력 하 고 가능한 여러 년 남아 지속적인 암흑에서 17 ° C에 계란을 저장. 14:10 h 28 ° C 조건 실험, 휴면이 계란에서 모집 물고기 전송 휴면 계란 빛: 다크 DIII 단계로 개발 수 있도록 약 3 주에 대 한 주기.
   6. 성인 물고기의 중요 한 열 최대 (CTmax) (¹⁵성능 측정)를 측정 합니다.
      1. 0.33 ° C/min의 일정 한 속도로 열 물 목욕을 사용 하 고 물을 지속적으로 순환 됩니다. 각 개별 물고기에 대 한 몇 가지 1 L aquaria을 추가 합니다.
         참고: 물 목욕에서 공간 제약을 감안할 때, 그것은 여러 시리즈에서 일 필요가 있다. 시리즈 중 조건에서 잠재적인 차이 계정에 임의의 요소로 ' 시리즈'를 포함 하 여 통계 분석을 수행할 때 취해야 한다.
      2. 수족관에 물에는 물고기 (일반적으로 28 ° C)의 실험적인 양육 온도 도달 했습니다 때 수족관에 물고기를 추가 하 여 재판을 시작 합니다. 디지털 온도계 (0.1 ° C 스케일)를 사용 하 여 모든 5 분 1 L aquaria CTmax 목욕의 온도 모니터링 합니다.
      3. 물고기 dorso ventrally 수직 위치를 유지 하거나 무 겁 게^16,17꿈 틀 시작 때 재판을 종료. 중요 한 최대 온도 1 L 수족관에서 온도 측정 합니다. 물고기는 그것의 실험 주택 복구에 대 한 다시 전송.
   7. 건조 모리 아 티와 무게 보트에 전송 하 여 실험의 마지막 날에는 생선의 무게 (0.1 mg 정확도)를 측정 합니다. 참고: 모든 생선 창 자에서 음식 무게 표준화에 마지막 수 유 후 4 시간 측정 한다.
   8. 0.1%를 사용 하 여 물고기를 안락사 Tricaine.

4. Transgenerational 노출 프로토콜

주: 명. furzeri에 오염 물질의 transgenerational 효과 측정 하는 1 세대에 대 한 위에서 설명한 만성 노출 프로토콜을 따릅니다.

1. 매주 두 번, 28 ° C에 저장 된 생산된 계란 (즉 2 세대)의 개발 확인 14시 10분 DIII 단계에서 배아의 배양 접시를 검사 하 여 h 빛: 다크 주기 조건 (Polačik 외. 참조 2016⁹)입니다. 각 부모의 치료의 50 개 이상의 복제 완전히 개발 되는 때, 1.1에서 프로토콜을 따르고 그들을 해치.
2. 건강 한, 잘 뜨는 물고기 정확 하 게 동일한 설치 및 부모의 물고기 치료를 노출.

결과

명. furzeri 의 구리의 다른 농도 급성 노출의 결과 2.5.2에서 계산, cleardose-응답 관계 (그림 1). Toxicant 농도 증가와 사망률에서 증가 있다. LC₅₀ 값 시간이 지남에 감소는 농도 감소와 함께 더 많은 시간 복제 다의 50% 통과 의미. 에 대 한 자세한 결과 다른 종에 비해 종 감도의 비교 뿐만 아니라 구리 하 명 furzeri 의 급성 및 만성 노출 ?...

토론

이 작품 Nothobranchius furzeri, 신흥 모델 유기 체, 개인 연구를 사용 하 여 새로운 생물을 설명 하 고 유독 다른 스트레스의 장기적인 효과 결합. 제시 프로토콜 성공적으로 유독 (구리, 카드뮴, 3, 4-dichloroaniline, 및 chlorpyrifos)의 배열에 종의 감도 측정에 적용 했다. 그것의 빠른 수명 주기 때문이 척추 모델 sublethal의 평가 대 한 허용 하 고 transgenerational 4 개월 이내 효과. 이 어류를 사용 하 여 독성 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
purified water Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastic tank	SAVIC		Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning)	Avamoplast		Always separate material for control and toxicity treatments
nets	Aqua bilzen		Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		frozen
tricaine	Sigma aldrich
petri dishes	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
tweezers	FST
500 µm mesh sieve	/		self-made
microcentrifuge tube (2ml)	BRAND		To store fish in freezer
glass vials	Sigma aldrich		For water analysis
weighing boat	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
water bath	Gilac		for Ctmax
liquid nitrogen	Air liquide
digital thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
calibrated balance	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform for camera	/		self-made
Multiparameter kit	HACH
Freezer (-80°C)	Panasonic Ultra low temperature freezer
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fysio
homogenisation buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagent	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein dye	VWR
96-well microtiter plate	Greiner Bio-one
384 microtiter plates	Greiner Bio-one
2 ml glass tubes	Fiers		For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes	VWR
homogeniser	Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer	Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako