פרוטוקול עבור סימן ובדיקות כרונית Ecotoxicity של דגים גמבוזיים טורקיז Nothobranchius furzeri

Summary

בעבודה זו, אנו מתארים של bioassay אקוטית, כרונית, multigenerational ללמוד את ההשפעות של לחצים יחיד ומשולבים על דגים גמבוזיים טורקיז Nothobranchius furzeri. פרוטוקול זה תוכנן כדי ללמוד היסטוריה-החיים תכונות (התמותה, צמיחה, פוריות, משקל) ומקסימום תרמי קריטי.

Abstract

דגים גמבוזיים Nothobranchius furzeri אורגניזם מודל המתעוררים בתחום ecotoxicology, כבר הוכיחה את תחולתן בבדיקות ecotoxicity אקוטי וכרוני. הכולל, הרגישות של המין על תרכובות רעילים הוא בטווח של, או גבוה יותר, זו של מינים אחרים מודל.

עבודה זו מתארת פרוטוקולים עבור bioassays אקוטית, כרונית, multigenerational של השפעות הלחץ יחיד ומשולבים על furzeri ש. בשל זמן קצר ההבשלה שלה מחזור חיים, דגם חוליות זה מאפשר הלימוד של נקודות קצה כגון ופוריות, זמן ההבשלה בתוך ארבעה חודשים. Transgenerational מחזור חיים מלא חשיפה ניסויים יכול להתבצע בקטנה כמו שמונה חודשים. כיוון מין זה מייצרת ביצים שאינן עמידים לבצורת מורדם במשך שנים, תרבות באתר של המין אין צורך אבל יכול להיות גויסו אנשים בעת הצורך. הפרוטוקולים נועדו למדוד תכונות החיים-היסטוריה (התמותה, צמיחה, פוריות, משקל) ומקסימום תרמי קריטי.

Introduction

רגישות פרופילים של מערך של מינים כדי חשיפה לרעלים שנבחרה אסטרטגית כבר מתואר¹ עבור החקיקה האירופית להגיע (רישום, הערכה, אישור, והגבלה של כימיקלים). בדיקות רעילות חריפה או לטווח קצר שימשו בעיקר למטרה זו כפי שהם נותנים אינדיקציה מהירה של הרגישות של זן. אולם, בסביבתם הטבעית, אורגניזמים חשופים במשך תקופות ארוכות הרבה יותר, מלא חיים-מחזורי או אפילו מספר דורות יכול להיות מושפע². יתר על כן, אורגניזמים בסביבות מזוהמים בדרך כלל נחשפים הלחץ יותר מפעם אחת בכל פעם, אשר עשויים לתקשר אחד עם השני, ייתכן וכתוצאה מכך אפקטים סינרגטי³. לפיכך, בדיקות רעילות ריכוזים בטוח מחושב בהתבסס על הלחץ חריפה, יחיד עשוי לזלזל הסיכונים בפועל שהוטלו על ידי חשיפה לרעלים בסביבות טבעיות. מומלץ, לכן, גם לחקור את ההשפעות כרונית, multigenerational של ריכוזים לא קטלני של חשיפה לרעלים בהקשר לסביבה הרלוונטיים כפי דגלו הנציבות האירופית^4,5 ו של USEPA (ארצות ^6,הברית הסוכנות להגנת הסביבה)⁷. במיוחד במחקר חוליות, העלויות מבחינת העבודה, זמן וכסף גבוהים בעת ביצוע מחקרים חשיפה כרונית ו multigenerational בשל תוחלת החיים ארוכות יחסית של חולייתנים לעומת דגם הגעה אורגניזמים. לכן, מומלץ לבחור את המתאים ביותר דגים אורגניזם מודל, בהתאם שאלת המחקר. יתר על כן, מגוון רחב של מינים חוליות צריך להיות זמין כדי לבחון את הכלליות של תגובות על פני מינים כדי שניתן יהיה להתאים את תקנות בהתבסס על המין הרגישים ביותר. לעת עתה, יש צורך לפתח חדש, פרוטוקולים יעיל עם מינים דגם חוליות מאופיין מחזורי החיים קצרים כדי להוריד את העלויות של ביצוע חשיפות כרונית, multigenerational על בעלי חוליות^7,8.

דגים גמבוזיים טורקיז Nothobranchius furzeri הוא מודל דג מעניין להשתמש בניסויים כאלה-חשיפה לטווח ארוך בשל התבגרות קצרה זמן מחזור החיים (דור זמן פחות מ- 4 שבועות⁹). משמעות הדבר היא כי ניתן יהיה ללמוד רלוונטי מבחינה אקולוגית נקודות קצה כגון ופוריות, זמן ההבשלה בתוך מסגרת זמן קצר לעומת דגמים אחרים דגים⁷. יתר על כן, דגים אלה לייצר ביצים עמידים לבצורת, רדום זה להישאר בר קיימא במשך מספר שנים, כאשר הוא מאוחסן בתנאים סטנדרטיים, ובכך למנוע את הצורך תרבות רציף⁹. במחקרים ecotoxicological, זה מרמז גם על זה שכפול דגים יכול כל לתכנון באותו הרגע המדויק, וכתוצאה מכך בסנכרון זמן עבור כל בעלי החיים, אפילו בקרב קבוצות של ביצים המיוצר בזמנים שונים. אנו מייעצים באמצעות המעבדה GRZ זן ביצוע ניסויים חשיפה. זן זה מבצע גם תחת תנאי מעבדה, היא homozygous (מלבד כרומוזומי המין) הגנום הוא טוב מאופיין^10,11.

במחקרים ecotoxicological, חשוב לבחור את הטווח המתאים של בדיקת ריכוזים. מספר שיטות משלימות יכול לשמש למטרה זו. טווח ריכוז הנומינלי יכול להתבסס על הרגישות של זן קשורים, כגון Nothobranchius guentheri¹². לחלופין, הטווח יכול להיות מבוסס על הרגישות של מודלים דגים סטנדרטיים, כגון דג זברה (רזבורה rerio)² בעלי רגישות דומה ברוב חשיפה לרעלים (פיליפ. et al. (בסקירה)). בשילוב, עם שתי אפשרויות אלה, מגוון מציאת ניסוי צריך להתנהל כדי לבחור טווח הריכוז הנומינלי. בדיקה חריפה, חוקרים צריכות לכוון לטיפולי ריכוז עם 100% תמותה, התמותה ביניים 0% תמותה לאחר 24 שעות של חשיפה toxicant. בדיקה כרונית, מומלץ להפעיל את טווח מציאת ניסוי למשך שבועיים לוודא אם התמותה הזחל בתוך התנאי עם הריכוזים הגבוהים ביותר במבחן לא יעלה על 10% בתקופה זו הפניה.

הפרוטוקול יכול לשמש בסיס לביצוע אקוטי וכרוני מחשיפה מזהמים waterborne על furzeri ש, בחינת ההשפעות האפשריות של לחצים הן ברמת הפרט והן הסלולר. זה יכול לשמש גם לבצע מחקר רב הלחץ כדי להכיל את הרלוונטיות אקולוגית גבוהה יותר, ערבוב חומרים רעילים שונים או לימוד אינטראקטיבי תופעות בין זיהום אחרים לחצים טבעיים (למשל טריפה) או אנתרופוגניים לחצים (למשל ההתחממות עקב שינוי האקלים).

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה האתית של KULeuven.

1. הבקיעה ותחזוקה כללית של furzeri (ש ע)

1. להכין דג בינוני (pH 7) בטמפרטורה של 14 מעלות ולהוסיף מים מורתחים מסוג II, עם מלחי סטנדרטית נוספת, מוליכות של 600 µS/ס מ (24 ° C).
2. בחר ביצים מן הקו מעבדה GRZ (חוזרים-Rhe-ג'ואו) המאוחסנים תחת תנאים סטנדרטיים¹³. בחר ביצים בשלב תרטר (כלומר מוכן לבקיעה), לזיהוי על ידי הנוכחות של העיניים הזהב⁹ ובעדינות להעביר אותם עם זוג מלקחיים רכה מיכל פלסטיק 2 ל' (לא יותר מ 30 ביצים לכל טנק).
   הערה: על מנת לקבל מספר מספיק של אורגניזמים מבחן בריא, בוקעות הביצים כפליים ככל שמספר דגים נדרש הזחלים.
3. להוסיף 1 ס מ של המדיום דגים ב 12 ° C ולתת את טמפרטורת המים בהדרגה מתכנסת בטמפרטורת החדר (24 ° C)⁹. דגים יבקעו בתוך ה 12 הראשון.
4. לאחר 24 שעות, להאכיל הוולדות מנה מרוכזת של טרי המקווקו Artemianauplii (עבור פרטים נוספים על תדירות וכמות המזון, עיין פרוטוקול גידול Polačik. ואח 2016⁹) להגדיל את עומק המים כדי 5 ס מ על ידי הוספת המדיום דגים.
5. לאחר 36 ה', להאכיל את הצאצאים עוד מנה מרוכזת של טרי המקווקו Artemia הדברים , להוסיף דג בינוני כדי להגדיל את עומק המים 10 ס מ.
6. דגירה מיכלי דגים בתנאי טמפרטורה קבועה (למשל חממה, אקלים חדר או אמבט מים מחומם) תחת ה 14 h:10 בהירה: כהה המשטר.
7. לפני תחילת הניסוי, מיכלי דגים מורכבים (ללא דגים) עם החשיפה מורכבים על-ידי מילוים הריכוז הגבוה ביותר של חשיפה בינונית ולהשאיר אותו בן לילה על מנת להגביל את ההעברה של חשיפה לרעלים לגורם ב בפועל הניסוי.
8. 48 שעות לאחר הבקיעה, בחר הזחלים קליל בריא כדי להתחיל את הניסוי חשיפה. למחוק את הבטן-המחוונים כביכול הצליחו למלא שלפוחית אוויר שלהם ועל כן ציפה לקוי (ללא הרף לשקוע לתחתית).

2. פרוטוקול חשיפה לטווח קצר

הערה: חוקרים צריך לשאוף לפחות 20 משכפל (20 דגים בצנצנות נפרדות) לכל טיפול. בנוסף טיפול שליטה מלאה, פקד הממס צריך להיות כלול אם הפתרון מניות של המתחם מוכנה תוך שימוש של הממס. הפקד ממס צריכה להכיל את כמות הממס שווה את הריכוז ממס ב הריכוז הגבוה ביותר של חשיפה.

1. הכן את מכולות ניסיוני (צנצנות זכוכית חצי ליטר) על ידי תיוג אותם וממלאים אותם עם המדיום המתאים חשיפה (ריכוזים שונים toxicant). הוסף את המתחם כדי להשיג את הריכוז הנכון.
2. העברת זחלים (48 שעות לאחר הבקיעה) בנפרד המכולות (1 דגים לכל מיכל לניטור בודדים).
   הערה: הדגים חשופים בנפרד כדי למזער את ההשפעות האפשריות מבלבלים של אינטראקציה חברתית כגון תחרות על מזון ואגרסיביות. עם זאת, דגים מותר לקיים אינטראקציה באופן חזותי בהתאם לסטנדרטים אתיים לשימוש חיות מעבדה.
3. מעקב חשיפה אקוטית זו עבור משך זמן של עד שבועיים. במהלך זמן זה, להאכיל את הדגים ad libitum עם הדברים Artemia פעמיים ביום, 7 ימים בשבוע.
4. רענן את המדיום בכל יום כדי לשמור על איכות המים, כדי למזער את ההשפעות האפשריות של תרכובת השפלה. לפקח על מים מפתח משתנים (רמות החמצן המומס יעלה 80%, מוליכות צריך טווח בין µS 600, 700/cm, pH בין 7.8 8.2, ואת קשיות (כמו קאקו₃) בין 350 ל- 450 מ ג/ליטר, אשר נמצא בטווח של תנאי גידול אופטימאליים (ש ע) furzeri ⁹). לקחת דגימות מים לפני ואחרי רענון של המדיום כדי לקבוע ריכוז מתחם בפועל.
5. נקודות קצה
   1. בדוק דגים לתמותה, מתח (למשל התנהגות חריגה: שחייה במהופך) או מחלה ביום (בוקר, ערב). להתייעץ עם פרסום Shedd. et al. (1999) ¹² לפרטים על התצפית של התמותה, מתח או מחלה.
   2. לחשב LC₅₀ ערכים בהתבסס על התמותה באמצעות עקומות מנה-תגובה (Ritz ו Streibig, 2005) בנקודות זמן שונות. השתמש בפונקציה drm בחבילה הרפובליקה הדמוקרטית של קונגו ב- v3.2.3 R (R פיתוח צוות הליבה, 2016) או גישות סטטיסטיות דומה.

3. חשיפה כרונית פרוטוקול

הערה: לכוון מינימום של 25 דגים/תנאי מיד עם תחילת הניסוי, כדי למזער את הסיכוי מוטה-יחס, כדי להכיל פוטנציאל רקע התמותה עקב נסיבות טבעיות (כלומר. התמותה הקשורות לגיל).

1. אינקובטור (ראה סעיף 1)
2. שלב I (2 ימים לאחר הבקיעה-16 ימים לאחר הבקיעה)
   1. לעקוב אחר הפרוטוקול כפי שמתואר 2.1 2.4
   2. במהלך השלב השני של הניסוי, המדיום תגרע בכל ימות השבוע (ללא כיבוד, ראה להלן). לאחסן את הכמות הנדרשת של בינוני במשך שבוע במכולות אינרטי גדולות על מנת לאפשר השפלה דומה של המתחם.
3. Phase II (16 ימים לאחר הבקיעה-סוף)
   1. להכין 2 ל' זכוכית ניסיוני צנצנות מאת complexing אותם עם המתחם. למלא את הצנצנות עם המדיום חשיפה נכונה ולהוסיף על צינורית אוויר לאוורר את הצנצנת. דג הבית בנפרד בתוך הצנצנות הללו לאורך כל הניסוי. לאפשר אינטראקציה חזותי להכיל סטנדרטים אתיים.
   2. רענן המדיום פעם בשבוע. להעביר את הדג עם רשת צנצנת חדשה המכילה המדיום חשיפה זהה. לקחת דגימות מים כל יום במשך שבוע כדי לפקח על ההשפלה של המתחם בטיפול בכל ריכוז. לחשב עקומת השפלה עבור כל טיפול, אם מספר לחצים שנבדקו (למשל רעילות של תרכובת תחת משטרים טמפרטורה שונות). למדוד פרמטרים והאביוטיים (pH, טמפרטורה, חמצן % מומס, מוליכות) שלוש פעמים בשבוע.
   3. מ- 2 ימים לאחר הבקיעה (dph) עד 23 dph, להאכיל את הדגים פעמיים ביום, 7 ימים לכל הדברים Artemia ad libitum בשבוע. מ- dph 24 - 37 dph, משלימים את הדיאטה ad libitumArtemia עם הזחלים ימשוש קצוצים. מ dph 38 על, להאכיל את הדגים פעמיים ביום, 7 ימים לכל שבוע ad libitum קפוא ימשוש הזחלים.
4. נקודות קצה
   1. מדי יום בדוק דגים התמותה, מתח או מחלה¹².
   2. כדי לקבוע את הצמיחה, למדוד את גודל גוף על בסיס שבועי (dph 9 - 16 dph - 21 dph -...) על ידי העברת הדגים צלחת פטרי מלא בינוני מן המאגר שלהם. לקחת 4-5 תמונות בגודל מכוילים של הדג מלמעלה (בגובה קבוע) ולנתח אותם דיגיטלית באמצעות תוכנית מדידה המרחבי (למשל ImageJ).
      הערה: דגים למבוגרים, השתמש צלחת פטרי גבוה יותר כדי למזער את הלחץ של הטיפול על ידי שמירה על כל הדגים מתחת למים במשך כל מדידה תהליך.
   3. עבור זכר ההבשלה, לבדוק חזותית דגים מדי יום בשביל הגיוון של 15 dph ואילך. בדוק את הסנפירים סימנים הראשון של נישואין הגיוון (מאפיין מינית משנית). השתמש ביום הראשון שבו ניתן לראות זאת כמייצג זמן ההבשלה זכר.
   4. זוג שאינו למינים דגים עם זכרים של קבוצת טיפול זהה או זכרים שאינם ניסיוני שלוש פעמים בשבוע מ- 30 dph ואילך על מנת לקבוע את זמן ההבשלה הנשי (יום להפקיד את הביצה הראשונה). לשם כך, השתמש בפרוטוקול ההשרצה המתוארים ' ר 3.4.5.
   5. על פריון, כמה בוגרת נקבות עם זכרים בוגרים 3 פעמים / שבוע 30 dph ואילך, בתוך הטיפולים שלהם באמצעות ערכת המעבר.
      1. הכינו טנק ההשרצה (1 ליטר) עבור כל זוג, באמצעות חשיפה בינונית מהאקווריום של זכר בתוספת ההשרצה המצע (משובח חול < מיקרומטר 500).
      2. להעביר גם זכר וגם נקבה לתוך הטנק ההשרצה ולאפשר להם להוליד במשך שעתיים. מזער את פעילות אנושית או הפרעה סביב המכולות ההשרצה בתהליך זה.
      3. לאחר מכן, בעדינות העבר דגים בחזרה מכולות דיור המקורי שלהם, ללא ערבוב מיותר של המים, אשר להסתחרר את הביצים המצע ההשרצה.
      4. לסנן את הביצים על ידי מזיגת המצע ההשרצה מעל רשת מיקרומטר 500. לספור את הביצים ולהעביר אותם (באמצעות פינצטה רך) כדי כבול לח פטרי^9,14.
      5. הסר את הביצים מתים מדי יום. לאחר שבוע, החותם פטרי צלחת עם איטום הסרט ואחסן אותו טמפרטורה מבוקרת חממה ב 28 ° C ו- 14:10 מחזור אור h: אפל לפיתוח מיידי לשלב תרטר (דהיינו מוכנים בוקעות לאחר כשלושה שבועות). לאחסון לטווח ארוך, לאחסן את הביצים ב 17 ° C בחשכה קבועה שעליה ביצים להיכנס לשלב רדום והוא מורדם במשך שנים מרובות. כאשר דגים גיוס מביצים רדום אלה לניסויים, להעביר את הביצים רדום לתנאים 28 ° C עם 14:10 h בהירה: כהה מחזור כשלושה שבועות לאפשר פיתוח לשלב תרטר.
   6. למדוד המרבי תרמי קריטי (CTmax) (מדד ביצועים¹⁵) של דגים למבוגרים.
      1. השתמש לאמבט מים מחומם בקצב קבוע של 0.33 ° C/min, שבו המים מופץ באופן רציף. הוסף מספר 1 ליטר aquaria עבור כל דג בודדים.
         הערה: לאור אילוצי מקום באמבט מים, זה הכרחי לעבוד במספר סדרות. פוטנציאל הבדלי התנאים בין סדרת צריך להילקח בחשבון בעת ביצוע ניתוח סטטיסטי על-ידי הכללת 'סדרה' כגורם אקראי.
      2. להתחיל את המשפט על-ידי הוספת הדגים לאקווריום כאשר המים באקווריום הגיעה הטמפרטורה rearing ניסיוני של הדג (בדרך כלל C ° 28). לפקח על הטמפרטורה של 1 ליטר באקווריום של האמבטיה CTmax כל 5-מין באמצעות מדחום דיגיטלי (סולם 0.1 º C).
      3. סיום המשפט כאשר הדג מצליח לשמור על עמדה זקופה dorso-ventrally או מתחיל להתעוות בכבדות^16,17. למדוד את הטמפרטורה באקווריום 1 ליטר, אשר הטמפרטורה המקסימלית קריטי. העברת הדגים חזרה לדיור ניסיוני עבור שחזור.
   7. למדוד את המשקל (דיוק 0.1 מ"ג) של הדגים ביום האחרון של הניסוי על ידי מלטף אותו יבש והעברתו על סירה במשקל. הערה: כל הדגים יש למדוד 4 שעות לאחר ההזנה האחרון לתקנן מזון במשקל של המעיים.
   8. המתת חסד הדג באמצעות 0.1% Tricaine.

4. Transgenerational חשיפה פרוטוקול

הערה: כדי למדוד את ההשפעות transgenerational של מזהמים על furzeri ש, לעקוב אחר הפרוטוקול חשיפה כרונית שפורטו לעיל עבור הדור הראשון.

1. פעמיים בשבוע, לבדוק את התפתחות הביצים המיוצר (כלומר הדור השני) המאוחסנים ב 28 ° C 14:10 בהירה h: כהה תנאים מחזור על-ידי בדיקה של צלחות פטרי עבור עוברי בשלב תרטר (ראה Polačik. et al. 2016⁹). כאשר יותר מ-50 ושכפול של כל טיפול הורים מפותחים לחלוטין, הטץ אותם בעקבות פרוטוקול 1.1
2. לחשוף דגים בריאים, קליל בדיוק את אותה הגדרת והטיפול כמו הדגים הורים.

תוצאות

התוצאות של חשיפת חריפה furzeri ש ל ריכוזים שונים של נחושת, מחושב כמו 2.5.2, להציג קשרי גומלין cleardose-תגובה (איור 1). יש עלייה בתמותה עם הגדלת ריכוז toxicant. LC₅₀ ערכים ירידה לאורך זמן, כלומר כי עם הפחתת ריכוזים, ככל שחולף הזמן לפני 50% של המבלט משכפל. עבור תוצאות ?...

Discussion

עבודה זו מתאר של bioassay חדש באמצעות Nothobranchius furzeri, אורגניזם מודל המתעוררים, ללמוד הפרט, בשילוב השפעות ארוכות טווח של חשיפה לרעלים, לחצים אחרים. הפרוטוקולים הציג הוחלו בהצלחה כדי למדוד את הרגישות של מינים מערך של חשיפה לרעלים (נחושת, קדמיום, 3,4-dichloroaniline ו כלורפיריפוס). בשל מהירות מחזור החיים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
purified water Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastic tank	SAVIC		Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning)	Avamoplast		Always separate material for control and toxicity treatments
nets	Aqua bilzen		Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		frozen
tricaine	Sigma aldrich
petri dishes	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
tweezers	FST
500 µm mesh sieve	/		self-made
microcentrifuge tube (2ml)	BRAND		To store fish in freezer
glass vials	Sigma aldrich		For water analysis
weighing boat	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
water bath	Gilac		for Ctmax
liquid nitrogen	Air liquide
digital thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
calibrated balance	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform for camera	/		self-made
Multiparameter kit	HACH
Freezer (-80°C)	Panasonic Ultra low temperature freezer
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fysio
homogenisation buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagent	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein dye	VWR
96-well microtiter plate	Greiner Bio-one
384 microtiter plates	Greiner Bio-one
2 ml glass tubes	Fiers		For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes	VWR
homogeniser	Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer	Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako