Protocollo per acuto e prove di ecotossicità cronica del turchese Killifish Nothobranchius furzeri

Riepilogo

In questo lavoro descriviamo un biotest acute, croniche e multigenerazionale per studiare gli effetti dei fattori di stress singoli che combinati sul turchese killifish Nothobranchius furzeri. Questo protocollo è progettato per studiare i tratti di storia di vita (mortalità, crescita, fecondità, peso) e critico massimo termico.

Abstract

Il killifish Nothobranchius furzeri è un organismo modello emergenti nel campo dell'ecotossicologia e sua applicabilità nelle prove di ecotossicità acuta e cronica è stata dimostrata. Nel complesso, la sensibilità della specie di composti tossici è nella gamma con, o superiore, quello di altre specie di modello.

Questo lavoro descrive protocolli per analisi biologiche acute, croniche e multigenerazionale di effetti stressor singole e combinate il N. furzeri. Grazie alla sua breve stagionatura e ciclo di vita, questo modello vertebrato permette lo studio di endpoint come tempo di maturazione e fecondità entro quattro mesi. Prove di esposizione di transgenerazionale intero ciclo di vita possono essere eseguite in appena 8 mesi. Poiché questa specie produce uova che sono resistenti alla siccità e rimangono vitale per anni, la cultura in loco delle specie non è necessario, ma gli individui possono essere reclutati quando richiesto. I protocolli sono progettati a misura tratti di storia di vita (mortalità, crescita, fecondità, peso) e critico massimo termico.

Introduzione

Profili di sensibilità di una matrice di specie alle sostanze tossiche strategicamente selezionati sono stati descritti¹ per la normativa europea REACH (registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche). Prove di tossicità acuta o a breve termine principalmente sono state usate per questo scopo in quanto danno una rapida indicazione di sensibilità di una specie. Tuttavia, nel loro ambiente naturale, gli organismi sono esposti per periodi molto più lunghi e cicli di vita completo o anche diverse generazioni potrebbero essere interessato². Inoltre, organismi in ambienti inquinati in genere sono esposti a più di un fattore di stress in un momento, che può interagire con l'altro, possibilmente con conseguente effetti sinergici³. Quindi, sicuro concentrazioni calcolato basato sul fattore di stress acuto, unico test di tossicità possono sottovalutare i rischi effettivi imposti da sostanze tossiche negli ambienti naturali. Si consiglia, pertanto, anche studiare gli effetti cronici e multigenerazionale di concentrazioni subletali di sostanze tossiche in un contesto ecologicamente rilevante come sostenuto dalla Commissione europea^4,5 e USEPA (Regno States Environmental Protection Agency)^6,7. Particolare nella ricerca dei vertebrati, i costi in termini di lavoro, tempo e denaro sono elevati durante l'esecuzione di studi di esposizione cronica e multigenerazionale a causa la durata relativamente lunga dei vertebrati rispetto ad organismi invertebrati marini modello. Pertanto, si consiglia di scegliere l'organismo di modello più appropriato di pesce, a seconda della domanda di ricerca. Inoltre, una vasta gamma di specie di vertebrati dovrebbe essere disponibile al fine di testare la generalità delle risposte tra le specie di essere in grado di adattare i regolamenti basati sulle specie più sensibili. Per ora, c'è la necessità di sviluppare nuovi, efficienti protocolli con specie di vertebrati modello caratterizzato da cicli di vita brevi per abbassare i costi di realizzare esposizioni croniche e multigenerazionale su vertebrati^7,8.

Il turchese killifish Nothobranchius furzeri è un interessante modello di pesce da utilizzare in tali esperimenti di esposizione a lungo termine a causa della sua breve stagionatura e ciclo di vita (tempo di generazione meno di 4 settimane⁹). Ciò significa che possono essere studiati gli endpoint ecologicamente rilevanti quali il tempo di maturazione e fecondità entro un breve lasso di tempo rispetto ad altri modelli di pesci⁷. Inoltre, questi pesci producono uova resistenti alla siccità, dormienti che rimangono vitali per diversi anni se conservato in condizioni standard, eliminando così la necessità di un continuo cultura⁹. In studi ecotossicologici, ciò implica anche che replicare pesce possono tutti essere covate nel momento esatto stesso, risultanti in sincronia di tempo per tutti gli animali, anche tra i lotti di uova prodotte in momenti diversi. Si consiglia di utilizzare il laboratorio ceppo GRZ per eseguire esperimenti di esposizione. Questo ceppo esegue bene in condizioni di laboratorio, è omozigote (ad eccezione di cromosomi sessuali) e il genoma è ben caratterizzata^10,11.

In studi ecotossicologici, è importante selezionare l'appropriato intervallo di concentrazioni di prova. Diversi metodi complementari possono essere utilizzato a tal fine. La gamma di concentrazione nominale può essere basata sulla sensibilità di una specie correlata, come ad esempio Nothobranchius guentheri¹². In alternativa, la gamma può essere basata sulla sensibilità dei modelli di pesce standard, come zebrafish (Danio rerio)² che hanno una sensibilità paragonabile alla maggior parte delle sostanze tossiche (Philippe et al. (in revisione)). In combinazione, con entrambe le opzioni, un esperimento per individuare l'intervallo dovrebbe essere condotti per selezionare l'intervallo di concentrazione nominale. Per il test acuto, i ricercatori dovrebbero mirare per trattamenti a concentrazione con 100% di mortalità, mortalità intermedi e 0% di mortalità dopo 24 h di esposizione per la sostanza tossica. Per il test cronico, si consiglia di eseguire l'esperimento per due settimane verificare se mortalità larvale nella condizione con le più alte concentrazioni di prova non superi il 10% durante questo periodo di riferimento per individuare l'intervallo.

Il protocollo può servire come base per eseguire esposizione acuta e cronica alle sostanze inquinanti a base acquosa su N. furzeri, esamina gli effetti potenziali dei fattori di stress sia a livello individuale e cellulare. Può anche essere utilizzato per eseguire la ricerca multi-fattore di sforzo per accogliere una maggiore rilevanza ecologica, mescolando diversi composti tossici o studiando gli effetti interattivi tra inquinamento e altri fattori di stress naturali (es. predazione) o antropica fattori di stress (ad es. il riscaldamento dovuto ai cambiamenti climatici).

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato etico di KULeuven.

1. cova e manutenzione generale di N. furzeri

1. Preparare pesce medio (pH 7) ad una temperatura di 14 ° C e aggiungere acqua purificata di tipo II, con aggiunto sali standardizzati, ad una conducibilità di 600 µS/cm (24 ° C).
2. Selezionare uova dalla linea laboratorio GRZ (Gona-Rhe-Zhou) che sono stati conservati in condizioni standardizzate¹³. Selezionare uova nella fase DIII (cioè pronto a schiudersi), riconoscibile dalla presenza di occhi d'oro⁹ e delicatamente trasferirli con un morbido paio di pinzette per un serbatoio di plastica 2L (non più di circa 30 uova per carro armato).
   Nota: Al fine di avere un numero sufficiente di organismi di prova sana, covare le uova due volte altretante come il numero di larve di pesci richiesto.
3. Aggiungere 1 cm del mezzo pesce a 12 ° C e lasciare che la temperatura dell'acqua convergono gradualmente a temperatura ambiente (24 ° C)⁹. Pesci si schiudono entro le prime 12 ore.
4. Dopo 24 h, nutrire le hatchlings una dose concentrata di appena schiusi Artemianauplii (per maggiori dettagli sulla frequenza e quantità di cibo, fare riferimento al protocollo di allevamento di Polačik et al 2016⁹) e aumentare la profondità di acqua a 5 cm di aggiungere il mezzo pesce.
5. Dopo 36H, nutrire le hatchlings un'altra dose concentrata di appena schiusi naupli di Artemia e aggiungere il pesce terreno per aumentare la profondità di acqua a 10 cm.
6. Incubare i contenitori del pesce in condizioni di temperatura costante (ad es. in un incubatore, clima o bagnomaria riscaldata) sotto un h 14 h:10 regime di luce: scuro.
7. Prima dell'inizio dell'esperimento, contenitori complesso pesce (senza pesce) con l'esposizione composto da riempiendole con la più alta concentrazione del mezzo di esposizione e lasciarlo tutta la notte al fine di limitare il trasferimento di sostanze tossiche per il contenitore nel reale esperimento.
8. 48 ore dopo la schiusa, selezionare larve sane capace di galleggiare per iniziare l'esperimento di esposizione. Scartare il cosiddetti pancia-cursori che erano in grado di riempire la loro vescica natatoria e conseguentemente avere un galleggiamento alterata (affondare continuamente verso il basso).

2. a breve termine dell'esposizione protocollo

Nota: I ricercatori dovrebbero mirare per almeno 20 ripetizioni (20 pesci in vasi separati) per trattamento. Oltre a un trattamento di controllo completo, un controllo solvente dovrebbe essere incluso se la soluzione di riserva del composto è preparata utilizzando un solvente. Il controllo solvente deve contenere la quantità di solvente eguagliando la concentrazione di solventi nel più alta concentrazione di esposizione.

1. Preparare i contenitori sperimentali (vasi di vetro 0,5 L) di etichettarli e riempiendole con il mezzo di esposizione appropriata (diverse concentrazioni tossico). Aggiungere il composto per ottenere la giusta concentrazione.
2. Trasferire le larve (post-schiusa 48h) individualmente ai contenitori (1 pesce per contenitore per la sorveglianza individuale).
   Nota: I pesci sono esposti individualmente per ridurre al minimo i potenziali effetti confondenti di interazione sociale quali la concorrenza per il cibo e aggressione. Tuttavia, pesce consentiti interagire visivamente in conformità agli standard etici per l'uso di animali di laboratorio.
3. Follow-up questa esposizione acuta per una durata di fino a 2 settimane. Durante quel tempo, nutrire i pesci ad libitum con naupli di Artemia due volte al giorno, 7 giorni alla settimana.
4. Aggiornare il mezzo ogni giorno per mantenere la qualità dell'acqua e per ridurre al minimo i potenziali effetti di degradazione di composti. Monitorare le variabili chiave acqua (livelli di ossigeno disciolto devono superare l'80%, conducibilità deve essere compreso tra 600 e 700 µS/cm, pH tra 7,8 e 8,2 e durezza (come CaCO₃) compreso tra 350 e 450 mg/L, che si trova all'interno della gamma di ottimale condizioni di allevamento per furzeri N. ⁹). Prelevare campioni di acqua prima e dopo l'aggiornamento il mezzo per determinare le concentrazioni di composte effettive.
5. Endpoint
   1. Controllare il pesce per la mortalità, lo stress (per esempio comportamento aberrante: nuoto a testa in giù) o malattia di tutti i giorni (mattina, sera). Consultare la pubblicazione di Shedd et al. (1999) ¹² per i dettagli sull'osservazione di mortalità, stress o malattia.
   2. Calcolare LC₅₀ valori basati sulla mortalità utilizzando curve dose-risposta (Ritz e Streibig, 2005) in diversi momenti. Utilizzare la funzione drm nel pacchetto RDC in v3.2.3 R (R Development Core Team, 2016) o simili approcci statistici.

3. cronica esposizione protocollo

Nota: Mirare a un minimo di 25 pesci/condizione all'inizio dell'esperimento, per ridurre al minimo le probabilità di un sesso sbilanciata e per ospitare la mortalità di sfondo potenziali dovuti a cause naturali (cioè. mortalità senile).

1. Da cova (vedere sezione 1)
2. Fase I (2 giorni post-schiusa-16 giorni post-schiusa)
   1. Seguire il protocollo come descritto al punto 2.1-2.4
   2. Come durante la seconda fase dell'esperimento, il medium si degrada durante tutta la settimana (nessun rinfresco, vedi sotto). Memorizzare la quantità necessaria di media per una settimana in grandi contenitori inerti al fine di consentire simile degradazione del composto.
3. Fase II (16 giorni post-schiusa-fine)
   1. Preparare 2 L sperimentale barattoli in vetro complessandosi li con il composto. Riempire i vasetti con il mezzo di esposizione corretta e aggiungere un tubo aria per aerare il vaso. Pesce di casa individualmente in questi vasi per il resto dell'esperimento. Consentire l'interazione visiva ospitare standard etici.
   2. Aggiornare il mezzo una volta a settimana. Trasferire il pesce con una rete in un nuovo vaso contenente lo stesso mezzo di esposizione. Prelevare campioni di acqua ogni giorno per tutta una settimana per monitorare la degradazione del composto in ogni trattamento di concentrazione. Calcolare una curva di degradazione per ogni trattamento se multipli fattori di sforzo sono testati (ad es. la tossicità di un composto nei regimi di temperatura diversa). Misurare i parametri abiotici (pH, temperatura, ossigeno % disciolto, conducibilità) tre volte alla settimana.
   3. Da 2 giorni post-schiusa (dph) fino a 23 dph, nutrire i pesci due volte al giorno, 7 giorni a naupli di Artemia ad libitum di settimana. Da 24 dph - 37 dph, integrare la dieta di annuncio libitumArtemia con le larve di Chironomus tritate. Da 38 dph su, nutrire i pesci due volte al giorno, 7 giorni alla settimana ad libitum congelato Chironomus larve.
4. Endpoint
   1. Controllo quotidiano pesce per mortalità, stress o malattia¹².
   2. Per determinare la crescita, misurare le dimensioni del corpo su base settimanale (dph 9 - 16 dph - 21 dph -...) trasferendo pesce ad una capsula di Petri riempito con il mezzo da loro serbatoio. Prendere le immagini di dimensioni calibrate di 4-5 del pesce dall'alto (a quota fissa) e analizzarli digitalmente utilizzando un programma di misurazione spaziale (ad es. ImageJ).
      Nota: Per pesci adulti, utilizzare una piastra Petri superiore per minimizzare lo sforzo di gestione mantenendo tutti i pesci sommersi durante tutto il processo di misura.
   3. Per maschio maturazione, ispezionare visivamente il pesce tutti i giorni per la colorazione da dph 15 in poi. Controllare le pinne per primi segni di colorazione nuziale (delle caratteristiche sessuali secondarie). Utilizzare il primo giorno in cui questo è visibile come un proxy per tempo di maturazione maschio.
   4. Coppia pesci non sessuato con maschi dello stesso gruppo di trattamento o non sperimentali maschi tre volte alla settimana da 30 dph in poi al fine di determinare il tempo di maturazione femminile (il giorno è depositato il primo uovo). Per questo, utilizzare il protocollo riproduttivo descritto in 3.4.5.
   5. Per fecondità, coppia matura femmine con maschi maturi 3 volte / settimana da dph 30 in poi, all'interno dei loro trattamenti utilizzando uno schema di attraversamento.
      1. Preparare un carro armato di deposizione delle uova (1 L) per ogni coppia, usando il mezzo di esposizione dall'acquario maschio completato con substrato di deposizione delle uova (sabbia fine < 500 µm).
      2. Trasferire il maschio e la femmina nel serbatoio di deposizione delle uova e consentire loro di deporre le uova per due ore. Ridurre al minimo di attività umana o dispersione intorno i contenitori di deposizione delle uova durante questo processo.
      3. In seguito, trasferire delicatamente pesce torna a loro contenitori originali di alloggiamento, senza inutili miscelazione dell'acqua, che sarebbe vortice le uova nel substrato di deposizione delle uova.
      4. Filtrare le uova versando il substrato di deposizione delle uova su una maglia di 500 µm. Contare le uova e trasferirli (utilizzando pinzette morbide) a umido muschio di torba in capsule di Petri^9,14.
      5. Eliminare le uova dei morte ogni giorno. Dopo una settimana, tenuta il Petri piatto con pellicola sigillante e memorizzarlo in una temperatura controllata incubatore a 28 ° C e un 14:10 h chiaro: scuro ciclo per lo sviluppo immediato alla fase DIII (cioè pronto a schiudersi dopo circa tre settimane). Per l'archiviazione a lungo termine, conservare le uova a 17 ° C in costante oscurità su cui uova immettere la fase dormiente e rimangono vitali per più anni. Quando il pesce da queste uova dormienti per esperimenti di reclutamento, trasferire le uova dormienti a condizioni di 28 ° C con 14:10 h chiaro: scuro ciclo per circa tre settimane consentire lo sviluppo alla fase di DIII.
   6. Misurare il massimo termico critico (CTmax) (una misura per prestazioni¹⁵) di pesci adulti.
      1. Utilizzare una vasca di acqua che viene riscaldata ad un tasso costante di 0,33 ° C/min e nel quale l'acqua circola continuamente. Aggiungere diversi acquari 1 L per ogni singolo pesce.
         Nota: Dati i vincoli di spazio nel bagno d'acqua, è necessario lavorare in diverse serie. Differenze di potenziale in condizioni tra serie dovrebbero tener conto durante l'esecuzione di analisi statistiche includendo 'serie' come un fattore casuale.
      2. Iniziare la prova aggiungendo i pesci nell'acquario, quando l'acqua nell'acquario ha raggiunto la temperatura di allevamento sperimentale del pesce (in genere 28 ° C). Controllo della temperatura negli acquari 1 L del bagno CTmax ogni 5 min usando un termometro digitale (scala di 0,1 ° C).
      3. Termina il processo quando il pesce non riesce a mantenere una posizione eretta dorso-ventralmente o inizia contrrre pesantemente^16,17. Misurare la temperatura nell'acquario 1 L, che è la massima temperatura critica. Trasferire il pesce torna alla sua sede sperimentale per il recupero.
   7. Misurare il peso (precisione 0,1 mg) del pesce l'ultimo giorno dell'esperimento di pacche asciutto e trasferirlo su una barca di pesatura. Nota: Tutti i pesci dovrebbero essere misurati quattro ore dopo l'ultima alimentazione per standardizzare peso di cibo nel tratto intestinale.
   8. Eutanasia il pesce utilizzando 0,1% tricaina.

4. protocollo di esposizione transgenerazionale

Nota: Per misurare transgenerazionale effetti degli inquinanti sulla N. furzeri, seguire il protocollo di esposizione cronica sopra descritto per la prima generazione.

1. Due volte alla settimana, controllare lo sviluppo delle uova prodotte (cioè la seconda generazione) conservato a 28 ° C 14:10 condizioni ciclo h chiaro: scuro controllando le capsule di Petri per embrioni nella fase DIII (Vedi Polačik et al. 2016⁹). Quando più di 50 repliche di ogni trattamento parentale sono completamente sviluppati, schiudono li seguendo il protocollo in 1.1.
2. Esporre il pesce sano, capace di galleggiare esattamente lo stesso set-up e trattamento come il pesce parentale.

Risultati

I risultati dell'esposizione acuta del N. furzeri a diverse concentrazioni di rame, calcolati come in 2.5.2, mostrano relazioni cleardose-risposta (Figura 1). C'è un aumento della mortalità con l'aumento di concentrazione tossico. LC₅₀ i valori diminuiscono nel tempo, significa che con le concentrazioni in diminuzione, più tempo passa prima di 50% dello stampo replicati. Per i risultati dettagliati sull'esposizione acuta e cronica di

Discussione

Questo lavoro descrive un nuovo saggio biologico usando Nothobranchius furzeri, un organismo modello emergente, per studiare l'individuo e gli effetti a lungo termine di sostanze tossiche e altri fattori di stress combinati. I protocolli presentati sono stati applicati correttamente per misurare la sensibilità delle specie in una matrice di sostanze tossiche (rame, cadmio, 3,4-dicloroanilina e Clorpirifos). A causa del suo ciclo di vita veloce, questo modello di vertebrati consente per la valutazione di subleta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
purified water Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastic tank	SAVIC		Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning)	Avamoplast		Always separate material for control and toxicity treatments
nets	Aqua bilzen		Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		frozen
tricaine	Sigma aldrich
petri dishes	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
tweezers	FST
500 µm mesh sieve	/		self-made
microcentrifuge tube (2ml)	BRAND		To store fish in freezer
glass vials	Sigma aldrich		For water analysis
weighing boat	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
water bath	Gilac		for Ctmax
liquid nitrogen	Air liquide
digital thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
calibrated balance	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform for camera	/		self-made
Multiparameter kit	HACH
Freezer (-80°C)	Panasonic Ultra low temperature freezer
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fysio
homogenisation buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagent	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein dye	VWR
96-well microtiter plate	Greiner Bio-one
384 microtiter plates	Greiner Bio-one
2 ml glass tubes	Fiers		For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes	VWR
homogeniser	Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer	Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako